Scaffold protiv starenja - Klotho genom aktiviran podstiče pomlađujući odgovor na zacjeljivanje rana u matičnim ćelijama dobivenim od ljudske masnoće

Ključne riječi:protiv starenja; -Klotho; genski aktivirana skela; matične ćelije izvedene iz masnoće; angiogeneza;taloženje matrice;podmlađujuće zarastanje

Kliknite ovdje da dobijete biljnu cistanche za protiv starenja i zacjeljivanje rana

1. Uvod

Zacjeljivanje rana je složen biološki proces koji zahtijeva čvrstu orkestraciju višestrukih ćelijskih događaja [1]. Međutim, u starijoj populaciji, stanični događaji su poremećeni, što dovodi do odgođenog zacjeljivanja [2]. Poremećaj u mehanizmima zacjeljivanja djelomično nastaje zbog smanjenog hominga matičnih stanica iz koštane srži i drugih preovlađujućih metaboličkih bolesti kao što je dijabetes [3,4]. U zbrinjavanju rana, primjena skela od biomaterijala postaje sve češća kao tretman. Skele od biomaterijalaštite ranu od infekcije, apsorbiraju eksudate rane i održavaju ranu vlažnom kako bi se spriječila nekroza tkiva [5]. Terapeutika se također može ubaciti u skele od biomaterijala i promovirati brže zacjeljivanje rana koje teško zacjeljuju [1]. Međutim, skele od biomaterijala same po sebi možda neće efikasno orkestrirati višestruke signalne kaskade koje se javljaju unutar rane. Isporuka matičnih ćelija se ponekad predlaže kao rješenje za moderiranje složenih signalnih događaja u rani [6]. 

Matične ćelije luče parakrine faktore i mogu se diferencirati u ćelije višestrukih linija tkiva [7]. Matične ćelije se obično unose u ranu intradermalnim injekcijama [6], lokalno prskanje [8], ili kao tkivno-inženjerski transplantati [9]. Posljednjih godina, primjena tkivno-inženjerskih transplantata za zacjeljivanje kroničnih rana postupno je stekla šire prihvaćanje zbog njihove sposobnosti da brzo zacjeljuju rane [9–11]. Apligraf® i Dermagraft® su dvije od široko korištenih bioinženjerskih konstrukcija koje je odobrila Uprava za hranu i lijekove (FDA) za liječenje kroničnih rana [12,13]. Međutim, stvaranje ovih graftova zahtijeva produženu ćelijsku kulturu kako bi se proizveo veliki broj ćelija [14]. Kada se koriste matične ćelije, produžena kultura može povećati ćelijsko starenje i smanjiti matičnost matičnih ćelija [15,16]. Stoga je održavanje matične ćelije ključno za postizanje optimalnog terapijskog odgovora. Terapijska isporuka gena matičnim stanicama korištenjem nevirusnih vektora potencijalna je strategija za poboljšanje funkcionalnosti matičnih stanica [17]. Tradicionalno, ćelije se transficiraju u 2D kulturama i kasnije se transplantiraju in vivo [18]. Međutim, platforme kao što su skele aktivirane genom, koje se sastoje od skela od biomaterijala funkcionaliziranih nanočesticama koje nose terapeutski transgen [19], da je naša grupa pionirski ponudila alternativno rješenje za transfekciju ćelija unutar 3-D okruženja. Ova studija se fokusirala na razvoj genski aktivirane verzije 3D kolagen-hondroitin sulfat (coll-CS) skele koja ima ogroman potencijal za kliničko prevođenje, budući da je njegov sastav sličan Integrinom šablonu za regeneraciju kože (DRT), klinički odobrenom skela za zacjeljivanje kroničnih rana [20]. Prvenstveno koristimo kationski polimer koji se zove polietilenimin (PEI) za kondenzaciju DNK plazmida koji kodiraju za gene faktora rasta kao što su stromalni faktor -1 alfa i faktor rasta živaca i sastavljamo ih u nabijene nanočestice [21–23]. Ove naelektrisane nanočestice se zatim natapaju u našu skelu coll-CS kako bi se stvorile skele aktivirane genima. Naše prethodne studije su također pokazale da PEI-bazirana skela aktivirana genom može uzrokovati prolaznu prekomjernu ekspresiju terapeutskog transgena u nizu stanica koje zacjeljuju rane i promovirati njihove regenerativne sposobnosti [21,24,25]. Tradicionalno, genski aktivirana skela je razvijena da cilja ćelije domaćina i promovira lokalnu popravku [26]. Međutim, novi dokazi ukazuju na to da ćelijama napunjene genom aktivirane skele imaju superiornu moć regeneracije složenih struktura tkiva nego same skele aktivirane genom [27]. 

