Dio 1:Akteozid djeluje protiv interleukina-1 -indukovanih kataboličkih procesa kroz modulaciju proteinskih kinaza aktiviranih mitogenom i NFκB ćelijskog signalnog puta

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang

Osteoartritis (OA) je najčešća degenerativna bolest zglobova s kroničnim bolom u zglobovima uzrokovana progresivnom degeneracijom zglobne hrskavice na sinovijalnim zglobovima.Acteoside, kafeoilfeniletanoidni glikozid, ima različite biološke aktivnosti kao što su antimikrobni, protuupalni, antikancerogeni, antioksidativni, citoprotektivni i neuroprotektivni efekti. Nadalje, oralna primjenaacteosidepri visokim dozama ne izaziva genotoksičnost. Stoga je cilj ove studije provjeriti antikataboličke efekteacteosideprotiv osteoartritisa i njegovog antikataboličkog signalnog puta.Acteosidenije smanjio vitalnost ćelija L929 mišjih fibroblasta koje se koriste kao normalne ćelije i primarni hondrociti štakora.Acteosidesuzbija gubitak proteoglikana izazvanog IL-1 -u hondrocitima i zglobnoj hrskavici potiskivanjem ekspresije i aktivacije enzima koji razgrađuje hrskavicu kao što je matriksna metaloproteinaza- (MMP-) 13, MMP-1 i MMP{ {6}}. Nadalje, akteozid je potisnuo ekspresiju inflamatornih medijatora kao što su inducibilna sintaza dušikovog oksida, ciklooksigenaza-2, dušikov oksid i prostaglandin E2 u primarnim hondrocitima pacova tretiranim IL-1. Nakon toga, ekspresija proinflamatornih citokina je smanjena akteozidom u primarnim hondrocitima pacova tretiranim IL-1. Štaviše, akteozid je potisnuo ne samo fosforilaciju protein kinaza aktiviranih mitogenom u primarnim hondrocitima pacova tretiranim IL-1, već i translokaciju NFκB iz citosola u jezgro kroz supresiju njegove fosforilacije. Oralna primjena 5 i 10 mg/kg akteozida ublažila je progresivnu degeneraciju zglobne hrskavice na mišjem modelu s osteoartritisom nastalu destabilizacijom medijalnog meniskusa. Naši nalazi ukazuju na toacteosideje obećavajući potencijalni antikatabolički agens ili dodatak za ublažavanje ili sprječavanje progresivne degeneracije zglobne hrskavice.

cistanche-acteoside

cistanhe-akteozid

1. Uvod

Osteoartritis (OA) je najčešća degenerativna bolest zglobova s kroničnim bolom u zglobovima uzrokovana progresivnom degeneracijom zglobne hrskavice na sinovijalnim zglobovima [1]. Zbog produženja životnog vijeka, prevalencija OA s gubitkom pokretljivosti i kroničnim bolom u zglobovima uzrokovanim progresivnom degeneracijom zglobne hrskavice na sinovijalnim zglobovima procjenjuje se na 18 posto kod žena nakon menopauze i 9,6 posto kod muškaraca [2]. ]. Iako se prevalencija OA širom svijeta povećava iz godine u godinu, patofiziološka etiologija OA je još uvijek nepoznata. Može biti uzrokovano vrlo složenim i multifaktorskim faktorima rizika kao što su starenje, spol, genetsko naslijeđe, traumatske ozljede zgloba i teško mehaničko opterećenje zglobova. Nadalje, neuropatološki odnosi između progresivne degeneracije zglobne hrskavice i razvoja kroničnog bola u zglobovima su nepoznati [3]. Stoga je cilj kliničkog upravljanja pacijentima s OA održavanje pokretljivosti tijela i mehaničke funkcije zglobova kroz ublažavanje kroničnog bola u zglobovima, korištenjem farmakoloških i nefarmakoloških pristupa i operacije zamjene zgloba. Potreba za razvojem efikasne intervencije ili suplementacije, sa dugotrajnom biološkom bezbednošću, za prevenciju ili ublažavanje OA za održavanje kvaliteta života kroz održavanje mehaničke funkcije zglobova u starijoj populaciji je sve veća.

