U ovoj studiji, galaktan egzopolisaharid (EPS) izCistancheKR780676 je procijenjen zbog svog potencijala daublažavaju oksidativni streskoristeći in vitro testove i in vivo studije, saccharomyces cerevisiae (divlji tip) i njegovantioksidans(sod14, sod24, tsa14, cta2 i ctt12)anti-apoptotički(pep4 i fs14) iprotiv starenja(sod24, tsa1 i ctt12)) mutanti za izogenu deleciju gena. Galaktan je pokazao jak DPPH iaktivnost uklanjanja dušikovog oksidasa lCso vrijednošću od 450 i 138 ug/mL respektivno. U modelu mutanta kvasca, oksidativni stres generiran od strane H,0. je ekstenzivno uklonjen galaktanom u mediju, što je potvrđeno korištenjem spot testova praćenih fluorescentnim DCF-DA bojenjem i mikroskopskim studijama. Tretman galaktanom je rezultirao smanjenjem ROS-a stvorenog u mutantnim stanicama kvasca, što je pokazano smanjenim intenzitetom fluorescencije. Nadalje, galaktan je pokazao zaštitu od oksidativnog oštećenja putem H,O, -inducirane inhibicije apoptoze u mutantnim sojevima kvasca (pep4 i fs1), što je dovelo do povećane stope preživljavanja neutralizacijom oksidativnog stresa. U testu hronološkog životnog vijeka, WT ćelije tretirane galaktanomEPS pokazale su povećanje vitalnosti za 8 posto, dok je mutant sod2 pokazao povećanje od 10-15 posto, što ukazuje na izražene efekte protiv starenja. Galactan iz W. confuse KR780676 ima ogroman potencijal da se koristi kao prirodni antioksidans za nutraceutske, farmaceutske i prehrambene tehnološke primjene. Prema našim saznanjima, ovo je prvi izvještaj o dubinskoj procjeni in vivo antioksidativnih svojstava abakterijskog EPS-a u sistemu modela delecije kvasca.

Kliknite da biste Cistanche obogatili EPS

Oksidacija je neophodan proces za održavanje bioloških procesa, kao i za proizvodnju energije u svim živim organizmima. Radikali reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) i reaktivnih azotnih vrsta (RNS) nastaju normalnim katabolizmom kiseonika i molekula azota. Ozbiljni oksidativni stres dovodi do različitih degenerativnih stanja kao što su oštećenje DNK, ćelijska degeneracija i karcinogeneza. To može rezultirati mnogim zdravstvenim oštećenjima kao što sustarenje, kardiovaskularne bolesti, rak, ciroza, ateroskleroza, dijabetesi reumatoidnog artritisa2-6, antioksidansi su molekuli koji uklanjaju slobodne radikale stvorene u hrani ili živom sistemu i dovode do prevencije zdravstvenih stanja povezanih s oksidativnim oštećenjem-9. Iako su mnogi sintetički antioksidansi dostupni kao jaki čistači radikala, neki od njih su povezani s nekim neželjenim nuspojavama. S obzirom na to, došlo je do povećanog interesa i potražnje za prirodnim antioksidansima u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji. Većina polisaharida na bazi biljaka i gljiva prijavljeni su kao značajni zaštitni agensi protiv ROS11-21. Različiti mikrobni egzopolisaharidi (EPS), uključujući bakterije mliječne kiseline (LAB), također su prijavljeni zbog svojih značajnih antioksidativnih svojstava. Oni se smatraju sigurnijim alternativama sintetičkim. Posljednjih godina, mnogi EPS iz LAB-a su proučavani zbog njihovog antioksidativnog potencijala i prevencije oksidativnih oštećenja22,23. Antioksidativni potencijal i zaštitna uloga Weissella EPS-a su također prijavljeni iz raznih EPS-a izolovanih iz Weissella mnogih sojeva kao što su Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 i W. cibaria SJ1424–29. Antioksidativna svojstva in vivo mogu se proučavati korištenjem različitih modela sistema kao što su ćelijske linije30, C. elegans31, kvasac32 i miševi33. Ranije su razna jedinjenja testirana na njihova potencijalna antioksidativna svojstva korišćenjem sistema modela mutanta gena kvasca Saccharomyces cerevisiae delecije32,34-37.

