Efekti perfuzijskih pritisaka na gubitak podocita u izolovanom perfuziranom mišjem bubregu

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract

Pozadina/Ciljevi: Podociti se gube u većini glomerularnih bolesti, što dovodi do glomeruloskleroze i progresivnebolest bubrega. Općenito se pretpostavlja da su podociti izloženi protoku filtracije, a time i značajnim silama smicanja koje potiču njihovo odvajanje od bazalne membrane glomerula (GBM). U tom kontekstu, brisanje procesa stopala je predloženo kao potencijalni adaptivni odgovor za povećanje adhezije podocita na GBM. Metode: Testirali smo ove hipoteze korištenjem optičkog čišćenja i 3-dimenzionalne morfometrijske analize visoke rezolucije u izoliranoj perfuziranoj mišjibubreg.Istraživali smo dinamiku odvajanja podocita pri različitim perfuzionim pritiscima (50, 300 i više od 450 mmHg) kod zdravih mladih ili starih miševa (20 naspram 71 tjedna starosti), ili miševa kojima je ubrizgan anti-GBM serum za indukciju globalnog stopala. brisanje procesa. Rezultati: Rezultati pokazuju da su zdravi podociti kod mladih miševa čvrsto vezani za GBM, a čak ni supramaksimalni pritisci nisu uzrokovali značajno odvajanje. U poređenju sa mladim miševima, kod starijih miševa i miševa sa anti-GBM nefritisom i brisanjem stopala, postupni progresivni gubitak podocita se dogodio već prije perfuzije. Visoki perfuzijski pritisci rezultirali su relativno malim dodatnim gubitkom podocita kod ostarjelih miševa. Kod miševa sa anti-GBM nefritisom, značajan dodatni gubitak podocita dogodio se u ovoj ranoj vremenskoj tački kada se perfuzijski pritisak povećava na 300 mmHg ili više. Zaključak: Ovaj rad pruža prvi eksperimentalni dokaz da su podociti izuzetno otporni na akutno povećane perfuzione pritiske u ex vivo izolacijibubregmodel perfuzije. Samo kod glomerularne bolesti, značajan broj povrijeđenih podocita se odvaja nakon akutnog povećanja perfuzijskog tlaka.

Ključne riječi:Glomerularna hipertenzija; Glomerularna hiperfiltracija; Mehanički stres; napredovanje; Hronična bolest bubrega

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA

Uvod

Glomerularna hipertenzija i hiperfiltracija oštećuju glomerul što dovodi do progresivne glomerularne bolesti. Rasprostranjeno je vjerovanje da povećani perfuzijski pritisak izlaže čuperak povećanom mehaničkom stresu koji izaziva adheziju podocita na bazalnu membranu glomerula (GBM), doprinoseći njihovom odvajanju [1, 2]. Podociti su visoko diferencirane, postmitotične ćelije, neophodne za netaknutu glomerularnu filtracijsku barijeru. Gubitak podocita je najvjerovatnije rezultat odvajanja živih ćelija od GBM-a, a ne apoptoze ili nekroze [3-6], jer je bilo moguće kultivirati podocite izvučene iz urina pacijenata [4]. Odvajanje živih podocita od GBM-a može biti rezultat poremećenih mehanizama vezivanja ili altemehaničkih sila. Poremećaj vezivanja za GBM može biti posljedica ozljede stanica ili smanjene ekspresije adhezionih molekula i uglavnom je povezan s upalnim glomerularnim bolestima. S obzirom na mehaničke sile relevantne za podocit, postoje dvije ključne determinante, naime tlak filtracije i protok filtrata [7-9]. Pritisak filtracije stvara naprezanje po obodu zida i djeluje kao sila rastezanja na GBM. Varijacije u transmuralnom hidrostatičkom pritisku su efikasno kompenzirane sposobnošću GBM-a da djeluje kao elastična membrana i da se širi ili skuplja na površini [8, 10]. S druge strane, protok filtrata preko GBM djeluje tangencijalnim silama na površinu podocita, odnosno posmičnim naprezanjem. Iz studija in vitro znamo da su podociti vrlo podložni naponu smicanja koji se odvaja od svog supstrata kada su izloženi posmičnim naprezanjima većim od 0,025 Pa [11] i usvajanju srednjeg fenotipa koji im može pomoći da se suprotstave silama koje proizlaze iz protoka [12]. Ostaje nejasno da li glomerularna hipertenzija utiče na podocite preko povećanog filtracionog pritiska i/ili povećane filtracije. U ovoj studiji pružamo prvu analizu sposobnosti podocita da se odupru povećanim mehaničkim silama u modelu ex vivo. Gubitak podocita je kvantificiran u visokoj rezoluciji korištenjem čišćenja tkiva i 3-dimenzionalne morfometrijske analize kod mladih i zdravih miševa