Kao što je prikazano na slici 1, akteozid (CAS br. 61276-17-3; C29H36O15) je kafeoilfeniletanoidni glikozid izolovan iz nekoliko biljnih biljaka kao što su Verbascum chlorides [4], Buddleja globosa [5] i Plantago australis [6]. Akteozid ima različite biološke aktivnosti kao što su antimikrobno [5], protuupalno [7], antikancerogeno [8], antioksidativno [9], citoprotektivno [9] i neuroprotektivno djelovanje [10]. Nadalje, oralna primjena akteozida u visokim dozama ne uzrokuje genotoksičnost [11].

Stoga smo pretpostavili da akteozid sa antiinflamatornom biološkom sigurnošću ima antikataboličke efekte povezane sa zaštitom zglobne hrskavice od progresivne degeneracije zglobne hrskavice kroz supresiju kataboličkih faktora kao što su proinflamatorni citokini, inflamatorna medijatorna sinteza i inflamatorna karcinoma zglobova. . Stoga je cilj ove studije bio istražiti antikataboličke efekte izazvane akteozidima i njihov ćelijski signalni put, kako in vitro, koristeći primarne hondrocite izolovane iz zglobne hrskavice koljenskog zgloba pacova, tako i in vivo, koristeći OA životinjski model generiran hirurškim destabilizacija medijalnog meniskusa u zglobu koljena kod miševa.

cistanche-acteoside

acteoside fromcistanche

2. Metode

2.1. Cell Culture. Primarni hondrociti štakora izolovani su iz zglobne hrskavice kolenskih zglobova pacova (5-dan; Sprague-Dawley) u skladu sa protokolom (CIA-CUC2019-A0027) odobrenim od strane Instituta Odbor za negu i upotrebu životinja Univerziteta Chosun, Gwangju, Republika Koreja. Izolovani primarni hondrociti štakora održavani su u Dulbecco-ovoj modifikovanoj orlovom medijumu/hranjivoj mešavini F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientiﬁc, Rockford, IL, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) (FBS) , Grand Island, NY, SAD), antibiotici (50U/mL penicilina i 50ug/mL streptomicina) i 50ug/mL askorbinske kiseline. Normalna ćelijska linija mišjeg fibroblasta L-929 kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC). Prema uputama koje je dao ATCC, L-929 ćelije su uzgajane u Eagleovom minimalnom esencijalnom mediju, koji sadrži 10 posto FBS, i uzgajane su u vlažnom inkubatoru na 37 stepeni sa 5 posto CO2.

2.2. Test vitalnosti ćelija. Analiza dimetil tiazolil difeniltetrazolijeve soli (MTT) je izvedena za procjenu vitalnosti ćelija L929 ćelijske linije mišjih fibroblasta koje se koriste kao normalne ćelije i primarnih hondrocita pacova tretiranih akteozidom. Ukratko, ćelije L929 i primarni hondrociti štakora su kultivisani pri gustini ćelija od 8×105 ćelija/mL na pločama za kulturu tokom 24 sata, a zatim tretirani sa 2,5, 5, 10, 25, 50 i 100 μM akteozida tokom 24 sata. Nakon tretmana sa MTT rastvorom, i ćelije L929 i hondrociti su dalje kultivisani tokom 4 sata. Nakon inkubacije, formirani MTT kristali su potpuno suspendirani u dimetil sulfoksidu i mjerena apsorpcija na 570 nm pomoću spektrometra (Epoch mikroploča spektrofotometar, BioTek®, Winooski, VT, USA) za procjenu vitalnosti ćelije.

