Ekstrakt lista masline (OLE) poremeti promet akvaporinom-2 izazvan vazopresinom kroz aktivaciju receptora koji osjeća kalcijum

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopresin (AVP) povećava propusnost vode ububrežnisabirni kanal kroz regulaciju trgovine akvaporin-2 (AQP2). Nekoliko poremećaja, uključujući hipertenziju i neodgovarajuće lučenje antidiuretičkog hormona (SIADH), povezano je s abnormalnostima u homeostazi vode. Pokazalo se da su određeni fitokomponenti korisni za ljudsko zdravlje. Ovdje su efekti ekstrakta listova masline (OLE) procijenjeni korištenjem in vitro i in vivo modela. Konfokalne studije su pokazale da OLE sprečava translokaciju AQP2 izazvanu vazopresinom u plazma membranu u MCD4 ćelijama i štakorimabubrezi. Inkubacija sa OLE smanjuje AVP-ovisno povećanje koeficijenta osmotske propusnosti vode (Pf). Da bi se razjasnili mogući efektori OLE, procijenjen je intracelularni kalcij. OLE povećava intracelularni kalcij kroz aktivaciju receptora za prepoznavanje kalcijuma (CaSR).NPS2143 , selektivni CaSR inhibitor, ukinuo je inhibitorni efekat OLE na propusnost vode zavisnu od AVP. Eksperimenti in vivo su otkrili da tretman sa OLE povećava ekspresiju CaSR mRNA i smanjuje AQP2 mRNA paralelno sa povećanjem AQP2-ciljane miRNA-137. Zajedno, ovi nalazi upućuju na to da OLE antagonizira djelovanje vazopresina kroz stimulaciju CaSR što ukazuje da ovaj ekstrakt može biti koristan za ublažavanje poremećaja karakteriziranih abnormalnom CaSR signalizacijom i utječe na reapsorpciju vode u bubrezima.

Listovi maslinovog drveta naširoko se koriste kao tradicionalni lijekovi za liječenje nekoliko bolesti, posebno u mediteranskim zemljama. Listovi se obično konzumiraju u ljudskoj prehrani kao ekstrakt ili prah za pripremu infuzija ili biljnih čajeva. Analiza hemijske karakterizacije otkrila je da listovi maslinovog drveta sadrže nekoliko bioaktivnih spojeva koji mogu imati blagotvoran učinak kod određenih bolesti kao što su metabolički sindrom, dislipidemija i hipertenzija. Utvrđeno je da su brojni polifenoli poput oleuropeina, hidroksitirozola i tirozola obogaćeni ekstraktom listova zelene masline (OLE)5, a poznato je da su uključeni u prevenciju određenih bolesti koje karakterizira oksidativni stres. Stoga se u posljednjih nekoliko godina povećava interes za istraživanje potencijalnih korisnih efekata ekstrakta listova masline među naučnicima u različitim poljima istraživanja. OIE je pokazao značajan antiproliferativni učinak na maligne ćelije mezotelioma mijenjajući unutarćelijsku dinamiku kalcija, vjerovatno ciljajući na T- tipa Ca2 plus kanali. Zanimljivo je da je otkriveno da OLE ispoljava antihipertenzivne efekte na genetsku hipertenziju kod spontano hipertenzivnih pacova (SHR), što se odnosi na poboljšanje vaskularne funkcije*. Prekomjerna reapsorpcija vode igra važnu ulogu u patogenezi povišenog krvnog tlaka. Kod hipertoničara, liječenih ekstraktom listova masline, utvrđeno je značajno smanjenje nekoliko faktora upale povezano sa smanjenjem krvnog tlaka. Osim toga, prekomjerno zadržavanje vode karakterizira nekoliko poremećaja kao što su ciroza jetre, zatajenje srca i neodgovarajuće lučenje antidiuretskog hormona (SIADH). Homeostaza vode u tijelu je strogo kontrolirana antidiuretskim hormonom vazopresinom (AVP) koji se oslobađa u dehidriranom stanju. AVP vezuje svoj srodni V2R receptor lokalizovan na bazolateralnoj membranibubrežniglavne ćelije na taj način aktiviraju cAMP signalni put koji rezultira translokacijom vezikula koje nose akvaporin-2(AQP2) iz intracelularnog bazena u apikalnu plazma membranu gdje dolazi do reapsorpcije vode. Na molekularnom nivou, nekoliko faktora može modulirati ravnotežu vode u bubregu. Povišen nivo luminalnog kalcijuma smanjio je kratkoročni promet AOP2 zavisan od vazopresina kroz aktivaciju receptora koji osjeća kalcijum (CaSR)1,12. S druge strane, aktivacija CaSR u uslovno besmrtnim bubrežnim proksimalnim tubularnim epitelnim ćelijama, izolovanim iz ljudskog urina, izazvala je značajno povećanje citosolnog kalcijuma i značajno smanjila povećanje cAMP-a izazvanog forskolinom (FK), direktnim aktivatorom adenilat cvclase3. , u MCD4 stanicama bubrežnih sabirnih kanala, koje stabilno eksprimiraju vodeni kanal AOP2, stimulacija CaSR je oslabila cAMP-ovisno povećanje fosforilacije AQP2 na serinu 256, što je ključni događaj u kaskadi transdukcije signala aktiviranoj vazopresinom i koji je na kraju povećao propusnost vode4 ,15 Nadalje, ububregkriške iz unutrašnje moždine mišjeg bubrega, aktivacija CaSR s kalcimimetikom NPS-R568 izazvala je značajno povećanje AQP2-ciljane miRNA-137, potvrđujući tijesnu interakciju između CaSR signalnog puta i AQP{ {4}}zavisna vodopropusnost l.17. U ovoj studiji, učinci ekstrakta lista masline, dobijenog iz lokalne sorte Coratina, procijenjeni su na funkciju AQP2 izazvanu vazopresinom u MCD4 stanicama bubrežnih sabirnih kanala koje stabilno eksprimiraju AOP2 i u dDAVP tretiranim pacovima ubrizganim ekstraktom. Pružamo dokaze da OLE tretman suprotstavlja vazopresinski odgovor u bubrežnim stanicama, što bi dijelom moglo objasniti njegov diuretski učinak. Zanimljivo je da se čini da je ovaj efekat povezan sa OLE-indukovanom aktivacijom CaSR, receptora za koji se zna da ima negativnu interakciju sa vazopresinskim receptorom12.