Ćelijsko izobilje je jedan od ključnih zahtjeva za stvaranje tkivno-inženjerskih transplantata [28]. Masno tkivo je bogat izvor koji može opskrbiti veliki broj matičnih stanica. Masno tkivo sadrži čak 500 puta više matičnih ćelija za istu masu koštane srži, tradicionalnog izvora tkiva za ekstrakciju matičnih ćelija [29]. Štaviše, matične ćelije se mogu ekstrahovati iz masnog tkiva pomoću minimalno invazivnog procesa liposukcije [29]. Naša nedavna studija je otkrila da matične ćelije izvedene iz ljudske masnoće (ADSC) pokazuju odličnu biokompatibilnost sa coll-CS skelom. Korištenje pro-angiogenog genom aktiviranog skela dodatno je poboljšalo regenerativne odgovore ADSC-a [30]. Međutim, ADSC-ovi imaju tendenciju da izgube svoju snagu nakon širenja [31]. Ranije smo otkrili da je protein protiv starenja -Klotho bi mogao značajno poboljšati proliferaciju zdravih i dijabetičkih ljudskih ADSC [32]. Većina studija općenito koristi primarnu varijantu -Klotho [33–35] i pokazali su da protein može produžiti životni vijek ADSC-a aktivacijom transkripcijske aktivnosti telomeraze [33]. - Utvrđeno je da MSC koji prekomjerno eksprimiraju Klotho ispoljavaju snažne antifibrotičke efekte kod ozljede bubrega kroz inhibiciju Wnt/ -catenin signalizacija [36]. Međutim, uloga -Klotho u matičnim ćelijama ostaje relativno neistražen.

Osim razlike u fokusu istraživanja između - i -Klotho, sredstvo protiv starenjaKlotho proteini još nisu u potpunosti ugrađeni u strategije tkivnog inženjeringaza zacjeljivanje rana. Stoga smo u ovoj studiji nastojali proučiti funkcionalni utjecaj a -Klotho gen aktivirana skela na ljudskim ADSC-ima za primjenu u zacjeljivanju rana. Miprvi je istraživao transkripcijske aktivnosti klasičnih faktora pluripotencije ({0}}. oktobar,Nanog i Sox-2), marker proliferacije (Ki-67) i regulatori zacjeljivanja rana (TGF- 3 i TGF- 1) u ADSC-ovima. Zatim smo procijenili bioaktivnost kondicioniranog medijageneriran od strane ADSC-a opterećen gen-aktiviranim skelom kako bi se procijenio njegov parakrini potencijal.Na kraju smo ispitali regeneraciju bazalne membrane (fibronektin, laminin,i kolagen IV) i proteini povezani sa ožiljcima ( -SMA i elastin) u ADSC-ovimagenski aktivirana skela za procjenu kontroliranog sazrijevanja tkiva.

2. Rezultati

2.1. -Klotho genom aktivirana skela prolazno poboljšava stabljiku ljudskih ADSC-a i pro-reparativne gene