2.3. Cell Live/Dead Assay. Preživljavanje ćelija je izvedeno korišćenjem kompleta za ispitivanje Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), koji se sastoji od zelenog kalceina-AM za obeležavanje živih ćelija (sa zelenom fluorescencijom) i etidijum homodimera-1 za obeležavanje mrtvih ćelije (sa crvenom fluorescencijom). Ukratko, i L929 ćelije i primarni hondrociti štakora su kultivisani pri gustini ćelija od 8×105 ćelija/mL na stakalcima (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ sistem; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) tokom 24 sata, a zatim tretirani sa 50 i 100 μM akteozida tokom 24 sata. Nakon kultivacije, izvršena je analiza preživljavanja stanica prema uputama proizvođača. Nakon toga, obojene ćelije su snimljene pomoću fluorescentnog mikroskopa (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Dimetilmetilensko plavo (DMMB) Test. DMMB analiza je izvršena za procjenu promjene sadržaja proteoglikana u primarnim hondrocitima štakora tretiranih akteozidom 21 dan u prisustvu ili odsustvu IL-1. Da bi se održale karakteristike primarnih kondrocita štakora 21 dan, primarni kondrociti štakora (2×106 ćelija) su suspendovani u 1 mL 1,2 posto alginata, a zatim kapsulirani kapanjem suspenzije ćelija/alginata u rastvor od 105 mM CaCl2. Primarni kondrociti štakora inkapsulirani u alginatu kultivirani su 24 sata u DMEM/F12 (sadrže 10 posto FBS, 50 U/mL penicilina, 50 ug/mL streptomicina i 50 ug/mL askorbinske kiseline), a zatim su prilagođeni za EM 24 h 1 posto u DMEM2 mini-insulin–transferin–selen (mini-ITS) i 50 ug/mL askorbinske kiseline. Nakon toga, hondrociti su tretirani sa 50 ili 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 1ng/mL IL-1 tokom 21 dana. 21. dana, primarni hondrociti štakora su sakupljeni za procjenu sadržaja proteoglikana pomoću DMMB testa, kao što je prethodno opisano [12]. Pored toga, da bi se kvantifikovao sadržaj proteoglikana po ćeliji i procenila proliferacija primarnih hondrocita štakora, broj ćelija je meren DNK testom korišćenjem PicoGreen-a (Molecular Probes, Carlsbad, CA), prema uputstvima proizvođača.

2.5. Ex vivo organska kultura tkiva zglobne hrskavice pacova. Tkiva zglobne hrskavice su izolovana iz zglobova koljena 5-dnevnih Sprague-Dawley pacova i potom uzgajana u DMEM/F12 sa dodatkom 10 posto FBS. Zatim, zglobna hrskavica

uzorci su tretirani sa 100 μM akteozida uprisustvo ili odsustvo 10ng/mL IL-1 tokom 7 dana. Na kraju perioda kulture, uzorci su sakupljeni i fiksirani u 4 posto paraformaldehida tokom 72 sata za histološku analizu.

2.6. Histološka analiza. Histološka analiza korištenjem safranina-O i brzog zelenog bojenja izvršena je kako bi se potvrdio gubitak proteoglikana u zglobnoj hrskavici tretiranoj sa 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1 tokom 7 dana. Ukratko, ﬁksirani uzorci zglobne hrskavice su dekalcificirani u etilendiamintetrasirćetnoj kiselini i zatim ugrađeni u parafin. Nakon toga, pripremljeni parafinski blokovi koji sadrže zglobnu hrskavicu su serijski rezani na debljinu od 5 μm i stavljeni na stakalce. Safranin-O i brzo zeleno bojenje su naknadno izvedeni da bi se procijenio gubitak proteoglikana u temeljnoj tvari zglobne hrskavice. Osim toga, obavljeno je bojenje hematoksilinom i eozinom kako bi se promatrala opća morfologija zglobne hrskavice.

