Obacunone ublažava fibrozu jetre uz pojačavanje antioksidativnih efekata GPx-4 i inhibicije EMT-a

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Obacunone, limonin triterpenoid ekstrahiran iz biljke Phellodendronchinense Schneid ili Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, izaziva niz farmakoloških učinaka kao što su protuupalni, anti-neoplastični, antioksidativni i protiv fibroze pluća. Međutim, antifibrozni učinak oba-konusa i detaljan osnovni mehanizam u fibrozi jetre ostaju nejasni. Fibroza jetre je iscrpljujuća bolest koja prijeti ljudskom zdravlju. Transformirajući faktor rasta (TGF)-/P-Smad je glavni put fibroze karakteriziran epitelno-mezenhimskim transformacijama (EMT) i taloženjem kolagena, praćeno prekomjernim radikalima bez kisika. Nrf-2 djeluje kao ključni antioksidativni regulator koji pokreće ekspresiju različitih gena povezanih s antioksidansima. Glutation peroksidaza-4(GPx-4) je član porodice glutation peroksidaze koja direktno inhibira oksidaciju fosfolipida radi ublažavanja oksidativnog stresa. U ovoj studiji, imali smo za cilj da istražimo ulogu kičme u modelu fibroze mišje jetre izazvane ugljen-tetrahloridom (CCl4) i u zvezdastim ćelijama jetre (LX2 ćelijska linija) izazvanim TGF-. Obacunone je pokazao snažne meliorativne efekte na fibrozu jetre i u aktiviranom LX2 i u tkivima jetre miševa sa smanjenim nivoima -SMA, kolagena1 i vimentina. Obacunone je takođe značajno potisnuo TGF-/P-Smad signale i EMT proces. U međuvremenu, obacunone je pokazao snažan antioksidacijski učinak smanjenjem nivoa reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) u oba modela. Antioksidativni efekat kičme pripisuje se aktivaciji GPx-4 i Nrf-2. Pored toga, terapeutski efekat kičme na LX2 ćelije je značajno uklonjen in vitro plus sa GPx-4 antagonistom RSL3, paralelno sa ponovnim povišenim nivoima ROS.puritanski vitamin cDakle, pokazujemo da je kičma u stanju da ublaži fibrozu jetre pojačavanjem GPx-4 signala i inhibicijom TGF-/P-Smad putanje i EMT procesa.

Ključne riječi:kičma; fibroza jetre; EMT; zvjezdane ćelije jetre; GPx-4;TGF- ;oksidativni stres

Molimo kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Hronični hepatitis je obično uzrokovan virusnim hepatitisom, nealkoholnom steatozom, alkoholnim hepatitisom i autoimunim hepatitisom. Trajna ozljeda jetre može završiti fibrozom jetre, ili čak rakom jetre, što je fatalno utjecalo na zdravlje ljudi [1]. Fibroza jetre je vrsta odgovora koji ne zacjeljuje ranu pod kontinuiranim faktorima ozljede koju karakterizira pretjerano nakupljanje ekstracelularnog matriksa (ECM) i formiranje ožiljaka [2]. Zvezdaste ćelije jetre (HSC) su obično u stanju mirovanja u normalnim uslovima, postale su aberantno aktivirane pod hroničnom povredom jetre i odlikuju se visokom proliferacijom i sekrecijom ECM [3], označene kao miofibroblasti [4]. Razumijevanje mehanizma aktivacije HSC je od velike vrijednosti za razvoj novih terapeutika za liječenje fibroze jetre.

Transformirajući faktor rasta (TGF- ) potiče upalne odgovore stimulirajući ekspresiju interleukina-1 (IL-1) i interleukina-6(IL-6) u monocitima [5]. Štaviše, on indukuje metastaze raka putem epitelno-mezenhimalne transformacije (EMT) i imunog bijega tumora [6-8]. EMT se odnosi na dinamički fiziološki proces u kojem epitelne stanice gube svoj polaritet i transformiraju se u mezenhimske stanice kao što su fibroblasti i miofibroblasti, što dovodi do razvoja fibroze [9]. Pojava EMT-a je uvijek povezana sa smanjenjem regulacije E-kadherina i povećanjem regulacije mezenhimskih ćelijskih markera, kao što su N-kadherin i puž[10]. TGF- -Smad aktivacija je jedan od glavnih intracelularnih puteva u EMT-u, kao i formiranju miofibroblasta [11].