Materijali i metode

Svi eksperimenti na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama njemačkog zakona o dobrobiti životinja i odobreni su od strane Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). Miševi su bili smješteni u posebnom objektu bez patogena sa besplatnim pristupom hrani i vodi i 12-satnim ciklusom dan/noć. Oplemenjivanje i genotipizacija obavljeni su prema standardnim procedurama. Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP miševi na FVB/N genetskoj pozadini su opisani ranije [13]. Da bi aktivirali transgensku ekspresiju Pod-rtTA-eGFP, miševi su primali doksiciklin putem vode za piće ad libitum tokom 7 dana (2 g/l, 5 posto saharoze, zaštićeno od svjetlosti), nakon čega je uslijedio period ispiranja od 1 sedmice prema prethodnim izvještajima. Anti-GBM nefritis induciran je jednom intraperitonealnom injekcijom nefrotoksičnog seruma od 5 mg/g tjelesne težine kao što je prethodno opisano [14].

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA

Perfuzija bubrega

Izolovanibubregperfuzijski model je korišten kao što je opisano na drugom mjestu [15]. Ukratko, miševi su narkotizirani intraperitonealnom injekcijom ksilazina/ketamina (0,1ml/10g tjelesne težine ip), a zatim su bubrezi perfuzirani kompleksnom modificiranom Krebs-Henseleit-otopinom (Tabela 1) sa dodatkom 5 procenat goveđeg serumskog albumina (BSA) na 37 stepeni da bi oponašao fiziološki milje tokom eksperimenta. Maksimalna vazodilatacijabubregvaskulatura je indukovana 1. subkutanom injekcijom verapamila (50 µl) odmah nakon indukcije anestezije i 2. dodatkom papaverina u perfuzioni rastvor. Nakon početne perfuzije u trajanju od 5 minuta na 50 mmHg, fluorescentno označeni lektin (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL-1082; 4 ul u 986 ul fiziološkog rastvora) je ubrizgan da bi se označile endotelne ćelije.Bubreziperfundirani su dodatnih 5 minuta modificiranom Krebs-Henseleit-otopinom sa 5 posto BSA. Nakon toga, lijevobubregkoji je služio kao uparena kontrola u svakom eksperimentu uklonjen je nakon pažljive ligacije lijeve stranebubrežniposude, narezane na kriške i direktno uronjene u 3 posto paraformaldehida (PFA) u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS). Pravobubreg was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 mmHg, pritisci filtracije su procijenjeni na znatno iznad 400 mmHg), primijenjeno ručno, ukupna zapremina od 50 ml perfuzionog rastvora. Thebubreziperfundirani su konstantnim pritiskom od 50 mmHg ili 300 mmHg pomoću pumpe kontrolisane pritiska (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Njemačka). Onda desnobubregje uklonjen, izrezan na kriške od 2 mm i uronjen u 3 posto paraformaldehida (PFA) u fiziološkom rastvoru puferiranom fosfatom (PBS).