Ova studija je fokusirana naantioksidativni potencijal galaktan EPSproizveden od probiotičkog soja Cistanche KR780676 iz indijske tradicionalne fermentirane hrane (Idli tijesto)38,39. U ovom radu, galaktan EPS testiran je na in vitro antioksidativni potencijal pomoću DPPH, azotnog oksida i hidroksilnih radikala i in vivo antioksidansa,anti-apoptotičkiisvojstva protiv starenjakoristeći mutantni model za deleciju gena kvasca.

materijali i metode

Sve hemikalije, uključujući dodatke za medije, nabavljene su od Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., Indija, i DCF-DA (2,7 dihlorodihidrofuorescein diacetat) iz Sigme.

Mikrobna kultura.CistancheKR780676 izoliran iz indijske kisele fermentirane hrane (Idli tijesto), za koju se navodi da proizvodi galaktan EPS, korišten je u ovoj studiji 38.

Detekcija proizvodnje EPS-a. Proizvodnja EPS-a W. confusa posmatrana je sa nivoa kolonije. Ukratko, soj je kultivisan na MRS agaru (sa dodatkom 2 procenta saharoze). Nakon 48 h na 30 stepeni uočena je pojava sluzavih kolonija. Proizvodnja galaktanskog EPS-a dalje je potvrđena analizom skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM).

Ekstrakcija EPS-a. Proces ekstrakcije EPS-a izveden je po metodi opisanoj u Kavitake et al.38. Svježi inokulum (10 posto) W. confusa je dodan u 2 posto MRS mediju sa pojačanom saharozom na 30 stepeni tokom 48 sati u statičkim uslovima. Suspenzija je na ovaj način centrifugirana (12,000×g 15 min) da se izoluje biomasa i dalje tretirana trihlor kiselinom da bi se eliminisali proteinski dijelovi. Galaktan-EPS je precipitiran korištenjem ledeno hladnog etanola (trostruki volumen), centrifugiran (19,200×g tokom 15 minuta) i rezultirajući EPS je otopljen u Milli-Q vodi. Sirovi EPS je dijaliziran na 12-14 kDa (48 h, 4 stepena) i sušen zamrzavanjem liofilizacijom 48 h.

In vitro antioksidativna svojstva galaktan EPS. DPPH test za galaktan izveden je prema ranijem izvještaju Ye et al.9, a procenat aktivnosti čišćenja (procent) je izračunat prema sljedećoj jednadžbi.

gdje je Ao i As apsorbanca kontrole (prazno, bez EPS) i uzorka, respektivno. Analiza uklanjanja radikala dušikovog oksida (NO) za galaktan izvedena je prema Sreejayan et al.40 i izračunata prema sljedećoj jednadžbi,

gde je Ao apsorbanca kontrole (prazno, bez EPS) i As je apsorbanca u prisustvu EPS. Aktivnost smanjenja snage mjerena je za galaktan EPS kao što su objavili Ye et al.9. Te apsorbanca očitana je na 700 nm, a redukcijski potencijal je označen visokim kapacitetom apsorpcije reakcione smjese. Kao pozitivna kontrola korištena je askorbinska kiselina (Vc). Aktivnost uklanjanja hidroksilnih radikala galaktan EPS procijenjena je kako su opisali Yang et al.41. Te apsorbancija je očitana na 536 nm i postotak uklanjanja je izračunat na sljedeći način:

gdje je uzorak apsorbancija uzorka, slijepa proba je apsorbancija u odsustvu uzorka i otopine H2O2, a kontrola je apsorbancija u odsustvu uzorka

In vivo antioksidativna svojstva galaktan EPS u mutantnim sojevima kvasca.

Sojevi kvasca, S. cerevisiae, divljeg tipa (WT) BY4741 (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) i mutantnih sojeva za deleciju gena nabavljeni su od Thermo Fisher Scientifica, SAD. Sojevi kvasca uzgajani su u mediju pepton dekstroze (YPD) sa ili bez 200 µg/mL geneticina (G418 sulfata) za selekciju mutanata. YPD čvrsta podloga je pripremljena dodavanjem 2 posto Bacto agara u YPD tečnu podlogu42.

