Dio 1: Cistanche Tubulosa feniletanoidni glikozidi indukuju apoptozu ćelija hepatocelularnog karcinoma i pojačavaju antitumorski efekat
Mar 25, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Xia PhD1, i Jinyao Li, PhD1
Abstract
Cistanche tubulosa je vrsta kineske biljne medicine i ima različite biološke funkcije. Prethodne studije su to pokazaleCistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) pokazuju antitumorske efekte na različite tumorske ćelije. Međutim, antitumorski efekti CTPG-a na ćelije HepG2 i BEL-7404 hepatocelularnog karcinoma (HCC) su još uvijek neuhvatljivi. Naša studija je pokazala da CTPG značajno inhibira rast HepG2 i BEL-7404 ćelija putem indukcije zaustavljanja ćelijskog ciklusa i apoptoze, što je bilo povezano sa aktivacijom MAPK puteva koje karakteriše pojačano regulisana fosforilacija p38, JNK, i ERK1/2 i mitohondrijski ovisni put koji karakterizira smanjenje potencijala mitohondrijske membrane. Oslobađanje citokroma c i cijepanje kaspaze-3, -7, -9 i PARP naknadno su povećani CTPG tretmanom. Štaviše, CTPG je značajno potisnuo migraciju HepG2 smanjenjem nivoa matriks metaloproteinaze-2 i faktora rasta vaskularnog endotela. Zanimljivo je da CTPG ne samo da je pojačao proliferaciju splenocita već je i smanjio apoptozu splenocita izazvanu cisplatinom. U mišjem modelu tumora H22, CTPG u kombinaciji sa cisplatinom dodatno je inhibirao rast H22 ćelija i smanjio nuspojave cisplatina. Uzeti zajedno, CTPG je inhibirao rast HCC direktnim antitumorskim efektom i indirektnim efektom poboljšanja imunosti, te je poboljšao antitumorsku efikasnost cisplatina.
Ključne riječi Cistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi, apoptoza, MAPK put, put zavisan od mitohondrija, cisplatin, poboljšanje imunosti
Cistanche ima antitumorsko dejstvo.
Click to Cistanche proizvodi i Cistanches
Uvod
Predviđeno je da će rak jetre biti šesti najčešće dijagnostikovani rak i četvrti vodeći uzrok smrti od raka u svijetu u 2018. godini, sa oko 841 000 novih slučajeva i 782 000 smrtnih slučajeva godišnje u jugoistočnoj Aziji (Mongolija, Kambodža i Vijetnam) .1 U Kini je rak jetre bio treći vodeći uzrok smrti od raka u 2015.2 Više od 90 posto primarnih karcinoma jetre su hepatocelularni karcinomi (HCC) širom svijeta. Trenutno su hepatektomija, transplantacija jetre i perkutana ablacija glavne metode za liječenje HCC-a. Nažalost, ovi tretmani su efikasni za 30 posto pacijenata s dijagnozom ranog karcinoma jetre, dok pacijenti s dijagnozom uznapredovalog karcinoma jetre (koji čine 40 posto) moraju se oslanjati na palijativno liječenje kako bi produžili vrijeme preživljavanja.3,4 Sorafenib u kombinaciji s jetrenom arterijska hemoembolija je važna i uobičajena palijativna terapija za većinu pacijenata s uznapredovalim HCC u azijsko-pacifičkoj regiji.5 Sorafenib, odobren od strane FDA 2006. za liječenje uznapredovalog raka jetre, je inhibitor višestruke kinaze koji inhibira proliferaciju tumorskih stanica i vaskularne proizvodnju i potiče apoptozu tumorskih stanica. Sorafenib značajno produžava vrijeme preživljavanja pacijenata za 3 do 5 mjeseci, ali ima ozbiljne nuspojave i usko je povezan s pojavom rezistencije na lijekove.6 Stoga je hitno potrebno razviti nove lijekove ili strategije za HCC.