3D slika i kompjuterska analiza PFA-uronjenabubregkriške su inkubirane na mehaničkom šejkeru 5 dana na sobnoj temperaturi. Nakon toga, fiksirani uzorci su isprani u 1x PBS i stavljeni u mehanički šejker preko noći na sobnoj temperaturi.Bubregkriške su zatim stavljene u visokokvalitetni 100 posto etanol (Merck; 100983) na 1 sat na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje (najmanje 1 promjena na svježi etanol), nakon čega je slijedilo direktno uranjanje u etil cinamat (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) i ostavljeni su preko noći u laganoj mućkalici na sobnoj temperaturi pod zaštitom od svjetlosti. Translucencija tkiva postignuta je za manje od 1 sata. Za uspravne mikroskope koristili smo komore za jednokratnu upotrebu koje su napravljene u kući kao što je prethodno opisano [16]. Većina eksperimenata je izvedena pomoću 2-fotonskog mikroskopa (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Softver za snimanje Fidžija korišćen je za kretanje kroz Z-os svakog snopa serijskih optičkih sekcija i za izolaciju pojedinačnih glomerula putem 3D izrezivanja [16].40 glomerula pobubreg(20 subkortikalnih i 20 jukstamedularnih) odabrano je za analizu. Stoga je u ovoj studiji analizirano ukupno 1200 glomerula da bi se dobili rezultati sa dovoljno preciznošću. Podociti su identifikovani kao eGFP plus ćelije. Kvantifikacija zapremine kapilara, zapremine glomerula kao i broja jezgara (tačaka) i zapremine izvršena je korišćenjem softvera za 3D renderovanje i analizu (Imaris v9.1; Bitplane AG, Cirih, Švajcarska) Udaljenost podocita od vaskularnog pola izračunata je korišćenjem Bitplane XTension "Spot Closest. Distance". Automatska kvantifikacija podocita je izvedena kao što je prethodno opisano [17]. Analiza slike je izvršena pomoću Imarisa (Biplane AG Zurich, Švicarska). Svaki glomerul je definiran svojom aferentnom arteriolom označenom lektinom. 20 subkortikalnih i 20 jukstamedularnih (definisano njihovom udaljenosti od kortikalne površine).

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOL U BUBREZIMA/BUBREZIMA

Svetlosna mikroskopija i imunofluorescencija

Za svjetlosnu mikroskopiju, 4 posto puferovano je fiksirano formalinombubregfragmenti su dehidrirani, ugrađeni u parafin i obojeni periodičnom kiselinom–Schiff (PAS). Procenat abnormalnih/povrijeđenih glomerula izračunat je na osnovu identifikacije 50 reprezentativnih poprečnih presjeka glomerula po mišu odabranih tokom sistematske šetnje prekobubrežnikorteks. Naš standardni protokol imunofluorescencije [18] izveden je na 2 μm parafinskim rezovima. Korištena su sljedeća antitijela: pileći poliklonalni anti-GFP (ab13970; Abcam), mišji monoklonski anti-sinaptopodin (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), poliklonski zečji anti-miš p57 (sc-8298; Djed Mraz; Santa Cruz Biotechnology); -Cruz Biotechnology), zečji poliklonalni anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 magarac protiv piletine (703-225-155; Dianova, Hamburg, Njemačka), Alexa Fluor546 kozji anti-miš IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), poliklonalni magarac protiv zeca AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).

Elektronska mikroskopija

Mali komadići korteksa su fiksirani u Karnovsky-rešenju i ugrađeni u Epon (Serva, Heidelberg, Njemačka). Ultratanki rezovi su ispitivani transmisionim elektronskim mikroskopom ZEISS Leo 906 na 60 kV uz povećanje od 3597-6000x. Uzorci su isprani u 0,1 M Soerensen fosfata (Merck, Darmstadt, Njemačka), naknadno fiksirani u 1 posto OsO 4 (Roth, Karlsruhe, Njemačka) u 17 posto puferu saharoze (Merck, Darmstadt, Njemačka) i dehidrirani uzlaznom serijom etanola ( 30, 50, 70, 90 i 100 posto) po 10 min. Poslednji korak je ponovljen 3 puta. Dehidrirani uzorci su inkubirani u propilen oksidu (Serva, Heidelberg, Njemačka) 30 min, u mješavini Epon smole (Serva, Heidelberg, Njemačka) i propilen oksida (1:1) 1 h i konačno u čistom Eponu 1 h. Epon polimerizacija je izvedena na 90 stepeni u trajanju od 2h. Ultratanki rezovi (70-100 nm) su izrezani ultramikrotomom (Reichert Ultracut S, Leica dijamantskim nožem (Leica) i pokupljeni na Cu/Rh rešetkama (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Njemačka). Kontrast je poboljšan pomoću bojenje sa 0,5 posto uranil acetata i 1 posto olovnog citrata (oba EMS, Minhen, Njemačka) Uzorci su posmatrani na naponu ubrzanja od 60 kV pomoću Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka) transmisionog elektronskog mikroskopa.