Analiza genske ekspresije prvo je pokazala da ADSC-ovi na skeli aktiviranoj genima prekomjerno eksprimiraju -Klotho gen preko 172- puta (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1A). Ovaj nalaz je potvrdio efikasnu interakciju ADSC-a sa skelom aktiviranom genom. Analiza markera proliferacije Ki-67 dalje je potvrdila da su ADSC-i na genski aktiviranoj skeli također održavali snažan proliferativni kapacitet tokom 14 dana (Slika1A). Potvrdivši prekomjernu ekspresiju anti-aginga -Klotho gen, onda smo procijenili podmlađivanje matičnih ćelija kroz aktivaciju faktora "pluripotencije" u ADSC-ima. Sve u svemu, primijetili smo prolaznu regulaciju sva tri faktora transkripcije tokom 14 dana (Slika1B). Međutim, ADSC-ovi su pokazali samo značajno povećanje ekspresije Oct-4 gena koje se održalo do 14. dana. Konkretno, ADSC-ovi su pokazali 25- puta (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Nivoi profibroznog TGF-a 1 gen u - Utvrđeno je da su ADSC sa prekomjernom ekspresijom Klotho-a jednaki onima iz grupe bez gena tokom 14 dana. Međutim, nivoi antifibroznog TGF-a 3 su bila značajna (3.6- puta,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho genom aktivirana skela

Povećava parakrinu moć ljudskih ADSC-a2.2.1. Pro-angiogena bioaktivnost. Test bioaktivnosti CM-a generisan od strane gensko-aktiviranih skela napunjenih ADSC-ima prvo je pokazao da može privremeno kontrolirati metaboličku aktivnost u HUVEC-ima. Dan 3 CM značajno je poboljšao metaboličku aktivnost u HUVEC-ima, dok je upotreba ostarjelog CM od 14. dana značajno smanjila metaboličku aktivnost HUVEC-a (Slika2A). Nakon što smo ovo uočili, testirali smo proangiogeni uticaj CM-a od 3. i 14. dana na HUVEC zasijane na Matrigelu. Kao što se i očekivalo, dan 3 CM iz grupe genski aktivirane skele značajno (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Međutim, nije došlo do daljeg porasta angiogene aktivnosti 14. dana CM u odnosu na dan 3. CM. Takođe, dan 14 CM iz obe grupe je pokazao sličnu proangiogenu efikasnost (Slika2C). Zajedno, naš nalaz ukazuje na to da skela aktivirana genima prolazno ubrzava pro-angiogenu reakciju ADSC-a.

profibrozni TGF- 1. ** i * označavajup < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± standardna devijacija (n = 3).

Slika 2. Pro-angiogena parakrina bioaktivnost skele CM-a aktiviranog genom napunjenog ADSC-ima. (A) CM proizveden skelom aktiviranim genima napunjenom ADSC-ima tokom 14 dana pokazao je sposobnost da privremeno kontroliše metaboličku aktivnost HUVEC-a. (B) Dan 3 CM iz grupe genski aktivirane skele značajno je povećao formiranje endotelnih tubula i njihovo grananje u poređenju sa onim iz grupe bez gena. (C) Formiranje tubula i grananje endotelnih ćelija 6h nakon izlaganja CM-u iz ADSC-a skela aktivirana genom i bez gena, * označava p < 0.05. Podaci predstavljaju sredinu! standardna devijacija (n=3)

2.2.2. Zacjeljivanje i sazrijevanje dermalnih fibroblasta

Jedan od nalaza studije angiogeneze je da kako sazrijeva skela aktivirana genima opterećena ADSC-ima, ona više ne promovira angiogenezu. Nadalje, 14. dana njihova angiogena moć bila je slična onoj u grupi bez gena (Slika 2B, C). Stoga smo istraživali utjecaj starijih od 14 dana CM na zatvaranje rane dermalnih fibroblasta. Slično rezultatu studije angiogeneze, obje grupe su pokazale slične nivoe zatvaranja rane fibroblasta 14. dana CM. Konkretno, obje grupe su zacijelile ranu za približno 40 posto za 12 h (slika 3A). Ovaj nalaz je otkrio da tokom sazrijevanja, genski aktivirana grupa skela podržava, ali ne potiče zatvaranje dermalnih fibroblastnih rane.