Oksidativni stres se smatra jednim od primarnih uzroka fibroze sa prekomjernom proizvodnjom reaktivnih vrsta kisika (ROS)[12]. Visok nivo ROS-a uzrokuje strukturno oštećenje biomolekula, kao što su proteini, lipidi i DNK, što na kraju dovodi do oštećenja stanica i promicanja fibroze [13]. Pod oksidativnim stresom, dimer Nrf-2-Keep-1 se disocira, nuklearni respiratorni faktor-2(Nrf-2) se transportuje u jezgro i izaziva ekspresiju različitih antioksidativni enzimi vezivanjem sa elementima antioksidativnog odgovora (ARE) smanjuju nivoe ROS[14]. Glutation peroksidaza-4 (GPx-4) ​​djeluje kao antioksidativni protein s aktivnošću glutation peroksidaze, uglavnom je odgovoran za inhibiciju oksidacije fosfolipida i proizvodnju ROS u procesu feroptoze [15].sistancheStudije na miševima su pokazale da se fibroza pogoršava nakon gubitka Nrf-2 ili GPx-4 [16,17].

Cistanche može protiv starenja

Trenutno je dostupno nekoliko lijekova za liječenje fibroze jetre, uključujući one sa svojstvima anti-inflamacije [18], antioksidansa [19] i agonista receptora aktiviranih proliferatorom peroksizoma (PPAR) [20]. U nedavnoj studiji, prof. Yu je otkrio da pacijenti sa cirozom jetre imaju viši nivo oksidacije lipida u poređenju sa zdravim kontrolama u kliničkim uzorcima [21]. Nekoliko antioksidativnih lijekova kao što su resveratrol[19] i ursolna kiselina |13] pokazali su dobre efekte na fibrozu. Ovi dokazi kumulativno sugeriraju da je antioksidacija obećavajuća strategija za liječenje antifibroze.

Pirfenidon (PFD) je piridinski lijek za idiopatsku plućnu fibrozu (IPF), a u više studija pokazuje i dobar terapeutski učinak na fibrozu jetre [22,23]. Stoga je PFD odabran kao lijek pozitivne kontrole u ovoj studiji. Obacunone (Oba) je prirodni limonoidni spoj ekstrahiran iz biljaka rutacea kao što su Phellodendri i Dictamnus-dasycarpus [24], koji posjeduju različita biološka svojstva kao što su protuupalna |25, antioksidativna [26] i antitumorska [27]. Nedavni izvještaji su otkrili da je Oba snažan Nrf-2 agonist, koji je efikasno ublažio fibrozu pluća indukcijom CCL4 i oksidativnim oštećenjem MDA-MB-231 ćelija uzrokovanim H, O2. Što je još važnije, Oba nije otrovna za miševe [28]. Međutim, nisu prijavljeni nikakvi izvještaji o učinku Oba na fibrozu jetre, posebno o GPx-4 posredovanju anti-fosfolipidne oksidacije, TGF- -Smad signalima i EMT procesu. Ovdje namjeravamo istražiti efekte Oba na fibrozu jetre i definirati osnovne molekularne mehanizme.

2. Rezultati

2.1. Oba je inhibirala TGF- -indukovanu Lx-2 aktivaciju

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Zanimljivo je da se s povećanom koncentracijom Oba, efekat inhibicije a-SMA nije značajno povećao (Slika 1B).šta je cistancheStoga smo za sljedeći eksperiment odabrali koncentraciju od 20 μM, pri čemu je PFD služio kao pozitivna kontrola. Oba je efikasno inhibirala nivoe proteina -SMA, kolagena-1, vimentina i faktora rasta vezivnog tkiva (CTGF) (Slika 1C), u aHSC[3,4]. Pored toga, Oba je smanjio nivoe ekspresije mRNA -SMA, kolagena-1 i vimentina (slika 1D). Rezultati imunofluorescencije su dalje potvrdili da su pozitivni signali bojenja -SMA očito smanjeni od strane Oba (u odnosu na one u TGF- grupi, jer je broj crvenih krvnih zrnaca smanjen nakon tretmana Oba) u Lx-2(Slika 1E). Ovi rezultati sugeriraju da Oba ima dobar inhibicijski efekat na aktivaciju Lx{13}}.