Utjecaj EPS-a na rast kvasca. Eksponencijalno rastuća kultura divljeg tipa kvasca (WT) (približno 1×104 ćelije) tretirana je različitim koncentracijama (0-400 ug/mL) EPS-a u mikrojažici i konačna zapremina je napravljena do 200 μL sa YPD bujonom. Kultura je inkubirana 18 h na 30 stepeni, nakon čega je uslijedilo serijsko razrjeđivanje i širenje na YPD agar ploče. Ploče su inkubirane na 30 stepeni tokom 2 dana, a jedinice koje formiraju kolonije (CFU) su izbrojane i vitalnost je izražena kao procenat CFU43.

Mjerenje biomarkera oksidativnog stresa. Eksponencijalno rastuće WT ćelije kvasca prethodno su tretirane sa ili bez 300 ug/ml EPS-a tokom 2 h. Deset ćelija je izloženo 1 mM H2O2 tokom 1 h na 30 stepeni u šejker inkubatoru i obrađeno za merenje aktivnosti SOD i nivoa peroksidacije lipida prema metodi opisanoj u ranijim izveštajima44-46

Antioksidativno svojstvo EPS-a u mutantima za deleciju gena S. cerevisiae.

Eksponencijalno rastuće kulture kvasca WT i mutantnih sojeva s nedostatkom antioksidansa (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ i yhb1∆) tretirane su s 300 ug/mL EPS-a nakon izloženosti 1 mM H2O2 tokom 1 h. Serijski razblažene ćelije su raspoređene na YPD agar ploče, inkubirane 2 dana na 30 stepeni i izračunata je vitalnost. Za spot test, kulture su serijski razrijeđene u 10- naborima, od kojih je 4 μL uočeno na YPD agar ploče i inkubirano na 30 stepeni 2 dana i fotografirano43,47. Detekcija i mjerenje ROS. Eksponencijalno rastući WT i mutantni sojevi sa nedostatkom antioksidansa (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ i ctt1∆) su prethodno tretirani sa ili bez EPS-a 2 h i izloženi 1 mM H2O2 1 h na 30 stepeni. Ćelijske pelete nakon centrifugiranja na 5000 rpm u trajanju od 5 minuta su dva puta isprane PBS puferom, ponovo suspendovane u 200 μL PBS-a i inkubirane sa 20 μM DCF-DA u mraku 15-20 minuta na sobnoj temperaturi. Odmah nakon inkubacije, ćelije su dva puta isprane PBS-om, postavljene na stakalca i posmatrane pod Olympus Ix71 fluorescentnim mikroskopom pod 40×objektivom koristeći plavi filter. Za kvantifikaciju ROS-a, ćelije obojene DCF DA su resuspendovane u 200 μL PBS-a nakon ispiranja i mjeren je intenzitet DCF fluorescencije pomoću spektrofluorometra na maksimumu ekscitacije i talasnim dužinama emisije od 495/529 nm. Fluorescentne jedinice su ucrtane u odnosu na svaku tretiranu i netretiranu kulturu i upoređene48,49.

Anti-apoptotička aktivnost galaktana.

Spot i CFU testovi. Eksponencijalno rastuće ćelije WT i anti-apoptotic-deficijentnih mutantnih ćelija (pep4∆ i fs1∆) su prethodno tretirane EPS-om i inkubirane zajedno sa odgovarajućim netretiranim kontrolama 2 h. Za broj CFU, kulture su tretirane ili neobrađene EPS-om 2 h i inkubirane sa 0.5 mM H2O2 1 h. Svaka serijski razrijeđena kultura je raspoređena na YPD agar ploče i inkubirana na 30 stepeni 2 dana, a vitalnost ćelija je predstavljena kao postotak CFU. Za spot test, kulture su dozvoljene za serijsko razrjeđivanje nakon čega je slijedilo uočavanje na YPD agar pločama sa ili bez 1 mM H2O2. Ploče su inkubirane na 30 stepeni 2 dana i fotografisane47.