2.7. Western blotting. Western blotting je urađen da se ispita ekspresija kataboličkih faktora uključujući MMP-13, MMP-1, MMP-3, inducibilnu sintazu azot oksida (iNOS) i ciklooksigenazu-2 (COX -2) i izmjena ćelijskih signalnih molekula kao što su protein kinaze aktivirane mitogenom i nuklearni faktor-kapa B (NFκB). Ukratko, primarni hondrociti pacova su tretirani sa 50 ili 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1 tokom 24 sata. Nakon toga, primarni hondrociti štakora su sakupljeni centrifugiranjem i lizirani pomoću pufera za lizu (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD) prema uputstvima proizvođača. Pored toga, da bi se potvrdila nuklearna translokacija NFκB, primarni hondrociti pacova su tretirani sa 50 ili 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1 tokom 24 sata. Nakon toga, citosolne i nuklearne frakcije su ekstrahovane upotrebom NE-PER™ nuklearnih i citoplazmatskih ekstrakcijskih reagenasa (Thermo Scientiﬁ, Rockford, IL, SAD) prema uputstvima proizvođača. Koncentracija ukupnog proteina ekstrahovanog iz primarnih hondrocita štakora određena je upotrebom kompleta za analizu proteina bicinhoninske kiseline (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) prema uputstvima proizvođača. Osim toga, sakupljen je kondicionirani medij kako bi se otkrili nivoi enzima koji razgrađuju hrskavicu izlučenih iz hondrocita. Jednake količine proteina i kondicioniranog medija podvrgnute su elektroforezi na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE), a zatim prebačene na nitrocelulozne membrane. Nakon toga je obavljen western blot korištenjem ciljanih primarnih antitijela protiv MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phosphoERK1/2, total-ERK1 /2, phosphop38, total-p38, phosphor JNK, total JNK, phosphoNFκB, ukupni NFκB, - aktin i lamin B. Imunoreaktivne trake su vizualizovane korišćenjem poboljšanog hemiluminiscentnog sistema (Thermo Scientiﬁc, USA) prema . uputstvo proizvođača, a zatim snimljeno Microchemi uređajem (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Izrael).

2.8. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze (qPCR) i kvantitativna PCR u realnom vremenu (qRT-PCR). Primarni hondrociti štakora tretirani su sa 50 ili 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1 tokom 24 sata. Nakon toga, ukupna RNK je izolirana iz primarnih hondrocita štakora korištenjem TRIzol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača. Ukupna koncentracija RNK mjerena je pomoću NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, SAD). Da bi se sintetizovala cDNK, 1 ug RNK je reverzno transkribovan korišćenjem ThermoScript reverzne transkripcije-PCR sistema (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema uputstvima proizvođača. qPCR cDNK je izveden upotrebom 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seul, Republika Koreja) i specifičnih prajmera na TaKaRa PCR Thermal Cycler uređaju (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan). Nakon toga, PCR proizvodi su podvrgnuti elektroforezi na agaroznom gelu da bi se odredio nivo ekspresije ciljnih gena. Gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) je korištena kao endogena kontrola. Pored toga, za qRT-PCR, cDNK je umnožen korišćenjem Eco™ PCR sistema u realnom vremenu (illumine Inc., San Diego, Kalifornija, SAD). -Aktin je korišten kao endogena kontrola. Sekvence prajmera korišćenih u qPCR i qRT-PCR rezimirane su u tabelama 1 i 2, respektivno.