2.2.Oba inhibirao TGF-/Smad signale, EMT proces i ispoljio antiinflamatorni efekat

Da bi se definisali molekularni mehanizmi koji leže u osnovi gore navedenih efekata anti-fibroze, primećeni su nivoi ekspresije proteina TGF-receptora, P-Smad i -SMA, koje je Oba značajno inhibirao u aHSC (slika 2A). Osim toga, protein nivoi ekspresije N-kadherina i puževa su smanjeni, dok je povećan nivo ekspresije proteina E-kadherina (Slika 2B), što ukazuje da je i EMT put bio blokiran [3]. Osim toga, otkrili smo da Oba izaziva smanjeni nivo IL-6(Slika 2C).Cistanche protiv starenjaDa bismo dalje procijenili učinak Oba na upalu, prvo smo stimulirali ćelije HepG-2 (vrsta ćelijske linije humanog hepatocelularnog karcinoma) sa 20 nmol CCl4, nakon čega je uslijedio tretman sa 20 uM Oba. Ovi rezultati su pokazali da Oba može smanjiti nivoe ekspresije mRNA i proteina IL-6 u CCl4-stimuliranom HepG-2(slika 2D). U cjelini, oba je pokazala višestruke efekte protiv fibroze inhibiranjem TGF-/Smad signala i EMT procesa, kao i antiinflamatorno.

2.3. Efekat Oba protiv fibroze zavisio je od poboljšanog antioksidativnog kapaciteta aktivacijom GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 μM, vitalnost ćelije Lx-2 je značajno smanjena; stoga, 0.75-μM RLS je odabran da interveniše u ekspresiji GPx-4. Western blot rezultati su pokazali da kada je RSL3 dodat u aHSC, ekspresija GPx-4 proteina je smanjena i svi profibrotski markeri uključujući -SMA i vimentin su značajno obrnuti, što ukazuje na važnost GPx-4 u posredovanju antifibroznih efekata Oba (Slika 3D). U međuvremenu, Oba je očigledno smanjila nivo ROS aHSC pomoću ROS fluorescentnih detektora, a ovaj efekat je očigledno blokirao RSL3 (slika). Ovi podaci ukazuju da je niži nivo fosfolipida ROS posredovan GPx-4 bio glavni antifibroza signal Oba.

2.4. Oba ublažava CCl4-indukovanu fibrozu jetre miša

CCl4-indukovana fibroza jetre jedan je od najčešće korištenih mišjih modela za proučavanje fibroze jetre [3]. Na histološkom nivou Oba je značajno ublažila patologiju jetre, o čemu svjedoče poboljšane taloženje kolagena naznačeno Massonovim bojenjem i anti-SMA bojenjem. (Slika 4A-D). Zatim su određeni serumski nivoi alanin transaminaze (ALT)/aspartat transaminaze (AST) da bi se testirali nivoi oštećenja jetre, u poređenju sa miševima CCL4, grupa Oba sa niskim dozama i grupa PFD značajno su smanjile nivoe ALT (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba je poboljšao ekspresiju GPx-4, smanjio upalu, ekspresiju proteina povezanu sa EMT i smanjio nivoe oksidacije lipida u fibrozi jetre izazvanoj CCl4-

Kao što je prikazano na slici 5A, Oba je inhibirao ekspresiju proteina IL-6 i pojavu EMT-a u fibroznoj jetri miševa sa smanjenim nivoima puževa i N-kadherina, ali višim nivoima E-kadherina. Osim toga, ekspresija proteina Nrf-2 i GPx-4 je očigledno povećana nakon tretmana srednjim i visokim dozama Oba (Slika 5B).cistanche benefíciosRezultati imunohistohemijskog bojenja (IHC) pokazali su da je u poređenju sa modelnom grupom, broj GPx-4 pozitivnih ćelija (smeđih) u grupama sa visokim i srednjim dozama Oba značajno povećan (Slika 5C, E). Zatim smo testirali nivoe oksidativnog stresa u jetri miševa i otkrili da je, u poređenju sa kontrolom, intenzitet fluorescencije ROS u modelnoj grupi bio očigledno veći. S druge strane, nivo ROS je značajno smanjen nakon tretmana Oba (Slika 5D, F).