Saznajte više o djelovanju cistanchea na bubrege

Rezultati

Učinci OLE na funkciju AQP2 izazvanu vazopresinom u MCD4 stanicama. Da bi se istražilo moguće uključivanje OLE u funkciju AQP2 zavisnu od vazopresina,bubrežniMCD4 ćelije sabirnog kanala, koje stabilno eksprimiraju receptor vazopresina 2(V2R) i humani AQP2, korištene su kao eksperimentalni model18. Konfokalne studije (Slika 1A) su otkrile da je, u poređenju sa ćelijama tretiranim dDAVP, u kojima je AQP2 bojenje lokalizovano na apikalnoj plazma membrani, tretman sa OLE sprečio lokalizaciju AOP2 na membrani izazvanu stimulacijom dDAVP. U skladu sa ovim zapažanjima, OLE tretman je umanjio dDAVP-indukovano povećanje temporalnog osmotskog odgovora (označeno kao 1/t na Sl.1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 posto , n{16}} ćelija vs dDAVP=206.8±5,49 posto ,n=186 ćelija;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="">ćelije u odnosu na OLE/dDAVP=88.70±1.86 posto ,n=292 ćelije;p<0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Efekti OLE u bubrezima pacova kojima je ubrizgan OLE.

Da bi se dalje istražilo djelovanje OLE, sprovedene su in vivo studije. Konkretno, pacovima je ubrizgavan OLE (250 mg/kg/dan) jednom dnevno tokom tri dana. Alternativno, pacovi su istovremeno tretirani sa OLE, tokom 3 dana, i dDAVP, tokom 30 min. Procjena CaSR mRNA koja je izolovana iz bubrežnog sabirnog kanala pacova i obrađena za PCR u realnom vremenu (slika 6) otkrila je značajno povećanje CaSR mRNA u OLE(OLE=1.87±0.29, n{{) 10}} pacova vs CTR=1.02±0.17, n=5 pacova; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="" the="">bubreg, western blotting analiza i konfokalne studije su obavljene (slika 9). Kod pacova kojima je ubrizgan OLE/dDAVP, fosforilacija AQP2 na serinu 256 je značajno smanjena u poređenju sa bubrežnim tkivima životinja tretiranih dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 pacova vs dDAVP=2.16±0.25,n=5 pacova; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskusija

Kalcij je važan intracelularni glasnik koji modulira mnoštvo ćelijskih funkcija2. Abnormalna signalizacija kalcija može dovesti do nekoliko bolesti uključujući zatajenje srca, rak i hipertenziju23. Specifična kontrola ekspresije i aktivnosti proteina koji kontrolišu višestruke intracelularne kalcijumove signale se pokazala uspešnom u suočavanju sa brojnim poremećajima i stoga je privlačna za razvoj lekova. Ova studija pruža nove uvide u mehanizam djelovanja OLE pokazujući njegovu sposobnost da modulira intracelularnu kalcijumsku signalizaciju kroz stimulaciju CaSR-a koji je uključen u fino podešavanje prometa i ekspresije AQP2 izazvanog vazopresinom. U fiziološkim uslovima, AQP2 igra važnu ulogu u kontroli homeostaze vode u telu25. Stimulacija intracelularne mašinerije, koja dovodi do lokalizacije AQP2 na apikalnoj plazma membrani, dovodi do abnormalnog zadržavanja vode i posljedične hiponatremije kao kod sindroma neodgovarajućeg lučenja antidiuretičkog hormona (SIADH), ciroze jetre i kongestivnog zatajenja srca. model SIADH, povezan sa haploinsuficijencijom policistične bolesti 1, bazalni intracelularni nivo kalcijuma je značajno smanjen u poređenju sa nivoom izmerenim u sabirnim kanalima miševa divljeg tipa. Nizak intracelularni kalcij smanjio je aktivnost određenih enzima uključujući protein fosfatazu PP2A što je rezultiralo pojačanom regulacijom fosforilacije AOP2 kod serina 2561. Nasuprot tome. aktivacija CaSR sa kalcimimetikom NPS-R568 povećala je koncentraciju intracelularnog kalcijuma i smanjila nivo cAMP u ćelijama sa nedostatkom PKD1. Važno je da citosolni kalcij može sniziti regulaciju adenilovane ciklaze 3 koja se može inhibirati kalcijem, čime se fino podešava intracelularni nivo cAMP. U MCD4 ćelijama, zaista, stimulacija CaSR sa NPS-R568 smanjila je AQP{23}}pS256 preko inhibilata cyclase4. U ovoj studiji, tretman sa OLE je spriječio vazopresin-ovisno povećanje cAMP-a i AOP2-pS256, moguće kao posljedica povećanja intracelularne koncentracije kalcija. Treba napomenuti da je izlaganje vanjskom izvoru cAMP-a korištenjem permeabilnog 8-Br-cAMP značajno suprotstavilo inhibitorni efekat OLE na V2R put.