Detekcija anti-apoptotičkog markera EPS-a

korištenjem mutantnih sojeva kvasca. Da bi se dodatno potvrdilo djelovanje EPS-a na stanice kvasca od apoptotske smrti stanica izazvane vodikovim peroksidom u kvascu, ispitivani su mutantni sojevi WT i anti-apoptotički deficitarni (pep4∆ i fs1∆) na markere apoptoze. Eksponencijalno rastuće ćelije WT, pep4∆ i fs1∆ tretirane su ili netretirane sa 300 µg/mL EPS tokom 2 h, a zatim su bile izložene 1 mM H2O2 tokom 1 h. I tretirane i netretirane ćelije su obojene akridin narandžastom i etidijum bromidom (AO/EB) i posmatrane pod fluorescentnim mikroskopom radi kondenzacije hromatina50,51. Za bojenje DAPI, tretirane i netretirane ćelije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida i inkubirane sa 1 ug/mL DAPI 5-10 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Ćelije su montirane na stakalca nakon ispiranja sa PBS i posmatrane pod Olympus IX71 fluorescentnim mikroskopom (UV filter, 40× objektiv) radi nuklearne fragmentacije52,53.

Efekat protiv starenja EPS-a hronološkim testom životnog veka.

Kulture divljeg tipa kvasca i mutanta sa nedostatkom antioksidansa (sod2∆, tsa1∆ i ctt1∆) uzgajane su da dostignu stacionarnu fazu i inkubirane sa ili bez EPS-a za analizu hronološkog životnog vijeka (CLS). Preživljavanje svakog soja izračunata je u različitim vremenskim intervalima od 0 do 30 dana. Vijabilnost ćelija izražena je kao procenat CFU i za tretirane i za netretirane kulture54,55. Statistička analiza. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka (±SD) i statistički analizirani korištenjem IBM SPSS 20 softvera u jednosmjernom ANOVA modelu. Tukeyjev test poređenja HSD (str<0.05) was used to measure the significance level. 

Rezultati i diskusija Bakterije mliječne kiseline (LAB) izolirane iz fermentirane hrane privukle su ogromnu pažnju prehrambenih tehnologa u posljednjih nekoliko godina zbog svojih dokazanih probiotičkih svojstava. Među bakterijama izoliranim iz indijske fermentirane hrane su Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. i manje istražene Weisella spp. Kao i drugi korisni LAB-i, soj Cistanche KR780676 koji je izolovan iz fermentiranog idli tijesta u našoj laboratoriji je navodno djelovao kao potencijalni kandidat za probiotike39. Raniji izvještaji, ovaj galaktan je okarakteriziran kao linearni homopolisaharid i također je testiran zbog njegovih fizičko-hemijskih, funkcionalnih i emulgirajućih svojstava38,56-58. Također smo izvijestili da su ćelije i ćelijski supernatanti W. confusa KR780676 pokazali snažnu antioksidativnu aktivnost39. Proizvodnja EPS-a iz W. confusa KR780676 uočena je na MRS agar ploči obogaćenoj sa 2 posto saharoze, inkubiranoj 48 h (slika 1A-i), što je otkrilo Weissella ljigave kolonije i dalje je potvrđeno na SEM slici (kolonije Weissella) pokazujući prisustvo galaktan EPS zajedno sa ćelijama (slika 1A-ii). Proizvodnja EPS-a korak po korak je prikazana slikovnim prikazom na slici 1B.