3. Diskusija

Fibroza je intimna bolest u svijetu. Bez obzira na etiologiju, uključujući virusnu infekciju, alkoholni ili nealkoholni hepatitis i autoimune odgovore, svi završavaju fibrozom zbog kronične ozljede jetre [1]. Aktivacija HSC je centralni događaj koji leži u osnovi fibroze jetre. HSC se aktiviraju aberantnom produkcijom raznih fibrogenih faktora i ECM taloženjima [2,3]. Izvještava se da su TGF- -povezana kanonska Smad aktivacijska signalizacija, EMT proces kao i hronična upala povezana s IL-6-om uključeni u gore navedene procese [3,4]. Kako bismo procijenili antifibrozne efekte Oba na fibrozu jetre, prvo se fokusiramo na definiranje njegovih efekata na aktivaciju Lx-2 izazvane TGF-om, a zatim na provjeru njegovih in vivo antifibroznih efekata korištenjem CCl{12}}indukovana fibroza jetre model miševa na kraju.

Oba je prirodni limonoidni spoj [24] i njegovi biološki efekti uglavnom uključuju protuupalne [25], antioksidativne [26] i antitumorske [27] funkcije. Nedavno je otkriveno da je Oba snažan i efikasan Nrf-2 agonist i da ima efekte protiv plućne fibroze kod miševa [28]. Međutim, još uvijek nedostaju dokazi o njegovim učincima protiv fibroze jetre i povezanim molekularnim mehanizmima. Ovdje je Oba inhibirana prekomjerna ekspresija -SMA, kolagena 1 i CTGF-a u modelima Lx{13}} stimuliranim TGF-. Oba je takođe efikasno potisnuta poboljšanu EMT signalizaciju.

Potvrđeno je da je oksidativni stres važan faktor koji doprinosi fibrozi [12]. Reaktivne kisikove vrste (ROS) je krovni naziv za oksidirane molekule ili ione s biološkom aktivnošću i prekomjerna proizvodnja različitih ROS u hepatocitima može dovesti do njegove smrti i izazvati fibrozu jetre [13]. Naprotiv, HSC u mirovanju se aktiviraju nakon povrede ćelija jetre i prekomerni ROS pojačava više aktivacije HSC i završava fibrozom jetre [12]. Stoga, ublažavanje pretjeranog oksidativnog stresa postaje efikasan tretman za fibrozu.

Nrf-2 je kritični regulator antioksidativnog stresa, aktivirani fosforilirani Nrf-2 se translocira u jezgro kako bi pokrenuo regulaciju nizvodnih antioksidativnih proteina, GST, HO1[15]. Mnogi prirodni hemijski aktivatori Nrf2 poseduju efekte protiv fibroze, kao što su terc-butilhidrokinon i kurkumin. Među svim antioksidativnim proteinima, glutation peroksidaza-4(GPx-4) je član porodice glutation peroksidaze (GPx1-8) i olakšava redoks ravnotežu smanjenjem glutationa [ 30-32]. Dokazano je da veća ekspresija glutation peroksidaze-7 inhibira nealkoholnu masnu bolest jetre smanjujući proizvodnju ROS-a [33]. GPx-4 je smanjio fosfolipidni peroksid na lipidnoj membrani kako bi zaštitio ćelije od oksidativne povredeJ15]. Kazuya Tsubouchi i dr. otkrili da je ekspresija GPx-4 smanjena u tkivima fibroze pluća kod miša izazvanih bleomicinom, a fibroza je teža kada je GPx-4 gen nokautiran. Osim toga, lipidna peroksidacija i TGF-/P-Smad put su značajno pojačani u fibroblastima pluća kada je GPx-4 gen iscrpljen [17]. Nedavno je više dokaza podržalo da su ROS izvedeni iz fosfolipida uključeni u posebnu ćelijsku smrt, nazvanu feroptoza. GPx-4 inhibitor, RSL3, takođe se primenjuje kao induktor feroptoze [21,34].

U našim eksperimentima smo otkrili da Oba ispoljava antioksidativni kapacitet tako što je regulisao Nrf-2 i GPx-4 naviše i smanjio Nox-2. Primetno je da je efekat Oba protiv fibroze značajno oslabljen kada je GPx-4 gen inhibirao RSL3, inhibitor GPx-4. Dosljedno, smanjeni nivo ROS-a oba tretmanom je također osvijetljen. Ova in vitro zapažanja su u velikoj mjeri potvrdila da su antifosfolipidni ROS posredovani GPx-4- ključnim za zaštitne efekte Oba.