Statistička analiza

Statističke analize su obavljene pomoću softvera GraphPad Prism v8. Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SD. Za poređenje 2 grupe korišten je t-test. Analizom varijanse izvršeno je poređenje nekoliko grupa; post hoc Tukeyeva korekcija je korištena za višestruka poređenja. Svi testovi su bili 2-repide i statistička značajnost je definirana kao P <>

Rezultati

Poluautomatska metoda za određivanje broja podocita po glomerulu Proučavane su tri grupe, odnosno zdravi mladi i stari miševi i miševi sa anti-GBM glomerulonefritisom (♂:♀ 1:1). Mladi, zdravi miševi bili su stari 15-21 sedmica, dok su stari (stari) imali 74 sedmice. Globalni proces brisanja stopala izazvan je kod miševa od 14-20 sedmica putem jedne injekcije anti-GBM seruma 3 dana prije postavljanja izolovanog perfuziranogbubregmodel (slika 1A), kao što je prethodno opisano [19].

Da bi se utvrdio uticaj intrarenalnog perfuzijskog pritiska na podocite,bubrezibili podvrgnuti različitim perfuzionim pritiscima u izolovanimbubregmodel perfuzije. Prvo, obojebubreziuvijek su perfuzirani na 50 mmHg tokom 5 min. Da testiramo da li je naš perfuzioni rastvor sačuvao integritet glomerula u održivom nefiksiranombubrezi, 2 miša su perfuzirana pri konstantnom pritisku od 100 mmHg tokom 90 min. Perfuzija, protok mokraće (25 µl/min/gr tjelesne težine) kao i klirens inulina (22 µl/min) ostali su stabilni tijekom cijelog vremena (Dopunska slika 1 – za sav dodatni materijal vidiwww.cellphysiolbiochem.com).U eksperimentalnih miševa, nakon početne perfuzije pri 50 mmHg, lijevobubreg was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mmHg; supramaksimalni filtracijski pritisak od oko 450 – 500 mmHg) primijenjeni su na preostalu desnu stranububregza 5 min. (slika 1B). U izolovanoj perfuzijibubrezi, podociti su identifikovani korišćenjem nuklearnog obeležavanja sa eGFP-histonom kod naših transgenih miševa koji eksprimiraju eGFP pod promotorom podocina (eGFP:Pod-rtTA miševi). Broj podocita je kvantifikovan upotrebom kombinacije ovog in vivo metaboličkog obeležavanja i 3D morfometrije (slika 1C).

Gubitak podocita kod zdravih i starih miševa

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 mmHg u poređenju sa početnom linijom sugerira da ovo neznatno povećanje gubitka podocita s višim pritiskom nije slučajan nalaz. Na PAS sekcijama uočene su blage glomerularne promjene kod starijih miševa na početku (mezangijalna ekspanzija i povremena skleroza, slika 2F). A