In vitro antioksidativna svojstva galaktan EPS. Kao što je prikazano na slici 2A, primećeno je da aktivnost čišćenja DPPH zavisi od koncentracije, a aktivnost čišćenja se povećava sa koncentracijom galaktana. Polumaksimalna efektivna koncentracija (IC50) askorbinske kiseline bila je 8,8 µg/mL, dok je galaktan EPS bio 450 µg/mL. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) je stabilan slobodni radikal koji delokalizira nesparene elektrone u odnosu na molekul kao cjelinu, čime se sprječava dimerizacija molekula i rezultira tamnoljubičastom bojom59. Kada se DPPH otopini doda različitim koncentracijama (50 do 500 µg/mL) galaktana, to dovodi do smanjenja ljubičaste boje kako koncentracija raste. Antioksidansi kada reaguju sa elektronom DPPH, tamnoljubičasta boja DPPH prelazi u svetloljubičastu boju; a intenzitet boje zavisi od antioksidativne aktivnosti supstrata60. Galaktan je pokazao 60 posto potencijala uklanjanja DPPH koji je veći od EPS-a iz endofitske bakterije Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Dušikov oksid nastaje kada se natrijum nitroprusid razgradi u vodenoj otopini pri pH od 7,2. Nitrati i nitrit nastaju u aerobnim uvjetima kada se dušikov oksid veže s kisikom61. Kao što je prikazano na slici 2B, galaktan ima potencijal da smanji stvaranje dušikovog oksida iz natrijum nitroprusida jer je polovina maksimalne efektivne koncentracije (IC50) 138 µg/mL, dok je standardna askorbinska kiselina bila 11 µg/mL. Kao što je prikazano na slici 2C, aktivnost redukcije snage EPS-a je u pozitivnoj korelaciji sa njegovom koncentracijom u rastućem redosledu. Standard (askorbinska kiselina) pokazao je veći redukcijski kapacitet od galaktan EPS-a što je bilo u saglasnosti sa Ye et al.9. Aktivnost smanjenja snage galaktana ukazuje na potencijalnu antioksidativnu aktivnost. Kada se kalij-fericijanid [K3Fe (CN)6] doda u galaktan EPS, antioksidansi prisutni u njemu se redukuju u kalij-fericijanid [K4Fe(CN)6]

Slika 2. In vitro antioksidativna svojstva galaktana. (A) aktivnost uklanjanja radikala DPPH, (B) analiza dušikovog oksida, (C) analiza smanjenja snage i (D) aktivnost uklanjanja hidroksilnih radikala galaktan EPS.

Aktivnost galaktana uklanjanja hidroksilnih radikala prikazana je na slici 2D. Galaktan je pokazao 41,93 posto kao najveću aktivnost, dok je standardno 58,10 posto pri istoj koncentraciji (1 mg/mL). Trend rezultata je u skladu sa prethodnim izvještajima za EPS iz Lactobacillus plantarum C88 (85,21 posto za koncentraciju EPS-a od 4 mg/ml)62 i Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 posto za koncentraciju EPS-a od 1 mg/ml)63. U poređenju sa standardima, galaktan je pokazao efikasnost od 72,16 posto, dok je EPS iz Lactobacillus plantarum C8862 i Paenibacillus polymyxa EJS-363 pokazao efikasnost 95,19 odnosno 68,55 posto.

In vivo antioksidativna svojstva galaktan EPS u modelu kvasca. Raniji izvještaji su pokazali različita biološka svojstva koja promovišu zdravlje, kao što su antiproliferativno, antičir, snižavanje kolesterola, antioksidativno, protuupalno i imunomodulatorno djelovanje EPS-a izvedenog iz LAB64. U tom pogledu, postaje važno detaljno procijeniti antioksidativni učinak EPS-a koji bi mogao podržati njihov prebiotički i/ili probiotički potencijal, uglavnom za održavanje homeostaze crijeva ublažavanjem oksidativnog stresa. Stanični antioksidans igra ključnu ulogu u ublažavanju neizbježnog ROS-a koji nastaje kroz ključne metaboličke puteve stanica. Neravnoteža između urođene antioksidativne odbrane ćelije i generisanog ROS-a može biti veoma štetna za ćelije. Ozbiljni oksidativni stres uzrokuje potencijalno oštećenje ćelijskih vitalnih komponenti, proteina, nukleinskih kiselina i molekula lipida što zauzvrat utječe na mnoge bitne signalne puteve i inducira apoptozu. Pokazalo se da unos antioksidansa hranom smanjuje učestalost markera ćelijskog oštećenja kao što su nivoi ROS-a, oštećenje DNK posredovano ROS-om, apoptoza i ćelijska transformacija što dalje rezultira smanjenom učestalošću poremećaja povezanih sa starenjem65 Mikrobni EPS kao što su ksantan i levan su pokazali antioksidativnu aktivnost u in vitro testovima (DPPH i testovi hidroksilnih radikala)5 i protiv humanih ćelija raka želuca BGC-823, respektivno66. Prethodno, u ovoj studiji, procijenili smo antioksidativne, antiapoptotičke i antiaging efekte koje ima galaktan EPS izolovan iz W. confusa KR780676 koristeći kvasac Saccharomyces cerevisiae BY4741 kao model organizma.