Povišen nivo citosolnog kalcijuma može dovesti do smrti ćelije i apoptoze. Međutim, kontinuirano povećanje intracelularnog kalcijuma sa 250 nM na više od 600 nM potaknulo je preživljavanje neurona4. U MCD4 ćelijama, tretman sa OLE od 0,1 mg/ml ne pokazuje citotoksični efekat. U ovoj koncentraciji, OLE (0,1 mg/ml) je blago povećao intracelularni nivo kalcijuma. Snimanje kalcija otkrilo je da akutna stimulacija s OLE uzrokuje prolazno povećanje intracelularnog kalcija kroz aktivaciju CaSR koji se poništava kada su ćelije prethodno inkubirane sa selektivnim antagonistom CaSR NPS2143, u stanicama proksimalnog tubula bubrega, alosterična aktivacija CaSR sa I- smanjio proizvodnju ROS-a čime je smanjio oksidativni stres mitohondrija koji je uzrokovao apoptozu stanica356. Štaviše, naša prethodna studija je pokazala da ekspresija varijanti pojačanja funkcije CaSR smanjuje oslobađanje ROS i S-glutationilaciju AQP237. Inkubacija s OLE smanjila je generiranje ROS u MCD4 ćelijama35 pokazujući njegovu antioksidativnu sposobnost. Ipak, trenutno je nejasno da li OLE utiče na AOP{17}}S-glutationilaciju. Brojne studije su otkrile da OLE ili oleuropein, koji je glavni sastojak OLE, mogu imati zaštitnu ulogu inhibirajući smrt stanica,39 Međutim, efekti ovisni o dozi opisani su kod pacova koji su primali OLE. Povoljni odgovori su postignuti pri dozama od 250 i 500 mg/kg. Nasuprot tome, pri višim koncentracijama, tretman sa OLE može imati štetne efekte moguće zbog prooksidativnog djelovanja nekoliko fito spojeva. U ovoj studiji, pacovima je ubrizgan OLE u dozi od 250 mg/kg tokom tri dana, pokazujući povećanu regulaciju CaSR. Nivo ekspresije CaSR povećavaju određena jedinjenja koja deluju kao alosterični aktivatori receptora. Kalcimimetici su zaista smanjili vaskularne kalcifikacije povećanjem biosinteze CaSR u ljudskim vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama0. U ovom nadmetanju, ne može se isključiti mogućnost da određena jedinjenja u OLE mogu funkcionisati kao alosterični modulatori CaSR. S druge strane, stimulacija vazopresinom može dovesti do oslobađanja IL-6 što može doprinijeti povećanju nivoa ekspresije CaSR42.

U bubrezima, stimulacija CaSR signalizacije je povezana sa smanjenjem ekspresije AQP2, moguće kroz miR-137 generaciju. miRNA su ključni posttranskripcijski modulatori. Također je opisano nekoliko vazopresin zavisnih miRNA koje ciljaju ekspresiju AQP243. Transfekcija sa miR-32 i miR-137 značajno je smanjila nivo ekspresije AOP2 u ćelijama mpkCCDc14. Zanimljivo je da OLE može ublažiti upalne signale i ispoljiti zaštitne efekte moduliranjem nivoa ekspresije nekoliko miRNA". Konkretno, u multiformnim ćelijama glioblastoma, OLE je promovirao ekspresiju različite miRNA uključujući miR-13745 koja je uključena u regulaciju Akt/mTOR signalni put 46. Treba napomenuti da tretman sa oleuropeinom sprečava Akt/mTOR signalizaciju kroz aktivaciju CAMK i AMPK izazvane kalcijumom". Aktivacija CaSR sa NPS-R568 aktivira AMPK i smanjuje aktivnost mTOR u ljudskim proksimalnim tubularnim ćelijama3. U skladu s ovim nalazima, inkubacija s OLE povećava citosolni kalcij, smanjuje aktivnost PKA i smanjuje veličinu ciste u modelu 3D ćelijske kulture48. Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da OLE može biti koristan u liječenju poremećaja karakteriziranih disregulacijom intracelularne dinamike kalcija u vezi sa smanjenjem CaSR signalizacije.

Ekstrakt lista masline sastoji se od nekoliko bioaktivnih komponenti, uključujući polifenole, vlakna i minerale49. U ovom trenutku nije jasno da li jedno jedinjenje ili sinergijska kombinacija fitospojeva u OLE može biti od koristi u modulaciji intracelularnih odgovora. Ekstrakt korišten u ovoj studiji primijenjen je kao mogući dodatak hrani i stoga je važno definirati fiziološki utjecaj samog ekstrakta s obzirom na to da se nekoliko fenola, uključujući hidroksitirosol, može filtrirati u bubrezima i vratiti u urinu50. Dalja istraživanja će obezbijediti efikasnost specifičnih komponenti koje mogu aktivno regulisati intracelularnu kalcijumsku signalizaciju kroz CaSR. Da zaključimo, ova studija pruža dokaze da se OLE može smatrati novim potencijalnim adjuvansom korisnim za ublažavanje poremećaja karakteriziranih smanjenjem ekspresije CaSR, kao i signaliziranjem i utjecajem na propusnost bubrežne vode.