cistanche (akteozid) korist: poboljšanje imuniteta

3. Rezultati

3.1. Akteozid ne utiče na vitalnost ćelija L929 i primarnih hondrocita štakora. Ćelijska linija mišjeg fibroblasta L929 korišćena kao normalne ćelije tretirana je sa 2,5, 5, 10, 25, 50 i 100 μM akteozida tokom 24 sata. Nakon toga, izvršen je MTT test za procjenu citotoksičnosti akteozida na L929 ćelije. Kao što je prikazano na slici 2(a), utvrđeno je da relativna vitalnost ćelija L929 iznosi 94:8±8 procenata, 93:6±7 procenata, 100 ± 5 procenata, 103:9± 5 procenata, 126:1±8 procenata , i 122:7±4 procenta pri 2,5, 5, 10, 25, 50 i 100 μM akteozida, respektivno, u poređenju sa kontrolom (100:02 ± 3 procenta). Nadalje, da bi se potvrdila citotoksičnost akteozida na primarnim hondrocitima štakora, MTT test je izveden kao što je prikazano na slici 2(b). Vibilnosti primarnih hondrocita pacova tretiranih sa 2,5, 5, 10, 25, 50 i 100 μM akteozida su određene kao 114 ± 4 procenta, 117:8 ± 6 procenata, 123:9 ± 5 procenata, 132:6±4 procenata, 153:1±7 procenata, odnosno 142:1±6 procenata, u poređenju sa kontrolom (100:4±5 procenata). Nadalje, da bi se potvrdio učinak akteozida na održivost i L929 ćelija i primarnih hondrocita štakora, izveden je test Cell Live/Dead kao što je prikazano na slici 2(c). Broj mrtvih ćelija obojenih kao crvena fluorescencija nije se povećao za ćelije L929 i primarne hondrocite štakora tretirane sa 50 i 100 μM akteozida tokom 24 sata. Ovi podaci su dosledno pokazali da definisana doza akteozida nije uticala na održivost ćelija L929 i primarnih hondrocita štakora. Dakle, 50 μM akteozid i 100 μM akteozid, koji su netoksične doze u ćelijama L929 i primarnim hondrocitima štakora, korišteni su za provjeru njegovih antikataboličkih učinaka in vitro studija korištenjem primarnih kondrocita štakora.

3.2. Acteoside suzbija gubitak proteoglikana izazvan IL-1 -u primarnim hondrocitima pacova. Primarni hondrociti štakora ugrađeni u zrnca alginata tretirani su sa 50 i 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 1ng/mL IL- 1 tokom 21 dana. Nakon toga je izveden DMMB test da bi se procijenila promjena sadržaja proteoglikana kao što je prikazano na slici 3(a). Relativni sadržaj proteoglikana je određen kao 88:3±18:1 procenat i 86:8±16:3 procenata u primarnim hondrocitima pacova tretiranim sa 50 odnosno 100 μM akteozida, u poređenju sa kontrolom (103:8±). 32:3 posto). Iako je relativni sadržaj proteoglikana smanjen akteozidom, ovi rezultati nisu bili značajni. Međutim, relativni sadržaj proteoglikana značajno se smanjio za 37:1±14:7% u primarnim hondrocitima štakora tretiranim sa 1ng/mL IL-1, ali 50 i 100μM akteozida značajno smanjuju sadržaj proteoglikana za 127: procenat i 64 ± 14:5 procenata, respektivno, u prisustvu 1ng/mL IL-1. Nakon toga, da bi se provjerilo da li akteozid potiskuje gubitak proteoglikana izazvan IL-1 -, zglobna hrskavica secirana iz zglobova koljena pacova tretirana je sa 100μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10ng/mL IL-1 tokom 7 dana. Nakon toga, izvršene su histološke procjene koristeći H&E bojenje i safranin-O i brzo zeleno bojenje kao što je prikazano na slici 3(b). Morfološka promjena nije uočena korištenjem H&E bojenja; međutim, safranin-O i brzo zeleno bojenje otkrili su da se proteoglikan obojen crvenom bojom nije promijenio u zglobnim hrskavicama tretiranim sa 100 μM akteozida u usporedbi s onim u kontroli. Međutim, ozbiljan gubitak proteoglikana izazvan je 10ng/mLIL-1 u zglobnoj hrskavici, a 100μM akteozida je značajno potisnuo gubitak proteoglikana u zglobnoj hrskavici tretiranoj sa 10ng/mL IL{52}}. Zajedno, ovi podaci dosljedno pokazuju da akteozid ima antikatabolički učinak koji usporava degeneraciju zglobne hrskavice kroz suprotstavljanje IL-1 -induciranom gubitku proteoglikana.