Gubitak podocita nakon akutne ozljede

Anti-GBM serum je primijenjen na mlade zdrave miševe kako bi se izazvala značajna i specifična ozljeda podocita. U vrlo ranoj vremenskoj tački (tj. 3 dana) nakon indukcije anti-GBM glomerulonefritisa, uočeno je generalizirano brisanje procesa na stopalu u svim glomerulima transmisijskom elektronskom mikroskopijom (slika 3A-D). U izolovanoj perfuzijibubreziobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 mmHg uzrokovalo je više od 80 posto gubitka podocita u manjini glomerula (slika 3E). Ovo je u skladu sa fokusnom prirodom modela anti-GBM bolesti. Unutar jukstamedularnih glomerula, gubitak podocita bio je izraženiji u odnosu na subkortikalne glomerule (56,66 ± 16,9 i 47,35 ± 17,07, respektivno) (slika 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); endotel nije pokazao značajne promjene. PAS bojenjem je identificirana tubularna dilatacija. Tri dana nakon injekcije anti-GBM seruma, još se nisu razvile polumjesečne lezije (slika 3G-I). Mužjaci su pokazali veći stepen gubitka podocita u odnosu na ženke (63,71 ± 2,11 naspram 75,81 ± 3,83 podocita po glomerulu), što je u skladu sa zapažanjem da su mal miševi podložniji anti-GBM antiserumu i formiraju više ćelijskih polumjeseca tokom bolest (slika 3J). Međutim, dodatni gubitak podocita nakon visokih perfuzijskih pritisaka bio je sličan kod muškaraca i žena (slika 3J).

Slika 3. Gubitak podocita nakon akutne povrede. (AB) Transmisiona elektronska mikroskopija iz kontrolebubreg per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 mmHg). Za višestruka poređenja ANOVA. ****P<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Praćenje izgubljenih podocita u tubulima

eGFP plus podociti su redovno primećeni unutar lumena proksimalnih tubula gde se činilo da su prianjali na ivicu ćelija proksimalnih tubula (slika 4A). Ovi podociti nisu isprani u hiperperfuzijibubregs, umjesto toga su se prilično čvrsto pridržavali ivice četkice kako bi izdržali izvanredan protok primarnog urina pri vrlo visokim perfuzionim pritiscima. Da bi se potvrdio njihov identitet, podociti su obojeni podocit-specifičnim markerima (tj. p57, sinaptopodinom i WT-1) uz genetski marker praćenja loze nuklearnog eGFP (slika 4B). Broj podocita bio je značajno niži u onim glomerulima sa adhezivnim podocitima u pridruženom proksimalnom tubulu, a prisustvo podocita u tubulima je u obrnutoj korelaciji sa brojem podocita po glomerulu (slika 4C).

Preferencijalni gubitak podocita na perihilarnoj lokaciji

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, nisu uočene značajne promjene u prostornoj distribuciji podocita kod mladih i zdravih miševa. Kod ostarjelih miševa, udaljenosti podocita od vaskularnog pola su općenito povećane, najvjerovatnije odražavajući glomerularnu hipertrofiju, dok je hiperperfuzija rezultirala preferencijalnim odvajanjem podocita blizu vaskularnog pola (1. kvartil smanjen sa 11,5 na 4,9 posto kod starijih miševa, slika 4E ). Slično, uočeno je preferencijalno odvajanje podocita blizu vaskularnog pola kod izbrisanih podocita (anti-GBM, 1. kvartil smanjen sa 25 na 5 posto).

Diskusija

U ovoj studiji ispitali smo akutne efekte povišenog filtracijskog tlaka i protoka filtracije na gubitak podocita u izoliranom perfuziranom mišjem bubregu, koristeći trenutno najprecizniju metodu za određivanje broja podocita. Prvi veliki nalaz naše studije bio je da zdravi podociti nisu podložni akutnom naprezanju smicanja in vivo, kao što su prethodno predložile studije ćelijske kulture [11]. Na naše iznenađenje, čak ni ekstremni suprafiziološki pritisci (više od 450 mmHg) nisu izazvali značajno odvajanje podocita. Umjesto toga, transmisiona elektronska mikroskopija je pokazala da su sva tri sloja filtracijske barijere ostala relativno dobro očuvana. Stariji miševi su pokazali smanjeni broj podocita (kao što je ranije objavljeno) i to je bilo povezano sa vrlo ograničenom povećanom osjetljivošću na visoke perfuzijske pritiske. Drugi veliki nalaz je da je prethodna povreda podocita učinila podocite podložnim odvajanju pri visokim perfuzionim pritiscima. Anti-GBM miševi su pokazali globalno brisanje procesa na stopalima tri dana nakon injekcije anti-GBM antiseruma i značajan broj odvajanja pri visokim perfuzionim pritiscima. Kod starijih miševa pretpostavljamo da je fiziologija podocita relativno dobro očuvana, što ih čini manje podložnim odvajanju. Primjenom pristupa poluautomatskog brojanja svaki glomerul je analiziran zasebno (ukupno analizirano 1200 glomerula). Potvrdili smo da jukstamedularni glomeruli imaju veći volumen od subkortikalnih glomerula. Zanimljivo je da je broj podocita bio isti, što pokazuje da je gustina podocita smanjena u jukstamedularnim glomerulima. Osim toga, jukstamedularni glomeruli su također bili osjetljiviji na povećan pritisak filtracije u odnosu na subkortikalne glomerule. Ovi nalazi mogu delimično da objasne zašto se FSGS lezije mogu uočiti sa višom učestalošću u tako većim glomerulima [22, 23].