materijali i metode

Hemikalije i antitijela.Sve hemikalije i antibiotici su kupljeni od Mercka (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka). Calcein-AM, Fura{1}AM, podloga za ćelijsku kulturu, fetalni goveđi serum (FBS) i Super Signal West Pico hemiluminescentni supstrati kupljeni su od Thermo Fisher Scientifica (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Aquaporin{ {2}}(AQP2) je otkriven korištenjem specifičnih antitijela (C-tail Ab) podignutih protiv sintetičkog peptida koji odgovara posljednjih 15 C-terminalnih aminokiselina ljudskog AQP2!. AQP2-pS256 antitijela je ljubazno poklonio profesor Peter Deen. Sekundarna kozja anti-zečja peroksidaza vezana antitela dobijena su od Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Nemačka). Sekundarna anti-zečja koza antitijela spojena sa Alexa-488 kupljena je od Thermo Fisher Scientific-a (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).

Proizvodnja ekstrakta bogatog fenolima i hemijska karakterizacija.Proizvodnja ekstrakta bogatog fenolima iz listova masline izvedena je kao što je navedeno u Ranieri et al.35. Nakon mljevenja blenderom (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), dodana je ddH2O voda (omjer 1/20, w/y) i zatim tri puta podvrgnuta ultrazvuku (CEIA, Viciomaggio, Italija) 30 min na 35±5 stepeni svaki put. Konačno, ekstrakti su filtrirani kroz filter papir, liofilizirani i čuvani na -20 stepeni C. Dobijeni ekstrakti su filtrirani najlonskim filterima od 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) i korišteni za hemijsku karakterizaciju. Ukupan sadržaj fenola, antioksidativna aktivnost i identifikacija pojedinačnih fenolnih jedinjenja izvršeni su prema Difonzo et al.. OLE je pokazao sadržaj polifenola, određen po Folin-Ciocalteu, jednak 195 mg. ekvivalenti galne kiseline (GAE) i antioksidativno djelovanje, određeno ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-diamonijum sol sulfonske kiseline)), što čini 750 μmol TE (Trolox ekvivalenti） g!.

Ćelijska kultura i tretmani.MCD4 ćelije kortikalnog sabirnog kanala miša, koje stabilno eksprimiraju humani AQP2 i himerni V2R-Rluc, korištene su kao eksperimentalni model18. Ćelije su uzgajane u 1:1 mješavini Dalbec-cos modificirane Eagleove podloge i F-12 sa dodatkom 5 posto (g/g) fetalnog goveđeg seruma. 1 posto (g/g) L-glutamina i 1 posto penicilina/streptomicina, 5 μM deksametazona, 400 ug/ml G418 (za otpornost na AQP2) i 1 ug/ml puromicina (za otpornost na V2R-Rluc) , u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO, na 37 stepeni. MCD4 ćelije su ostavljene u bazalnom stanju (CTR) ili dugotrajno tretirane OLE u 0,1 mg/ml O/N, dDAVP na 100 nM tokom 30 minuta, ili zajedno tretirane sa OLE i dDAVP ili NPS2143 na 1 μM O/N Alternativno, ćelije su bile izložene 8-Br-cAMP na 500 μM tokom 45 minuta, kratkoročni eksperimenti su izvedeni sa OLE pri 1 mg/ml tokom 5 minuta i NPS2143 na 10 μM tokom 15 minuta. Eksperimenti su izvedeni 3-5 nezavisnih puta koristeći ćelije iz različitih pasusa.

Životinjski model i tretmani.Sve procedure su obavljene u skladu sa danskim nacionalnim smjernicama za njegu i rukovanje eksperimentalnim životinjama i objavljenim smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje. Protokoli su odobreni od strane Instituta za kliničku medicinu. Univerzitet Aarhus, prema dozvolama za korištenje eksperimentalnih životinja koje je izdalo dansko Ministarstvo pravde (broj odobrenja 2015-15-0201-00658). Studije su provedene na odraslim pacovima Wistar mužjaka sa početnom težinom od 200-225 g. Životinje su držane na standardnoj ishrani glodara (Altromin, Lage, Njemačka) i imale su slobodan pristup vodi iz slavine. Tokom eksperimenata, pacovi su bili smešteni u grupama od po dva po kavezu, sa ciklusom svetlosti i mraka od 12:12 h, temperaturom od 21±2 stepena C i vlažnošću od 55±2 procenta.