Da bi se potvrdili gore navedeni rezultati tretmana Oba protiv fibroze u LX2 ćelijama, ispitana je i fibroza jetre miševa izazvana CCl4-. CCl4 je vrsta hepatotropnog otrova, razgradnjom posredovanom mikrosomalnim enzimom P450, proizvedeni su visoko reaktivni slobodni radikali koji uništavaju integritet ćelijske membrane, zauzvrat, izazivajući niz disfunkcije i ozljeda jetre, koji na kraju evoluiraju u fibrozu jetre [35]. U našem eksperimentu Oba je pokazala dobre kurativne efekte na fibrozu jetre izazvanu CCl. Ublažio je oštećenje jetre nižim nivoom AST, površina snopova kolagenih vlakana je postala manja, a ekspresija proteina a-SMA, CTGF, kolagena-1, puža, N-kadherina i IL{{10 }} su svi smanjeni. Dok su antioksidativna signalizacija, ekspresija proteina Nrf-2 i GPx-4 također bila povišena, viši nivoi ROS-a su opali. Ovi rezultati su dodatno potvrdili in vitro efekte antifibroze Oba i srodnu signalizaciju, posebno inhibiciju EMT i antioksidativnih efekata Nrf-2 i GPx-4.

Ukratko, zaključili smo da je Oba ublažio TGF- -indukovanu aktivaciju HSC i CCl{1}}indukovanu fibrozu jetre kroz različite mehanizme. Prvo, Oba je inhibirala klasični TGF-/Smad put, EMT i IL-6 proizvodnju. Drugo, pokazao je odličan antioksidativni kapacitet pojačavajući ekspresije Nrf-2 i GPx-4. GPx-4posredovani antifosfolipidni ROS su uglavnom doprinijeli njegovim antifibroznim efektima. Stoga, Oba može poslužiti kao kandidat za hemijski regent za prevenciju i liječenje fibroze.

Oba je pokazala određeni efekat izlječenja na CCl{0}}indukovanu fibrozu jetre kod C57 miševa. Oba je mogla smanjiti ekspresiju proteinskih biomarkera fibroze, kao što su: -SMA, CTGF, itd. U međuvremenu, Oba je smanjio ekspresiju proteina I-6, E-kadherina, itd. Zanimljivo je da Mid-Oba pokazuje znake boljih ishoda u odnosu na low-Oba i high-Oba u smislu relativne ekspresije ovih proteina, iako to nije statistički značajno. Međutim, pokazalo je da bi optimalna doza mogla biti kritičan faktor u ovom procesu, a mi ćemo istražiti ovaj fenomen u sljedećem eksperimentu. Štaviše, otkrili smo da je niži ROS i stepen fibroze jetre sa povećanom ekspresijom Nrf-2 i GPx-4. Dakle, vjerujemo da bi Oba mogao ublažiti fibrozu jetre regulacijom Nrf-2 i GPx-4. Međutim, PFD bi mogao imati bolje terapeutsko djelovanje od Oba i in vivo i vitro. Međutim, Oba je bila bolja od PFD-a po antioksidativnom dejstvu, doprinosi povećanju mogućnosti pronalaženja novog lijeka za anti-jetreno-fibrogeno djelovanje sa antioksidativne strane, te da malo doprinosi zdravlju ljudi.

4. Materijali i metode

4.1. Hemikalije i reagensi

Oba (br. B20553, čistoća veća ili jednaka 98 posto) i RSL3 (br. S81241, čistoća veća ili jednaka 98 posto) su kupljeni od YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Šangaj, Kina) i raspušteni u dimetil sulfoksidu (DMSO) (br. R21950; YUANYE) do koncentracije od 72,64 mg/mL i 6 mmol, respektivno. Nakon sterilizacije filterom, dobijeni rastvor je sačuvan na -20 stepeni C. Otopina je dodata u medijum kulture da se postigne konačna koncentracija DMSO od<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Ćelijske kulture i eksperimentalni dizajn