Slika 4. Detekcija podocita u susednom proksu. tubul. (A) Reprezentativna slika koja prikazuje eGFP plus podocite (zelene) u tubulima. (B) Imunofluorescentno bojenje podocita ko-obilježenih transgenom histonom eGFP (zeleno) i endogenim markerima podocita p57 (crveno), wt-1 (crveno) i sinaptopodinom (ljubičasto). (C) Povezanost broja podocita po glomerulu sa brojem podocita identificiranih u tubulu (n=81 glomerula od kontrolnih miševa, n= 41 glomerula od ostarjelih miševa i n= 81 glomerula anti GBM miševa). Za višestruka poređenja korištena je ANOVA. ****P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

Ograničenje ove studije je kratak period posmatranja, jer se ne mogu doneti zaključci u vezi sa dugotrajnom adaptacijom podocita na povećane filtracione pritiske. Predloženo je da je prvi odgovor podocita izloženih naprezanju smicanja podvrgnuti zaštitnim strukturnim promjenama [8, 24]. Ove promjene uključuju gubitak filtracionih proreza (tj. FPE) i zamjenu dijafragmi s prorezom začepljenim ili čvrstim spojevima. Okluzijski spojevi su prethodno opisani u nekoliko modela glomerularnih bolesti [25-28]. Međutim, u našoj studiji primijetili smo da su podociti sa FPE podložniji višim perfuzionim= pritiscima. Stoga su naši rezultati pokazali da ove adaptivne promjene nisu bile dovoljne za zaštitu od odvajanja ili potencijalno čak suprotno, da čine podocite podložnijima odvajanju. Dalje, može se tvrditi da je izolovano prokrvljenobubregnije fiziološki sistem i da su primijenjeni pritisci bili mnogo veći nego u uslovima in vivo. Prema našim saznanjima, nijedan drugi model koji koristi netaknutu održivostbubregpostoji što bi omogućilo direktno istraživanje efekata povećanih perfuzijskih pritisaka. Primjenom vazodilatatora prije i za vrijeme perfuzije postiže se maksimalna dilatacija preglomerularnih žila kako bi se omogućio neograničeni protok (hiperfiltracija) i maksimalni prijenos povećanih perfuzijskih pritisaka u glomerul. U ovoj studiji proučavani su akutni efekti viših perfuzijskih pritisaka. Dugoročni učinci patološke hiperperfuzije mogu biti štetniji, što dovodi do još većeg gubitka podocita. Međutim, naša studija sugerira da ovaj kronični gubitak podocita nije vođen čistom silom protoka filtracije per se, već mnogo prije (mal-)adaptivnim promjenama u podocitima koje smanjuju njihovu prianjanje na GBM. Pacijenti s glomerularnim bolestima imaju koristi od antihipertenzivnog liječenja sprječavanjem (mal-)adaptivnih strukturnih promjena podocita.

Zaključak

Ovaj rad pruža prvi in ​​vivo dokaz da su zdravi podociti izuzetno čvrsto vezani za GBM u zdravim bubrezima miša i mogu izdržati čak i vrlo visoke perfuzijske pritiske. Starenje ili još izraženija akutna povreda podocita sa globalnim brisanjem, čini podocite podložnim odvajanju pri povećanim perfuzionim pritiscima.