Pet pacova je tretirano supkutanom injekcijom 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danska) u 200 ul fiziološke otopine/životinja, a pet pacova tretiranih nosačem služilo je kao kontrola. Nakon 30 minuta, pacovi su ubijeni, a bubrezi su obrađeni kako je opisano u nastavku.

Ćelije i IMCD lizati.Ćelije su uzgajane na posudama od {{0}} mm i resuspendirane u puferu koji sadrži 220 mM manitola, 70 mM saharoze, 0.5 M EGTA pH 8,0 ,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 u

prisustvo inhibitora proteaza (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptina i 2 mg/ml pepstatina A) i fosfataza (10 mM NaF i 1 mM natrijum ortovanadata). Alternativno, sekcije bubrega od približno 0,5 mm su pripremljene i ekvilibrirane 10 minuta u puferu koji sadrži 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukoze, 3,2 mM KCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM Ca8Clm2 i M1g. 1,8 mM KH2PO4 (pH7,4). Bubrežna papila je usitnjena makazama u istom puferu u prisustvu proteaza (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptin, i 2 mg/mlpepstatin A) i fosfataza (10 mM NaF i t. orthovanadate) inhibitori. Nakon ultrazvučne obrade (60 kHz tokom 5 s), lizati su centrifugirani na 12,000×g tokom 10 min. Supernatanti su sakupljeni i korišteni za imunobloting studije'8.

Konfokalna mikroskopija.Konfokalne studije su izvedene kao što je prethodno opisano1. Ukratko, ćelije su uzgajane na PET umetcima stanične kulture i tretirane kao što je gore opisano. Alternativno, preseci bubrega dobijeni od kontrolnih, OLE, dDAVP i OLE sa pacovima tretiranim dDAVP podvrgnuti su eksperimentima imunofluorescencije kao što je prethodno opisano. Slike su dobijene konfokalnim laserskim skenirajućim fluorescentnim mikroskopom Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Švajcarska).

Gel elektroforeza i imunoblotiranje. Proteini su razdvojeni na 12 posto poliakrilamidnih gelova bez mrlja (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) pod reduciranim uslovima kao što je prethodno opisano=5,52. Ukratko, proteinske trake su prebačene na Immobilon-P membrane (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) i imunoblotirane korištenjem anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) i anti-AQP2-pS256 antitijela. Imunoreaktivni signali su dobijeni korišćenjem Super Signal West Pico hemiluminiscentnih supstrata sa Chemidoc sistemom (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Trake su normalizovane na ukupni protein korišćenjem tehnologije bez mrlja (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Analiza denzitometrije je izvedena pomoću ImageLab-a (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) i analizirana pomoću GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Ispitivanje vodopropusnosti.Osmotska vodopropusnost mjerena je kao što je prethodno opisano43. Ukratko, MCD4 ćelije su uzgajane na 40-mm staklenim pokrovnim stakalcima. Nakon tretmana, ćelije su napunjene sa 10 μM membranski propustljivim Calcein-AM-om u trajanju od 45 minuta na 37 stepeni ,5 posto CO, u DMEM/F-12. Poklopci su postavljeni u perfuzionu komoru (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Mjerenja su obavljena pomoću invertnog TE2000-S mikroskopa (Nikon Eclipse mikroskop, Tokio, Japan) opremljenog za mjerenja fluorescencije jedne ćelije i analizu slike. Uzorci napunjeni Calcein-AM-om pobuđeni su na 490 nm. Mjerenja fluorescencije, nakon izosmotske (140 mM NaCl. 5 mM KCl, 1 mM MgCl.. 1 mM CaCl., 10 mM Hepes sulfonske kiseline, 5 mM glukoze, pH 7,4) ili hiperosmotske (izosmotske otopine dodane sa 135 M otopine manitola) . rađeni su korištenjem Metafluor softvera (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Kanada). Snimljeni su podaci o vremenskom toku fluorescencije nakon perfuzije ćelija sa izo- i hiperosmotskim rastvorima. Vremenski tok skupljanja ćelije mjeren je kao vremenska konstanta (Ki, izražena kao 1/r, sec), parametar povezan s propusnošću vode, dobiven prilagođavanjem podataka eksponencijalnom funkcijom analiziranom pomoću GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , Kalifornija, SAD).