Ipak, kako su fibroblasti stimulirani ostarjelim CM, proučavali smo da li su utjecaji ekspresije matriksnih proteina uključeni u sazrijevanje rane. Kao što se i očekivalo, dermalni fibroblasti stimulirani CM-om iz grupe bez gena su obilno eksprimirali profibrotični protein kolagena I (slika 3B). Naprotiv, fibroblasti stimulisani sa CM iz grupe genski aktivirane skele pokazali su 50 posto manju ekspresiju (p < 0,05) proteina kolagena I. U međuvremenu, objema grupama je nedostajala ekspresija antifibroznog kolagena u cijelosti, i nisu uočene razlike između dvije grupe. Uzeto zajedno, to implicira da skela aktivirana genom pojačava modulatorni odgovor ADSC rane tokom sazrijevanja.

Slika 3. Parakrini utjecaj na dermalno zarastanje i sazrijevanje. (A) Starost 14 dana CM iz obje grupe ispoljila je slične nivoe aktivnosti zatvaranja rane kod odraslih dermalnih fibroblasta ljudi za približno 40 posto u 12 h. (B) CM iz genski aktivirane skele značajno je smanjio ekspresiju profibroznog kolagena u fibroblastima. " označava p < 0,05 Podaci predstavljaju srednju=standardnu ​​devijaciju (n=3). Na slici 3B, GAS i GFS označavaju skelu aktiviranu genom i skelu bez gena, respektivno

2.3. B-Klotho genom aktivirana skela poboljšava regeneraciju bazalne membrane sa poboljšanim antifibrotičnim odgovorom u ljudskim ADSC-ima

Posmatrajući kontrolisanu stimulaciju funkcionalnosti ADSC-a od strane genski aktivirane skele, na kraju smo istražili odgovor ADSC-a na regeneraciju dermalnih matrica i proteina. Skela aktivirana genima snažno je pojačala regeneraciju bazalne membrane ADSC-a. Konkretno, genski aktivirana skela značajno je promovirala taloženje komponenti bazalne membrane laminina i kolagena IV Slika 4A). Nakon semi-kvantitativne analize, također smo primijetili da taloženje matrice prati trend u odnosu na grupu bez gena. Uočen trend bio je fibronektin (1.0- puta) < laminin (2.1- puta, p < {{10}}.05) < kolagen IV (8.8- puta, p < 0,01). Nakon što je određena sposobnost regeneracije bazalne membrane, procijenili smo ekspresiju proteina ključnih za superiorno kvalitativno zacjeljivanje, kao što je smanjeno stvaranje ožiljaka. ADSC-ovi na skeli aktiviranoj genom pokazali su značajno (p < 0,05) smanjenu ekspresiju kontraktilnog proteina a-SMA povezanog sa ožiljkom. Ekspresija a-SMA u ADSC-ima bila je niža za 50 posto u odnosu na grupu bez gena (slika 4B). Na kraju, nakon što smo uočili smanjenu ekspresiju a-SMA, procijenili smo ekspresiju elastina elastina proteina matriksa. ADSC-ovi na skeli aktiviranoj genima pokazali su relativno superiorniju kvalitativnu ekspresiju elastina kroz taloženje zrele vlaknaste mreže elastina u poređenju sa ADSC-ovima na skeli bez gena (slika 4B).

Slika 4. Depozicija proteina matriksa za zarastanje rana od strane ADSC-a u genski aktiviranoj skeli 14. dana. (A) ADSC-ovi u skeli aktiviranoj genom pokazali su značajnu regen. rad bazalne membrane u poređenju sa ADSC-ima u skeli bez gena. ADSC-ovi su pretežno deponovali relativno zrelu mrežu proteina kolagena IV, praćenih lamininom i fibronektinom. (B) ADSC-ovi u genski aktiviranoj skeli su takođe eksprimirali 2-puta nižu SMA protein u poređenju sa ADSC-ovima u genu -besplatna skela. U vezi sa podrumskom mem. regeneracijom brane, ADSC-ovi u genski aktiviranoj skeli deponovali su kvalitativno bolju elastičnu matricu. Sve slike su snimljene kroz 20x objektiv pomoću IX73 Olympus mikroskopa* i * označava p < 0.01 i p < 0.05. Skala bar 50um. Podaci predstavljaju srednju standardnu ​​devijaciju (n=3).-SMA i fibronektin su dvostruko imuno obojeni.

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950