Utjecaj EPS-a na rast kvasca. Stanice kvasca divljeg tipa tretirane različitim koncentracijama EPS-a nisu pokazale nikakve defekte u rastu što potvrđuje da galaktan nije inducirao nikakvu citotoksičnost ili defekte rasta u bilo kojoj od koncentracija u rasponu od 0 do 400 ug/mL (slika 3A ). Ćelije tretirane sa 300 ug/mL ili većom koncentracijom galaktana pokazale su značajno veći rast što ukazuje da je galaktan imao aktivnost stimulacije rasta kvasca.

Koncentracija galaktana od 300 ug/mL se koristi za naknadne eksperimente sa sojevima kvasca. Galaktan smanjuje aktivnost enzima SOD. Nakon snažne in vitro antioksidativne aktivnosti koju pokazuje galaktan EPS, dalje je podvrgnut provjeri njegovog učinka na aktivnost SOD u WT ćelijama kvasca. Naši rezultati (slika 3B) pokazuju da je oksidativni stres izazvan tretmanom H2O2 uzrokovao oštro povećanje SOD aktivnosti WT ćelija tretiranih H2O2-u poređenju sa netretiranim ćelijama. Nasuprot tome, prethodna obrada WT ćelija galaktanom praćena izlaganjem H2O2 rezultirala je ~dvostrukim smanjenjem aktivnosti SOD u odnosu na ćelije tretirane samo H2O2 što ukazuje da galaktan pomaže stanicama kvasca u upravljanju oksidativnim djelovanjem izazvanim superoksidnim radikalima. stres47,67.

Oksidativni stresizazvan tretmanom peroksidom aktivira superoksid enzim i promjena u nivou aktivnosti SOD je direktna mjera nivoa ćelijskog oksidativnog stresa. U ovoj studiji korištena je metoda redukcije NBT, gdje je NBT indikator proizvodnje superoksidnih radikala. Inhibicija smanjenja NBT je direktna mjera SOD. Budući da se SOD takmiči sa NBT za superoksidne radikale koji nastaju izlaganjem riboflavina vidljivoj svjetlosti u prisustvu kisika i metionina, koji je donor elektrona. Superoksid reducira NBT u proizvod plave boje, formazan koji se može kolorimetrijski izmjeriti na 560 nm.

Prethodni izvještaji pokazuju da je LAB EPS pokazao antioksidativni učinak na način ovisan o koncentraciji u in vitro testovima, te u ćelijskim linijama raka debelog crijeva i in vivo modelima. Sposobnost EPS-a da ukloni ROS može se pripisati njihovim različitim hemijskim grupama68. Pokazalo se da drugi EPS (500 µg/ml) iz Bacillus amil tečnosti u velikoj mjeri utječu na aktivnost SOD i štite HepG2 ćelije od oksidativnog stresa izazvanog H2O2 68. Slično, EPS iz L. plantarum pokazao je efekat ovisan o koncentraciji na aktivnost SOD u Caco2 ćelijama protiv H2O2-indukovanog oksidativnog stresa69. Naši rezultati, u skladu s ovim izvještajima, pokazuju da galaktan EPS predtretman uklanja superoksidne radikale izazvane tretmanom H2O2 u WT ćelijama kvasca.

EPS smanjuje ćelijsku peroksidaciju lipida. Malondialdehid (MDA) je najistraženiji biomarker ćelijske peroksidacije lipida koji ukazuje na nivo oksidativnog stresa. MDA je hemijski stabilan, visoko reaktivan dijaldehid i može se lako vezati za proteine, nukleinske kiseline i lipoproteine. Vrlo je mutageno i može uvelike utjecati na biohemijska svojstva ovih biomolekula što je štetno za različite signalne puteve70. Povećanje nivoa MDA je pokazatelj oštećenja tkiva izazvanog ROS-om, a njegovi povećani nivoi detektuju se u nekoliko ljudskih patologija46. U ovoj studiji, kako bi se ispitalo kako predtretman EPS-om utiče na peroksidaciju lipida izazvanu H2O2 u WT ćelijama kvasca, procijenjeni su nivoi MDA. Rezultati su pokazali približno 15- puta smanjenje nivoa MDA u ćelijama koje su prethodno tretirane EPS, u poređenju sa onima izloženim samo H2O2, kao što je prikazano na slici 3C.