Mjerenja prijenosa energije fluorescentne rezonancije.Za procjenu intracelularnih cAMP promjena, primijenjena je tehnologija fluorescentnog rezonantnog prijenosa energije (FRET). Za FRET eksperimente, ćelije su transficirane plazmidom koji kodira H96 senzor koji sadrži cAMP-vezujući konsenzusni motiv EPAC1 ugrađen između cijan fluorescentnog proteina (CFP) i cp173Venera-Venera kao što je prethodno prikazano32.33.54. Plazmid koji kodira sondu H96 je poklon Dr.K. Jalink. Vizualizacija ćelija koje eksprimiraju ECFP i/ili EYFP i detekcija FRET izvršena je pomoću invertnog TE2000-S mikroskopa (Nikon Eclipse mikroskop, Tokio, Japan). Svaka slika je ispravljena i analizirana kao što je prethodno prikazano55.

Intracelularna mjerenja kalcija. Intracelularna mjerenja kalcijuma su obavljena kao što je prethodno prikazano56. Ukratko, MCD4 ćelije su napunjene sa 4 μM Fura-2 AM tokom 15 minuta na 37 stepeni u DMEM/F-12. Za perfuziju ćelija tokom eksperimenta korišćen je Ringerov rastvor koji sadrži 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM glukoze, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. U mjerenjima fluorescencije, pokrovni stakalci sa preopterećenim ćelijama su postavljeni u perfuzionu komoru (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, SAD). Mjerenja su obavljena na invertovanom TE2000-S mikroskopu (Nikon Eclipse mikroskop, Tokio. Japan). Odnos intenziteta fluorescencije na 340 i 380 nm je ucrtan i izračunat kao promjena fluorescencije. Konkretno, stimulacija sa OLE (1 mg/ml) ili NPS2143 (10 μM) upoređena je u istom tipu ćelije sa onima dobijenim nakon stimulacije maksimalnom dozom agonista posredovanog kalcijumom ATP (100 μM) koji je korišten kao interna kontrola (100 posto).

Intracelularni nivo kalcijuma mjeren je u stabilnom stanju i kalibriran kako je opisao Grynkiewicz57. OLE i NPS2143 korišćeni su dugotrajno na 0.1 mg/ml i l uM, respektivno, a svaki uzorak je kalibrisan dodatkom 5 μM jonomicina u prisustvu 1 mM EGTA (Rm.) nakon čega je usledilo 5 μM jonomicina. μM jonomicina u 5 mM CaCl, (RMA).

PCR analiza AQP2 i CaSR mRNA u realnom vremenu kod kontrolnih i tretiranih pacova.PCR eksperimenti u realnom vremenu su izvedeni kako bi se izmjerila relativna ekspresija mRNA u unutrašnjem sabirnom kanalu medule (IMCD) izolovanoj iz kontrolnih i tretiranih papila bubrega pacova. Napravljeni su rezovi bubrega od oko 0.5 mm i ekvilibrirani 10 minuta u puferu koji sadrži 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukoze, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2 mM MgSO4 i 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Bubrežna papila je izolirana pod stereomikroskopom. Uzorci kontrolnih i tretiranih pacova su zatim usitnjeni makazama direktno u Trizolu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Reverzna transkripcija je izvršena na 2,5 ug ukupne RNK koristeći SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD), u skladu sa prijedlozima proizvođača (25C 10 min; 42C 60 min; 85C 5 min). PCR amplifikacija u realnom vremenu je izvedena korišćenjem TagMan Fast Advanced Master Mixa sa CaSR, AOP2 i GAPDH testovima (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) u StepOne PCR sistemu u realnom vremenu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), postavljanje uslova termičkog ciklusa kako je specificirao proizvođač (95 stepeni C za 20 s; 40 ciklusa alternativno na 95°C za 1 s i 60 stepeni C za 20 s). Rezultati su izraženi kao 2- vrijednosti (relativna kvantifikacija) sa tretiranim △ACt=(Ct cilj-Ct GAPDH)-(Ct cilj-Ct GAPDH)Sham1.