Tradicionalna kineska medicina (TCM) sama ili u kombinaciji s drugim strategijama korištena je za liječenje HCC i pokazala je kliničke prednosti uključujući produženo vrijeme preživljavanja, poboljšanu kvalitetu života, smanjene nuspojave i tako dalje.7,8Cistancheje TCM koji sadrži feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignin i polisaharide koji ima različite biološke funkcije, kao što su antioksidacija, protiv upale, protiv starenja, poboljšanje pamćenja i funkcije poboljšanja imuniteta.9 PhGs se smatraju kao glavne aktivne komponente Cistanchea i imaju višestruke funkcije uključujući antioksidaciju, anti-inflamaciju, anti-apoptozu, hepatoprotekciju i neuroprotekciju.{7}} Naša grupa je izvijestila daCistanchetubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) može inhibirati rast ćelija melanoma B16-F10, ćelija karcinoma jednjaka Eca-109 i ćelija HCC H22 putem ekstrinzičnih ili intrinzičnih signalnih puteva in vitro ili in vivo; osim toga, CTPG je imao imunostimulatorno djelovanje.13-15
U ovoj studiji smo istraživali antitumorski efekat i mehanizam CTPG-a na HepG2 i BEL-7404 ćelije in vitro, analizirali imunomodulatornu funkciju CTPG-a in vitro i in vivo, te dalje evaluirali terapijski učinak CTPG-a u kombinaciji s kemoterapijom. lijek cisplatin na miševima tumora HCC H22 in vivo. Otkrili smo da CTPG može inhibirati rast HepG2 i BEL-7404 ćelija putem apoptoze zavisne od mitohondrija i MAPK signalnog puta. CTPG je značajno inhibirao migraciju HepG2 ćelija smanjenjem nivoa matriksne metaloproteinaze-2 (MMP-2) i vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF). Osim toga, CTPG je promovirao proliferaciju i aktivaciju imunoloških stanica i pojačao imunitet miševa. Važno je da CTPG u kombinaciji sa cisplatinom može dalje inhibirati rast H22 ćelija in vivo i smanjiti nuspojave cisplatina.
Cistanche jača imunitet.
Materijali i metode
Životinje
Otprilike 6 do 8 sedmica stari mužjaci BALB/c, Kunming miševa i ženke miševa C57BL/6 kupljeni su od Laboratorijskog centra za životinje, Medicinskog univerziteta Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Kina) i smješteni u objektu za životinje Univerziteta Xinjiang sa sobnom temperaturom (RT) od 25±3 stepena, i 12/12 sati svetlo-tamni period.
Ćelijske linije i ćelijska kultura
Mišje H22 ćelije su kupljene od Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Kina), a ljudske HCC HepG2 i BEL-7404 ćelije su dobijene iz Ključne laboratorije za biološke resurse i genetski inženjering u Xinjiangu, Univerzitet Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Kina) i uzgajan u mediju RPMI 1640 (Gibco, SAD) ili Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) (Gibco) koji sadrži 10 posto toplinom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (MRC, Kina), 1 posto L- glutamin (100mM), 100U/mL penicilina i 100ug/mL streptomicina na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi od 5% CO2.
Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC)
Glavna jedinjenja CTPG-a (Upbio Tech Co., Ltd., Šangaj, Kina) su kvalifikovana i kvantifikovana od strane HPLC-a kao što je prethodno objavljeno.13 Korišćena je ZORBAX SB-C18 kolona (250×4.6mm; 5μm) a mobilna faza se sastojala od 0,2 posto rastvora mravlje kiseline i metanola sa gradijentom od 23 posto do 31 posto. Ukupno 10 μL uzorka je ubrizgano i detektovano na 330 nm. Za analizu komponenti CTPG-a korišteni su standardi ehinakozida i akteozida (Yuanye, Šangaj, Kina).
echinacoside
Analiza vitalnosti ćelije
Antitumorski efekti CTPG-a na HepG2 i BEL-7404 ćelije su procijenjeni korištenjem MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolijum bromid). HepG2 i BEL-7404 ćelije su postavljene u 96-jažice (5 × 104 ćelije/jažicu) i tretirane sa 0, 200, 400, odnosno 600 ug/mL CTPG za 24 odnosno 48 sati, nakon 24 sata inkubacije na 37 stepeni. Oko 35 ug/mL cisplatina (Yuanye) korišteno je kao pozitivna kontrola. Zatim je 100 μL MTT (0,5 mg/mL, razblaženo medijumom bez FBS medijuma) dodato u svaku jažicu i kultivisano 3 sata na 37 stepeni i 5 procenata CO2. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane na 1200 rpm tokom 7 minuta, medijum je uklonjen i 200 ug/mL DMSO je dodato u svaku jažicu da bi se rastvorili formirani kristali formazana. Vrijednosti OD490 su izmjerene pomoću 96-čitača mikroploča (Bio-Rad Laboratories, Kalifornija, SAD). Da bi se procijenili efekti CTPG-a na splenocite, ćelije su izolovane iz C57BL/6 miševa i postavljene u 96-ploče sa gustinom od 1 × 105 ćelija/jažici. Splenociti su tretirani sa 0, 200, 400 i 600 ug/mL tokom 24, 48 i 72 sata, respektivno. Vijabilnost ćelije je izračunata prema sledećoj formuli: Vijabilnost ćelije ( procenat )=(OD tretirano/OD netretirano) × 100 procenata.
Otkrivanje Ki-67
Detekcija Ki{0}} je urađena prema našoj prethodnoj studiji.16 Ukratko, BEL-7404 ćelije su tretirane različitim koncentracijama (0, 200, 400 i 600 ug/mL) CTPG-a ili cisplatin (35 ug/mL). Nakon 24 sata, ćelije su sakupljene i isprane PBS, zatim fiksirane i permeabilizirane Foxp3 setom pufera za bojenje (eBioscience, SAD) prema uputama proizvođača. Intracelularno bojenje je izvedeno korištenjem FITC konjugovanog Ki-67 antitijela (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur, Kalifornija, SAD).
Analiza ćelijske apoptoze i ćelijskog ciklusa
HepG2 i BEL-7404 ćelije su zasijane u gustini od 2,5×105 ćelija/posuda i inkubirane na 37 stepeni preko noći. Ćelije su tripsinizirane i sakupljene centrifugiranjem nakon tretmana različitim koncentracijama CTPG-a ili prethodno tretirane inhibitorom kaspaze (Z-VAD-FMK) ili inhibitorom kaspaze-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kina) 2 sata prije CTPG tretman. Nakon 24 sata, apoptoza je otkrivena protočnom citometrijom. Ukratko, sakupljene ćelije su isprane hladnim PBS (Gibco) i resuspendirane u puferu za vezivanje aneksina sa 2,5 μL Annexin V-FITC i 5 μL PI-PE rastvora za bojenje (Solarbio, Peking, Kina), a zatim su ćelije inkubirane na sobnoj temperaturi. u mraku 15 minuta. Za analizu distribucije ćelijskog ciklusa, ćelije su sakupljene nakon CTPG tretmana i fiksirane u hladnom 70-postotnom etanolu na 4 stepena tokom 30 minuta. Ćelije su obojene PI (BD Biosciences) u mraku 30 minuta. Uzorci su analizirani protočnim citometrom (BD FACSCalibur). Nivoi ekspresije ćelijske apoptoze i proteina vezanih za ciklus detektovani su Western blotom.
Western Blot
Western blot je urađen prema našoj prethodnoj studiji. 17HCC su tretirani CTPG-om 24 sata. Nakon dva puta ispiranja ledeno hladnim PBS-om, sve adherentne i plutajuće ćelije su sakupljene i lizirane u RIPA liznom puferu (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 20minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 12000rpm 4 stepena u trajanju od 10 minuta, koncentracija proteina je određena korištenjem kompleta za ispitivanje bicinhoninske kiseline (Thermo Fisher Scientific, SAD) prema uputama proizvođača. Ista koncentracija proteina je odvojena sa 12 posto SDS-PAGE i prebačena na PVDF membrane. Nakon ispiranja sa PBST puferom (PBS sa 0,05% Tween-20), membrane su blokirane sa 5% nemasnog mlijeka na 37 stepeni u trajanju od 1 sata, a zatim inkubirane sa primarnim antitijelima (Cell Signaling Technology, MA, USA) u odgovarajućim razblaženjima preko noći na 4 stepena. Nakon 3 puta ispiranja sa PBST, membrana je inkubirana sa odgovarajućim HRP-konjugiranim sekundarnim antitelima (eBioscience) 2 sata na 37 stepeni. Ciljni proteini su detektovani korišćenjem kompleta za ispitivanje ECL (Beyotime). Podaci skeniranja u nijansama sive su dobijeni od strane Image J.
Analiza potencijala mitohondrijske membrane (Δψm)
Δψm je određen membranski propustljivom JC-1 bojom (Beyotime). Ukratko, ćelije HepG2 i BEL-7404 tretirane su različitim koncentracijama CTPG-a (0, 200, 400 i 600 ug/mL) tokom 24 sata. Sve ćelije su sakupljene i isprane JC-1 puferom za ispiranje. Ćelije su obojene JC{10}} fluorescentnom sondom prema uputstvu proizvođača 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dva puta ispiranja sa PBS, svi uzorci su analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 Bojenje
Bojenje Hoechst-om 33342 urađeno je prema našoj prethodnoj studiji.16 Morfološke promjene jezgara ispitivane su primjenom membransko-propusne DNK-vezujuće boje Hoechst 33342 (Beyotime). Ukratko, ćelije su inokulirane u ploču sa 6-jažicom u koncentraciji od 1×105 ćelija/jažici u 2mL medijuma. Kada se dosegne 70 do 80 posto konfluencije, ćelije su tretirane sa 200, 400 i 600 ug/mL CTPG-a ili cisplatina tokom 24 sata. Ćelije su isprane sa PBS i fiksirane sa 4 procenta ledeno hladnog paraformaldehida na 4 stepena tokom 10 minuta. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su obojene Hoechst 33342 na 4 stepena 10 minuta. Uzorci su posmatrani fluorescentnim invertnim mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).
ekstrakt cistanche
Migration Assay
Migracija HCC ćelija otkrivena je testom zarastanja rana. Ukratko, HepG2 ćelije (2×104/bunarić) su zasijane u ploču sa 24-jažicom. Nakon postizanja 80 posto konfluencije, centar svake jažice je jednom izgreban vrhom pipete od 20 μL. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su tretirane cisplatinom (35 ug/mL) ili različitim koncentracijama (0, 200, 400 i 600 ug/mL) CTPG na 37 stepeni. Nakon 24 sata, slike svakog uzorka su snimljene pod mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E). Prosječne udaljenosti migracije ćelija analizirane su slikom J. Procenat zarastanja rane izračunat je jednadžbom: zacjeljivanje rane ( posto )=(1-područje ogrebotine u naznačenom vremenu/područje ogrebotine na 0 sati)×100 posto . Nivoi ekspresije proteina MMP-2 i VEGF vezanih za migraciju ćelija detektovani su Western blotom.
Proliferacija i apoptoza splenocita
Za analizu proliferacije, splenociti su izolovani iz 3 miša C57BL/6 i obojeni CFSE (eBioscience). CFSE označene ćelije su inokulirane u 24-jažice gustine 2 × 106 ćelija u 1 mL medijuma po jažici i tretirane različitim koncentracijama CTPG-a (200, 400 i 600 ug/mL) ili kombinovane sa 35 ug /mL cisplatina tokom 72 sata. Analiza protočne citometrije je izvršena nakon bojenja sa CD3-APC i CD19-PE (BD Biosciences). Za analizu apoptoze, splenociti su inokulirani u 24-jažice gustine 2 × 106 ćelija u 1 mL medijuma po jažici i tretirani različitim koncentracijama CTPG-a (200, 400 i 600 ug/mL) ili u kombinaciji sa cisplatin tokom 24 sata. Analiza protočne citometrije izvršena je nakon bojenja sa 2,5 μL Annexin V-FITC i 5 μL PI-PE rastvora.
Procjena sigurnosti i imunostimulacijske aktivnosti CTPG-a in vivo
Za procjenu in vivo imunostimulacijskih aktivnosti CTPG-a, mužjaci Kunming miševa od 6 do 8 sedmica su nasumično podijeljeni u 7 grupa (5 miševa po grupi). Subkutana injekcija (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitonealna injekcija (ip, 200, 400 mg/kg) i intragastrična primjena (ig, 200, 400 mg/kg) primijenjena su svaka 2 dana ukupno 7 puta. , dok kontrolna grupa nije primala nikakav tretman. Miševi su vagani svaki drugi dan i svaki dan je posmatran status miševa. Nakon CTPG tretmana, organi miševa su odvojeni i izvagani. Indeksi organa su izračunati prema formuli: indeks organa=masa organa (mg)/tjelesna težina (g). Splenociti su sakupljeni, izbrojani i obojeni anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC ili anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Uzorci su detektovani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Antitumorska efikasnost CTPG-a u kombinaciji sa cisplatinom kod miševa koji nose tumor H22. Otprilike 6 do 8 sedmica starih mužjaka BALB/c miševa su supkutano ubrizgane sa H22 ćelijama (1.0 × 106 po mišu u 100 μL PBS). Kada je zapremina tumora dostigla približno 60 mm3, miševi sa tumorom su nasumično podijeljeni u 4 grupe (6 miševa/grupi) i tretirani cisplatinom (4mg/kg), CTPG (400mg/kg), cisplatinom (4mg/kg) plus CTPG ( 400 mg/kg) ili bez tretmana (kontrolna grupa). Tumorskim miševima je intraperitonealno ubrizgan CTPG 5., 7., 9., 11. i 13. dana. Cisplatin je intravenozno ubrizgan 7. i 11. dana. Volumen tumora i tjelesna težina mjereni su svaki drugi dan. Volumen tumora izračunat je na sljedeći način: Volumen tumora (V)=a × b2/2, u kojem a i b predstavljaju najduži i najkraći promjer tumora mjeren noniusom, respektivno. Dvadesetog dana izolovani su i izmereni organi i tumori. Splenociti su sakupljeni, izbrojani i obojeni anti-CD3-APC i anti-CD19-PE ili anti-CD4-FITC i anti-CD8-APC ili anti-CD11b-PE i anti-Gr-1-APC ili anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC i anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Nakon toga, frekvencije i broj ćelija analizirani su protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Cistanche pojačava antitumorsko djelovanje i poboljšava imunitet.
Za više informacija kliknite na sliku.
Statistička analiza
Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost±standardna greška srednje vrijednosti (SEM). Statistička analiza je provedena korištenjem jednosmjerne/dvosmjerne analize varijanse (ANOVA) korištenjem softvera Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">