3.3. Acteoside ima antikatabolički efekat koji potiskuje ekspresiju i aktivaciju MMP u primarnim hondrocitima pacova tretiranim IL-1. Da bi se ispitalo da li je antikatabolički efekat izazvan akteozidom povezan sa supresijom ekspresije i aktivacije MMP, primarni hondrociti štakora su tretirani sa 50 i 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1 tokom 24 sata. Nakon toga su istražene promjene u MMP. Kao što je prikazano na slici 4(a), iako je ekspresija enzima koji razgrađuju hrskavicu kao što su MMP-13, MMP-1 i MMP-3 značajno povećana u kondicioniranoj podlozi primarnog štakora hondrociti tretirani sa 10ng/mL IL-1, smanjio ga je akteozid na način ovisan o dozi. Nadalje, rezultati oba qPCR (slika 4(b)) i qRT-PCR (slika 4(c)) otkrili su da IL-1 značajno povećava nivoe mRNA MMP-a kao što su MMP-13, MMP{ {22}} i MMP-3 u primarnim hondrocitima pacova. Međutim, smanjili su se ovisno o dozi u primarnim hondrocitima štakoratretirani sa 50 i 100 μM akteozidom. Štaviše, 50 i 100 μM akteozid je efikasno potisnuo aktivaciju MMP u primarnim hondrocitima štakora tretiranim sa 10 ng/mL IL-1 (Slika 4(d)). Uzeti zajedno, ovi podaci dosljedno ukazuju da akteozid ima antikatabolički učinak koji potiskuje ekspresiju i aktivaciju enzima koji razgrađuju hrskavicu.

3.4. Akteozid potiskuje ekspresiju i proizvodnju IL1 -indukovanih kataboličkih inflamatornih medijatora i proinflamatornih citokina u primarnim hondrocitima pacova. Da bi se utvrdilo da li akteozid ima preventivni učinak na OA, primarni hondrociti štakora su tretirani sa 50 i 100 μM akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1 tokom 24 sata. Nakon toga, istražene su promjene u inflamatornim medijatorima, reprezentativnim kataboličkim faktorima kao što su iNOS, COX-2 i PGE2. Nivoi mRNA iNOS, COX-2 i PTGS-2 su značajno povećani za IL-1 u primarnim hondrocitima pacova.

Međutim, oni su se smanjivali ovisno o dozi u primarnim hondrocitima štakora tretiranih akteozidom (Slika 5(a)). Nadalje, akteozid ne samo da je potisnuo ekspresiju iNOS i COX-2 u primarnim hondrocitima štakora tretiranim IL-1 (Slika 5(b)) već je također značajno smanjio relativnu proizvodnju NO i PGE2 kao što je prikazano na slikama 5(c) i 5(d), respektivno. Ovi podaci sugeriraju da akteozid potiskuje ekspresiju proinflamatornih citokina izazvanih medijatorima upale koji djeluju kao katabolički faktori da induciraju progresivnu degeneraciju zglobne hrskavice. Stoga, da bi se istražila ekspresiona promjena proinflamatornih citokina od strane 50 μM akteozida u primarnim hondrocitima štakora tretiranih sa 10 ng/mL IL- 1, izveden je niz citokina kao što je prikazano na slici 6. hemoatraktant- (CINC-) 2, CINC-3, cilijarni neurotrofni faktor (CNTF), fraktalkin (CX3CL1), IL-1 , IL- 1 , leptin, protein kemoatraktant monocita{{22} } (MCP-1), inflamatorni protein makrofaga- (MIP-) 3 i -nervfaktor rasta (NGF) u primarnim hondrocitima štakora tretiranih IL-1 u poređenju sa samo IL-1. Uzeti zajedno, ovi podaci dosljedno sugeriraju da akteozid sprječava progresivnu degeneraciju zglobne hrskavice supresijom inflamatornih medijatora i proinflamatornih citokina protiv IL{2}}indukovanih kataboličkih efekata u primarnim hondrocitima štakora.