Ranije se pokazalo da EPS iz L. plantarum C88 smanjuje nivoe MDA izazvane tretmanom H2O2, na način ovisan o dozi (50-200 ug/ml) u Caco2 ćelijama, što ukazuje na to da peroksidom izazvana povreda membrane crevnih ćelija može se ublažiti dopunom EPS69 (zhang 2013). Nadalje, 500 ug/mL EPS-a iz B. amyloliquefaciens značajno je smanjilo H2O2-indukovanu MDA u HepG2 ćelijama71. Naši rezultati o H2O2-indukovanim nivoima MDA u ćelijama kvasca i njegovom značajnom smanjenju nakon prethodnog tretmana ćelija galaktan EPS ukazuju na to da tretman sa galaktan EPS smanjuje ćelijsku lipidnu peroksidaciju izazvanu ROS-om i zauzvrat može zaštititi ćelije od oštećenja tkiva uzrokovanih radikalima peroksida i pomažu u održavanju ćelijskog integriteta

eksperimenti. *predstavlja P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galaktan štiti mutante antioksidativnog gena kvasca pod oksidativnim stresom. Kako bi se procijenila antioksidativna sposobnost galaktana, različiti mutanti kvasca sa nedostatkom antioksidativnog gena (koji nemaju različite gene odgovora na oksidativni stres) tretirani su galaktanom i zatim izloženi subletalnoj dozi H2O2 42. SOD (sod1∆ i sod2∆), katalaza (cta1∆ i ctt1∆), tioredoksin peroksidaza (tsa1∆), glutation reduktaza (glr1∆) i dušikov oksid oksidoreduktaza (yhb1∆) mutanti kada se tretiraju s H2O2. pokazao nisko preživljavanje (sod1∆ 10,8 posto , sod2∆ 13,17 posto , tsa1∆ 13,55 posto , cta1∆ 15,34 posto , ctt1∆ 17,06 posto , glr1∆ 27,37 posto i WH37 posto i 7,37 posto Nasuprot tome, s galaktanom pre tretmana, tolerancija na oksidativni stres se povećala kod svih mutanata sa nedostatkom antioksidantnog gena i njihova održivost se značajno povećala (sod1∆ 78,43 posto, sod2∆ 59,96 posto, cta1∆ 87 posto, ctt1, tsa 87 posto ∆ 72,73 posto, glr1∆ 75,26 posto i yhb1∆ 82,41 posto) kao što je prikazano na slici 4A. Ovi rezultati sugeriraju da galaktan može učinkovito ukloniti slobodne radikale izazvane H2O2 kod mutanata kojima nedostaju specifični geni odgovora na oksidativni stres i štiti stanice od oksidativnog stresa. Slična zaštita je uočena u testu na licu mjesta, gdje je galaktan spasio mutante od oksidativnog stresa i povećao vitalnost kao što je prikazano na slici 4B.