MiRNA-137 evaluacija kod kontrolnih i tretiranih pacova.Sadržaj miRNA{{0}} u kontrolisanom i tretiranom sabirnom kanalu unutrašnje moždine štakora je procijenjen korištenjem TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; ID analize;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), koji je omogućio visoko osjetljivu i specifičnu notifikaciju zrele miRNA pomoću kvantitativne PCR. Napravljeni su rezovi bubrega od oko 0,5 mm i ekvilibrirani 10 minuta u puferu koji sadrži 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukoze, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 m 8 mM. KH2PO4(pH7.4). Bubrežna papila je izolovana pod stereomikroskopom. Uzorci kontrolnih i tretiranih pacova su zatim usitnjeni makazama direktno u Trizolu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) da bi se izdvojila ukupna RNK. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Katalog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) je korišten za dobivanje cDNK sinteze, prema protokolu koji je dao proizvođač (Reakcija poli(A) repa; reakcija ligacije; reakcija reverzne transkripcije; miR-Amp reakcija). Sintetičku RNK (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) sa 59-fosforom sintetizovao je Thermo Fisher Scientific i koristio je za izvođenje kalibracione krive za interpolaciju vrijednosti uzorka miRNA i za dobijanje precizne procjene (u nanogramima) sadržaja miR-137 u uzorci16, koristeći GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).

Statistička analiza.Sve vrijednosti su prijavljene kao srednja vrijednost±SEM Statistička analiza je izvršena jednosmjernom ANOVA-om praćenom Newman-Keulsovim testom višestrukih poređenja sa *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Izjave, etičko odobrenje i pristanak za učešće.Studije na životinjama izvedene su u skladu sa danskim nacionalnim smjernicama za njegu i rukovanje eksperimentalnim životinjama i objavljenim smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje. Etički komitet za brigu o životinjama Instituta za kliničku medicinu Univerziteta Aarhus odobrio je protokole istraživanja, prema dozvolama za korištenje eksperimentalnih životinja koje je izdalo dansko Ministarstvo pravde (broj odobrenja 2015-15-0201-00658). Autori potvrđuju da su sve metode provedene u skladu sa relevantnim smjernicama i propisima. Osim toga, autori potvrđuju da je studija provedena u skladu sa smjernicama ARRIVE.

Reference

1. El, SN & Karakaya, S. Drvo masline (Olea europaea) ostavlja potencijalno blagotvorno djelovanje na zdravlje ljudi. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Efekti ekstrakta listova masline na metabolički odgovor, funkcije jetre i bubrega i inflamatorne biomarkere kod hipertenzivnih pacijenata. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive polifenoli i metabolički sindrom. Molekule

4. Cherif, S. et al. Kliničko ispitivanje titriranog ekstrakta Olea u liječenju esencijalne arterijske hipertenzije. J. Pharm. Belg. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Zeleni ekstrakti iz sorte masline cortina ostavljaju antioksidativnu karakteristiku i biološku aktivnost. J. Funct. Hrana 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Nove mogućnosti za valorizaciju nusproizvoda maslinovog ulja. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Ekstrakt lista masline obogaćen oleuropeinom utiče na dinamiku kalcijuma i narušava vitalnost ćelija malignog mezotelioma. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Antihipertenzivni efekti ekstrakta listova masline obogaćenog oleuropeinom kod spontano hipertenzivnih pacova. Funkcija hrane 7, 584–593.

9. Hall, JE Disfunkcija bubrega, a ne nerenalna vaskularna disfunkcija. Posreduje u hipertenziji izazvanoj soli. Tiraž 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopresin i regulacija akvaporina-2. Clin. Exp. Nefrol. 17, 751–764.

11. Procino, G. et al. Ekstracelularni kalcij antagonizira trgovinu akvaporinom 2 izazvanom forskolinom u stanicama sabirnih kanala. Kidney Int. 66, 2245–2255.

12. Riccardi, D. & Valenti, G. Lokalizacija i funkcija bubrežnog receptora koji osjećuje kalcijum. Recenzije o prirodi. Nefrologija 12, 414–425.

13. Di Mise, A. et al. Uslovno besmrtne ljudske proksimalne tubularne epitelne ćelije izolovane iz urina zdravog subjekta eksprimiraju funkcionalni kalcijum-sensing receptor. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308, F1200-1206.