3.5. Akteozid potiskuje fosforilaciju MAPK i NFκB u primarnim hondrocitima pacova tretiranim IL-1. Da bi se istražili ćelijski signalni putevi povezani sa antikataboličkim efektima izazvanim akteozidima protiv proinflamatornih citokinskih IL-1 promjena MAPK i NFκB, primarni hondrociti štakora tretirani su s 50 i 100 μM IL-a u prisustvu acteo{8 }} tokom 24h. Nakon toga, ukupni protein je ekstrahovan i podvrgnut elektroforezi na SDS-PAGE gelu da bi se izvršio western blot. Kao što je prikazano na slici 7, MAPK kao što su ERK1/2, p38 i JNK bili su značajno fosforilirani u primarnim hondrocitima pacova tretiranim IL-1, dok 50 i 100 μM akteozida nije značajno inducirao MAPK fosfor u poređenju sa kontrola u primarnim hondrocitima štakora. Međutim, 50 i 100 μM akteozida, ovisno o dozi, potisnuli su IL-1 -indukovanu MAPK fosforilaciju u primarnim hondrocitima pacova. Nadalje, fosforilacija NFκB u primarnim hondrocitima pacova tretiranih sa 10 ng/mL IL-1 postepeno je smanjena akteozidom na način ovisan o dozi. Ovi podaci ukazuju da su MAPK i NFκB ćelijski signalni putevi usko povezani sa antikataboličkim efektima izazvanim akteozidima protiv IL-1 u primarnim hondrocitima štakora.

3.6. Akteozid potiskuje translokaciju NFκB iz citosola u jezgro kroz supresiju IL-1 -indukovane fosforilacije NFκB u primarnim hondrocitima pacova. Da bi se istražilo da li akteozid potiskuje translokaciju NFκB iz citosola u jezgro, primarni hondrociti pacova su tretirani sa 50 i 100 ug/mL akteozida u prisustvu ili odsustvu 10 ng/mL IL-1. Kao što je prikazano na slici 8(a), NFκB je značajno translociran u jezgro iz citosola primarnih hondrocita pacova tretiranih sa 10ng/mL IL-1. Međutim, akteozid ga je značajno inhibirao na način ovisan o dozi. Nadalje, iako je nivo NFκB povećan u nuklearnoj frakciji ekstrahiranoj iz primarnih hondrocita štakora tretiranih sa 10 ng/mL IL-1, akteozid je dozno-zavisno snizio nivo kao što je prikazano na slici 8(b). Nivo NFκB je smanjen u citosolnoj frakciji ekstrahovanoj iz primarnih hondrocita štakora tretiranih sa 10 ng/mL IL-1, ali je dozno-zavisno povećan akteozidom. Uzeti zajedno, ovi podaci dosljedno ukazuju da su antikatabolički efekti izazvani akteozidima protiv IL-1 uključeni u supresiju translokacije iz citosola u jezgro na modulaciju NFκB signalnog puta u primarnim hondrocitima štakora.

3.7. Acteoside ublažava progresivnu degeneraciju zglobne hrskavice kod OA životinja izazvanih kirurškim DMM-om koljenskog zgloba. Da bi se razjasnili antikatabolički efekti izazvani akteozidima in vivo, životinje izazvane OA generiranim kirurškim DMM-om izvedenim na kolenskom zglobu BALB/c miševa oralno su davane 5 i 1{14}}mg/kg akteozida rastvorenog u 5 posto etanola svaki drugi dan tokom 8 sedmica. Nakon toga, zglobovi koljena su histološki procijenjeni korištenjem safranina-O i brzog zelenog bojenja kao što je prikazano na slici 9. Gubitak proteoglikana i ozljeda površine zglobne hrskavice značajno su povećani u zglobu koljena seciranom od DMM-indukovanih OA životinja. Međutim, oralna primjena akteozida potisnula je gubitak proteoglikana i manje ozljede zglobne hrskavice u usporedbi samo sa nosačem. Štaviše, Mankinov rezultat je značajno povećan u grupi životinja sa OA (n =5, 3± 0:7) samo vozilom u poređenju sa Naivnim (n =5, 0 :67 ± 0:5). Međutim, oralna primjena 5 i 10mg/kg akteozida u grupi životinja sa OA (n =5) smanjila je ocjenu Mankin za 2±0:7 i 1:67 ± 0:5 , odnosno u poređenju samo sa vozilom. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da oralna primjena akteozida ublažava progresivnu degeneraciju zglobne hrskavice u sinovijalnim zglobovima s kataboličkim stanjima.