Ljudska jetrena zvjezdasta ćelijska linija Lx-2 i ćelijska linija raka jetre kod ljudi Hepg-2 (sve potiču sa Odsjeka za farmaciju, Četvrti vojno-medicinski univerzitet, Kina) uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom mediju orla ( DMEM) dopunjen sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 1 posto penicilina (Thermo Fisher Scientific) i streptomicinom (Thermo Fisher Scientific), a zatim održavan na 37 C u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 i 95 posto zraka. Da bi se procijenio učinak Oba na vitalnost Lx-2 ćelija, Lx-2 je postavljen sa 1×10* ćelija/jažici u 96-jažicu i inkubiran 24 h prije dodavanja od Oba. Zatim su Lx-2 tretirani različitim koncentracijama Oba (10,20, 40,80 i 160 wM i kultivisani 24,48 ili 72 h. Vijabilnost ćelija je testiran od strane CCK8. Da bi se procenio efekat Oba na aktivaciju Lx-2, Lx-2 je prethodno kultivisan u medijumu bez seruma 12 h, nakon čega je usledila stimulacija sa TGF- (10 ng/mL, 24 h) i tretman sa Oba ili PFD. Da bi se procijenio učinak Oba na upalu, Hepg-2 je stimuliran sa CCl4 (20 nm, 8 h) i tretiran sa 20 μM Oba. Na kraju kulture, ćelije su sakupljene i podvrgnute Western blotting i qPCR analiza u realnom vremenu.

4.3. Životinje i eksperimentalni dizajn

Mužjaci C57 miševa težine 20± 0,5 g (Centar za laboratorijske životinje Četvrtog vojno-medicinskog univerziteta) smješteni su u odgovarajućim uslovima temperature od 25 stepeni ± 2 stepena i ciklusa svjetlo/mrak 12- h sa slobodan pristup vodi i hrani. Svaki eksperiment u ovoj studiji izveden je u skladu sa protokolima odobrenim od strane Komiteta za brigu o životinjama Četvrtog vojnog medicinskog univerziteta. C57 miševi su nasumično raspoređeni u 6 grupa (n=6 u svakoj grupi) kako slijedi: i) lažna kontrolna grupa, i) grupa modela, ii) grupa sa visokim sadržajem Oba (CCl4 plus 6 mg/kg Oba),io )srednje Oba grupa (CCl4 plus 3 mg/kg Oba）, ø）nisko-Oba grupa (CCl4 plus 1,5 mg/kg Oba) i vi） PFD grupa (CCl4＋ PFD). Grupa modela je tretirana CCl4 (30 postotak CCl4/maslinovo ulje, 5 mL/kg intraperitonealne injekcije) tri puta sedmično tokom 6-nedeljnog perioda da bi se izazvala fibroza jetre. Ostale grupe su hranjene različitim dozama Oba ili PFD i jednakim količinama CCil4 intraperitonealne infekcije za 6-nedeljni period. Jednaka količina maslinovog ulja umesto CCl4 je davana C57 od strane ipas lažne kontrole. Svaki eksperiment u ovom članku izveden je u skladu sa protokolima odobrenim od strane Četvrtog komiteta za životinje Vojnomedicinskog univerziteta Care.

4.4. Western blotting

C57 jetre ili kultivisane ćelije su homogenizovane ili lizirane u RIPA puferu korišćenjem aparata za preklapanje tkiva ili struganjem ćelija (Servis, KZ-2). Koncentracija proteina je mjerena korištenjem BCA Protein Assay Kit. Lizat je centrifugiran (4 stepena, 12,000 o/min, 5 min), a supernatant je sakupljen. Operativni koraci su praćeni kao što je prethodno objavljeno [14]. Uzorci su skenirani pod hemiluminiscentnim sistemom za snimanje i analizu (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. qPCR analiza u realnom vremenu

C57 jetre ili kultivisane ćelije su homogenizovane ili lizirane u Trizol reagensu uz pomoć aparata za preklapanje tkiva da bi se ekstrahovala ukupna RNK. Ukupna RNK je reverzno transkribirana u cDNK korištenjem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit. -aktin je korišten za internu referencu. RT-qPCR je izveden na 7500 qPCR sistemu u realnom vremenu (Applied Biosystems) sa SYBR Premix Ex Taq reagensima. Prajmeri korišćenih ljudskih gena navedeni su u tabeli 1.

Ovaj članak je preuzet iz Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules