1. dio Hemijska i genetska diskriminacija Cistanches Herba na osnovu UPLC-QTOF/MS i DNK barkodiranja
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Abstract
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), poznat kao "pustinjski ginseng", ima zapanjujuće ljekovito djelovanje na snagu i ishranu, posebno na jačanje bubrega za jačanje janga. Međutim, dva biljnog porijekla Cistanches Herba, Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa, razlikuju se u pogledu farmakološkog djelovanja i hemijskih komponenti. Da bi se razlikovalo biljno porijeklo Cistanches Herba, kombinovani hemijski i genetski sistem metoda – UPLC-QTOF/MS tehnologija i DNK barkodiranje – prvo je korišten u ovoj studiji. Rezultati su pokazali da su tri potencijalna jedinjenja markera (izomer kampneozida II, cistanozida C i cistanozida A) dobijena kako bi se razlikovala dva porijekla PCA i OPLS-DA analizama. DNK barkodiranje omogućilo je precizno razlikovanje dva porijekla. NJ stablo je pokazalo da su dva porijekla grupirana u dvije klade. Naši nalazi pokazuju da dva porijekla Cistanches Herba imaju različite hemijske sastave i genetske varijacije. Ovo je prva prijavljena procjena dva porijekla Cistanches Herba, a nalaz će olakšati kontrolu kvaliteta i njegovu kliničku primjenu.
Uvod
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), poznat kao „pustinjski ginseng“, potiče od osušenih sočnih stabljikaCistanche deserticolaYC Ma andCistanche tubulosa(Schrenk) Perika prema Kineskoj farmakopeji (izdanje 2010.), a popularna je zbog toga što tonizira bubreg-yin, koristi životnoj suštini i opušta crijeva. trenutno,Cistanches Herbauglavnom je rasprostranjen u sušnim i toplim pustinjama na sjeverozapadu Kine, posebno u provincijama Xinjiang i Unutrašnja Mongolija. Međutim, dva porijekla odCistanches Herbarazlikuju se po farmakološkoj aktivnosti i hemijskim komponentama. Tu et al. istraživao odvar od tri vrste Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) i pronašao toC. tubulosapokazao najmanji efekat u modelu miša s nedostatkom Janga [1]. Zhang et al. usporedila farmakološku aktivnost izmeđuC. deserticola, C. tubulosa,iC. salsa,i otkrili da ove vrste imaju medicinske funkcije kao što su otpornost na umor i hipoksiju, ali ne u istoj mjeri [2]. Prethodna istraživanja su objavila hemijsku komponentu i ukazala na razliku između hemijske komponente i sadržaja za biljno porekloCistanches Herba[3]. Što se tiče kliničke primjene i tržišnog prometa, kao tonik,C. tubulosatradicionalno se koristio kao sredstvo za podsticanje cirkulacije i u liječenju impotencije, steriliteta, lumbaga, tjelesne slabosti u Japanu [4–8]. Shodno tome, od velikog je značaja razlikovati dva poreklaCistanches Herbaza kontrolu kvaliteta i kliničku primenu. Međutim, ne postoji istraživački fokus na diskriminaciju dva porijeklaCistanches Herba. Mnoge istraživane metode, uključujući mikroskopiju, ultraljubičastu i infracrvenu detekciju, metodu ponavljanja međujednostavnih sekvenci korištene su za identifikaciju rodaCistanches, ali ne samo za dva porijekla, posebno [9–20]. Ovdje smo zajedno koristili kemijske i molekularne tehnike kako bismo razlikovali dva porijekla Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (tečna hromatografija ultra-performanse u kombinaciji sa kvadrupolnom masenom spektrometrijom vremena leta) i DNK barkodiranje. UPLC-QTOF/MS pruža informacije brže i efikasnije u poređenju sa drugim tehnikama. Visoka selektivnost i osjetljivost UPLC-QTOF/MS dovela je do njegove primjene i za kvantitativne i kvalitativne analize, kao i za analizu metabolita i identifikaciju kompleksnih spojeva u tradicionalnoj kineskoj medicini [21–22]. Analiza glavnih komponenti (PCA) i ortogonalna projekcija na latentnu strukturnu diskriminantnu analizu (OPLSDA) su također razvijene za identifikaciju potencijalnih jedinjenja markera. DNK barkodiranje, lakša i univerzalnija tehnologija molekularnih markera, koristi fragment DNK za identifikaciju vrsta ili rodova. Objektivan je, precizniji i lakši za izvođenje od tradicionalnih metoda identifikacije i drugih tehnologija molekularnih markera. Štaviše, DNK barkodiranje je uspješno primijenjeno za identifikaciju životinja i biljaka, uključujući ljekovite biljke [23-26]. Svrha ovog istraživanja je uspostavljanje sistema naučnih metoda, kombinovanog UPLC-QTOF/MS i DNK bar kodiranja, za diskriminaciju dva biljnog poreklaCistanches Herba.
Cistancira cijele korijene
Materijali i metode
Etička izjava Potvrđujemo da terenske studije nisu uključivale ugrožene ili zaštićene vrste. GPS koordinate su uključene u informacije o uzorku, pogledajte tabelu 1."
Biljni materijali i reagensi
Sočne stabljike Cistanches Herba sakupljene su u divljim pustinjskim regijama u Unutrašnjoj Mongoliji, provincijama Qinghai, autonomnoj regiji Xinjiang Uygur, Narodnoj Republici Kini (Tabela 1) u maju 2012. Svi uzorci istraživanja prikupljeni su u divljim pustinjskim regijama, ne na privatnom zemljištu, gdje nisu bile potrebne posebne dozvole. Botanički identitet stabljika potvrdio je dr. Linfang Huang. Uzorci vaučera deponovani su u Institut za razvoj ljekovitog bilja. Za UPLC analizu korišćeni su acetonitril visoke performanse tečne hromatografije (HPLC) (Merck KGaA, Darmstadt, Nemačka) i mravlja kiselina (Tedia, SAD). Dejonizovana voda je prečišćena korišćenjem Milli-Q sistema (Millipore, Bedford, MA, SAD). Sve ostale hemikalije su bile analitičke kvalitete.
Priprema uzorka
Uzorci Cistanches Herba (1.0 g, 65-mesh) prebačeni su u konusnu tikvicu od 50-mL i dodano je 50 mL 70 posto metanola. Nakon namakanja od 30 min, ultrazvučna obrada (35 kHz) je izvedena na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon centrifugiranja na 10,000 o/min tokom 10 min, supernatant je pohranjen na 4uC i filtriran kroz 022-mm membranu prije ubrizgavanja u UPLC-QTOF/MS sistem za analizu.
UPLC-QTOF/MS
Za UPLC analizu korišćeni su sledeći sistemi/parametri: Waters Acquity sistem (Waters) opremljen binarnom pumpom za isporuku rastvarača, auto-samplerom i PDA detektorom povezanim sa stanicom za podatke Waters Empower 2; ultrazvuk (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Kina); i model elektronske analitičke bilance AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Cirih, Švicarska). Korištene su kolone Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 mm, 2,16100 mm, Waters) i Waters C18 zaštitne kolone (isti materijal, voda) koje su održavane na 30uC. Mobilna faza je bila 0,1 postotni vodeni rastvor mravlje kiseline (A) i acetonitril (B) sa programom gradijenta kako slijedi: 0–3 min, 10–22 posto B; 3–4 min, 22–23 posto B; 4–6 min, 23–35 posto B; 6–8 min, 35–37 posto B; 8–11 min, 37–42 posto B; 11–12 min, 42–48 posto B; 12–15 min, 48 posto –50 posto B pri brzini protoka od 0,3 mL/min. Zapremina injekcije bila je 5 mL.
UPLC/MS analiza je izvedena na QTOF Synapt G2 HDMS sistemu (Waters, Manchester, UK) opremljenom izvorom elektrosprej jonizacije (ESI) koji radi u režimu negativnih jona. N2 je korišten kao gas za desolvataciju. Temperatura desolvatacije je postavljena na 45{{10}}uC pri brzini protoka od 800 L/h, a temperatura izvora je postavljena na 120uC. Napon kapilare i konusa postavljeni su na 2500 i 40 V, respektivno. Podaci su prikupljeni između 50-1200 Da sa vremenom skeniranja od 0.1-s i 0.01-s međuscan kašnjenjem tokom 15-min vremena analize. Argon je korišćen kao kolizioni gas pri pritisku od 7,06661023 Pa. Svi MS podaci su prikupljeni korišćenjem LockSpray sistema kako bi se osigurala tačnost mase i ponovljivost. [MH]- jon leucin-enkefalina na m/z 554.2615 korišten je kao blokada mase u negativnom ESI modu.
Analiza podataka
UPLC-QTOF/MS podaci za uzorke Cistanches Herba analizirani su da bi se identifikovale potencijalne diskriminantne varijable. Pronalaženje pikova, usklađivanje i filtriranje ES neobrađenih podataka je izvršeno pomoću Marker Lynx aplikacija menadžera, verzija 4.1 (Waters, Man chester, UK). Korišteni parametri su sljedeći: vrijeme zadržavanja (tR) od 0–15 min, masa 50–1200 Da, tolerancija vremena zadržavanja od 0,02 min i tolerancija mase od 0,02 Da. Korištena su tri replika uzorka prikupljena sa svake geografske lokacije (n=3). Za kreiranje modela korišteno je ukupno 6.339 varijabli.
DNK barkodiranje: ekstrakcija DNK, PCR amplifikacija i sekvenciranje
Uzorci uzeti sa osušenih mesnatih stabljika C. deserticola i C. tubulosa (30 mg) trljani su 2 minute na frekvenciji od 30 r/s. DNK je ekstrahovan prema uputstvima proizvođača (Tiangen). Konkretno, protokol je izmijenjen tako da je hloroform zamijenjen mješavinom hloroforma: izoamil alkohola (24:1 u istoj zapremini) i puferskog rastvora GP2 sa izopropanolom (iste zapremine). Utrljani prah je stavljen u ependorfove epruvete od 1,5 ml, dodato je 700 mL 65uC prethodno zagrejanog GP1 i 1 mL b-merkaptoetanola da se meša pomoću vorteksa 10-20 s, i inkubirano 60 minuta na 65uC; Dodavanje 700 mL mješavine hloroforma: izoamil alkohola (24:1), centrifugiranje 5 minuta na 12000 o/min (,134006g); Odpipetirajte supernatant u novu epruvetu, dodajući 700 mL izopropanola, miješajući 15-20 minuta; Svu smjesu ubaciti u centrifugirnu kolonu CB3 i centrifugirati 40 s na 12000 o/min; Odbaciti filtrat i dodati 500 mL GD (dodavanje kvantitativnog bezvodnog etanola prije upotrebe), centrifugirati na 12000 o/min 40 s; odbacivanje filtrata i dodavanje 700 mL PW (dodavanje kvantitativnog bezvodnog etanola prije upotrebe) za pranje membrane, centrifugiranje 40 s na 12000 rpm; Odbaciti filtrat i dodati 500 mL PW, centrifugirati 40 s na 12000 rpm; Odbacivanje filtrata i centrifugiranje 2 minute na 12000 o/min da bi se uklonio preostali pufer za ispiranje PW; Prebacivanje centrifuge CB3 u čistu ependorf epruvetu od 1,5 ml i sušenje na sobnoj temperaturi 3-5 minuta; Centrifugirajte 2 minute na 12000 o/min da dobijete ukupnu DNK. Prajmeri za lančanu reakciju polimeraze (PCR) su bazirani na sekvencama koje su ranije objavljene [4,5]. PCR reakcijske smjese su sadržavale 2-mL DNK šablona, 8.5- mL ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Kina), 1/{{57 }}mL prajmera naprijed/nazad (F/R) (2,5 mM), u konačnoj zapremini od 25 mL. PCR amplifikacija je provedena kako su opisali Kress et al. [4]. Prajmer PCR reakcije su bili prednji PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) i rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). PCR proizvodi su razdvojeni i detektovani elektroforezom u 1% agaroznom gelu. PCR proizvodi su pročišćeni prema protokolu proizvođača i direktno podvrgnuti sekvenciranju.
Glavno djelotvorno jedinjenje cistanchea: Acteoside
Rezultati
Probna dodjela pikova pomoću UPLC-QTOF/MS Reprezentativni hromatogrami C. deserticola i C. tubulosa iz različitih proizvodnih područja prikazani su na Slici 1. Kromatogram otiska prsta pokazao je sličnosti među uzorcima Cistanches Herba. Detektovano je ukupno 23 kvalifikovanih pikova mase i 16 pikova je identifikovano upoređivanjem vremena zadržavanja i masenih spektra sa onima koji su prethodno prijavljeni (Tablica 2) [29–35]. Vrhovi 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 i 23 su uslovno identificirani kao cistanozid F, musaenozidna kiselina, cistanbulozid C1/C2, kampneozid II , izomer kampneozida II, ehinakozid, cistanozid A, akteozid, izoakteozid, siringalid A-39-aL-ramnopiranozid, cistanozid C, 29-acetilakteozid, osmantuzid B, cistanozid D, cistanozid A i tubulozid B, . Utvrđeno je da su hemijski sastojci prvenstveno feniletanoidni glikozidi (PhG), dok je jedno jedinjenje, musaenozidna kiselina, bio iridoidni polisaharid. PhG su glavna aktivna jedinjenja u liječenju nedostatka bubrega, te antioksidativno i neuroprotektivno djelovanje [36]
PCA C. deserticola i C. tubulosa
PCA je korišten za razlikovanje uzoraka različitih biljnih vrsta. PCA je nenadzirana metoda multivarijantne analize podataka koja ima za cilj vizualizaciju sličnosti i/ili razlika unutar multivarijantnih podataka sastava sekundarnog metabolita [37]. Dvokomponentni PCA model kumulativno je činio 46,04 posto varijacije (PC1, 36,43 posto; PC2, 9,61 posto). Slika 2 pokazuje da su 24 uzorka grupirana u dvije grupe u PCA rezultatu ucrtanim prema porijeklu vrste, što ukazuje da se hemijski sastav C. deserticola i C. tubulosa značajno razlikuje.
Glavno djelotvorno jedinjenje cistanchea: ehinakozid