Ćelije su evoluirale sa enzimskim antioksidativnim odbrambenim sistemima kako bi izdržale endogeni oksidativni stres uzrokovan ROS-om generiranim kroz različite fiziološke reakcije, koje bi inače imale štetne efekte na dobrobit stanice. Prethodni izvještaji i naši rezultati u ovoj studiji sugeriraju da je EPS u stanju da očisti ROS i poboljša vitalnost ćelija. Naši rezultati s mutantnim sojevima odgovora na oksidativni stres kvasca sugeriraju da tretman galaktan EPS uklanja i citosolne i mitohondrijalne superoksidne radikale izazvane tretmanom H2O2, što je dokazano povećanom održivošću mutantnih sojeva kvasca sod1∆ i sod2∆. SOD su primarna enzimska antioksidativna odbrana u stanicama protiv endogenog i egzogenog oksidativnog stresa, a mutacije u ovim genima su upletene u rak i degenerativne poremećaje. Isto tako, antioksidativno spašavanje cta1∆ i ctt1∆ (mutanta katalaze) tretmanom EPS-om ukazuje da tretman galaktan EPS-om pruža zaštitu od peroksizomalnog i citosolnog oksidativnog stresa izazvanog H2O2. Katalaza je odgovorna za ćelijsku detoksikaciju vodikovog peroksida i njen nedostatak je povezan s nastankom poremećaja povezanih sa starenjem. TSA1, tioredoksin peroksidaza je i ribosomski povezan i slobodni citoplazmatski protein koji oslobađa stanice od stresa vodikovog peroksida. Izvještaji sugeriraju da TSA1 također ima ulogu u popravljanju oksidativnog oštećenja DNK. Naši rezultati sugeriraju da EPS tretman spašava tsa1∆ ćelije kvasca od stresa izazvanog peroksidom. Peroksiredoksini sisara imaju pozitivan učinak na rast stanica, metabolizam i imunološke funkcije. Njihov nedostatak rezultira povišenim ćelijskim oksidativnim stresom koji utječe na ključne signalne puteve i umiješan je u neurodegenerativne poremećaje, maligne bolesti i upalne bolesti 72. Antioksidativni mehanizam glutationa je još jedan enzimski antioksidativni odbrambeni sistem prve linije prisutan u stanicama za prevladavanje oksidativnog stresa. GLR1 je homolog kvasca glutation reduktaze sisara, lokaliziran i u citosolu i u mitohondrijama73. Glr reducira oksidirani glutation (GSSH) u redukovani glutation (GSH) i igra ulogu u održavanju razine GSH u stanicama što zauzvrat detoksifikuje superoksidne i hidroksidne radikale, štiteći tako stanice od oksidativnog stresa74. Naši rezultati pokazuju visoku osjetljivost glr1∆ kvasca na H2O2 koja je ublažena prethodnom obradom galaktan EPS-om, što sugerira da bi galaktan EPS mogao zaštititi stanice koje imaju manjak GLR1 od oksidativnog stresa. Zanimljivo je da je nedostatak glutation reduktaze impliciran u starenju i metaboličkim, degenerativnim i kardiovaskularnim poremećajima povezanim sa starenjem75,76. Kao što je prikazano na slici 4A, yhb1∆ je također bio zaštićen galaktan EPS od H2O2 stresa što sugerira da galaktan EPS štiti stanice koje imaju manjak YHB1 od oksidativnog stresa. Kvasac YHB1 je omiljeni hemoglobin za koji se navodi da štiti stanice od stresa dušikovog oksida77 i oksidativnog stresa78. Dokazi sugeriraju da se čini da ljudski homolog YHB1 spašava stanice od toksičnosti alfa-sinukleina koji je biomarker Parkinsonove bolesti79. Ova prethodna otkrića i naši rezultati sugeriraju da EPS može promovirati preživljavanje stanica protiv razvoja degenerativnih poremećaja.

Da bi se procijenio nivo ROS u mutantima kvasca sa prisustvom i odsustvom galaktana pod H2O2 stresom, ćelije kvasca su posmatrane pod fluorescentnim mikroskopom, a nivo intracelularne oksidacije izračunat je spektrofluorometrom47,48. Mutanti kvasca tretirani samo sa H2O2 pokazali su više zelenih fluorescentnih ćelija u odnosu na one prethodno tretirane galaktanom. (slika 4C). Intenzitet fluorescencije DCF-a se povećao za približno 60 procenata, dok se sa prethodnim tretmanom galaktanom smanjio na približno 30 procenata kod mutanata kvasca tretiranih H2O2-u poređenju sa WT i odgovarajućom kontrolom (slika 4D). I mikroskopski i spektrofotometrijski rezultati ukazuju na povećan nivo ROS u ćelijama koje nemaju specifične antioksidativne gene u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. Kulture koje su prethodno tretirane galaktanom, a zatim izložene H2O2, pokazale su smanjenu fluorescenciju u odnosu na one bez prethodnog tretmana galaktanom, što sugerira da je galaktan smanjio ROS indukciju H2O2 izloženosti u mutantnim stanicama kvasca i promovira preživljavanje stanica. U svim gore navedenim eksperimentima, kada su ćelije isprane prije dodavanja H2O2, nije bilo značajnog spašavanja (dodatni podaci) što ukazuje da je uklanjanje ROS-a galaktanom posljedica direktnog čišćenja u mediju, a ne unutarćelijskom djelovanju.