Nove vakcine zasnovane na rekombinantnom virusu Newcastle bolesti zaobilaze imunitet majke kako bi pružile potpunu zaštitu od ranog virulentnog izazova, 1. dio

sažetak:

Newcastle bolest (ND) je jedna od ekonomski najvažnijih bolesti peradi. Uprkos intenzivnim naporima sa trenutnim programima vakcinacije, ova bolest se i dalje javlja širom svijeta, uzrokujući značajnu smrtnost čak i kod vakcinisanih jata. Ovo se djelimično pripisuje nedostatku imuniteta tokom perioda nakon izleganja zbog prisustva majčinih antitijela koja negativno utječu na replikaciju uobičajeno korištenih živih vakcina. In ovo vakcine imaju višestruke prednosti i predstavljaju priliku za rješavanje ovog problema.

Trenutno se koriste vakcine protiv ovo ND vakcine sa rekombinantnim herpesvirusom purana (HVT) vektorske vakcine koje eksprimiraju antigene virusa Newcastle bolesti (NDV). Iako su dokazano efikasne, ove vakcine imaju neka ograničenja, kao što su odgođena imunogenost i nemogućnost primjene druge HVT vakcine nakon izleganja. Upotreba živih ND vakcina za in-ovo vakcinaciju trenutno nije primjenjiva, jer su one povezane sa visokom smrtnošću embriona. U ovoj studiji, rekombinantne NDV-vektorske eksperimentalne vakcine koje sadrže antisens sekvencu ptičjeg interleukina 4 (IL4R) i njihove okosnice davane su in ovo u različitim dozama u 18-dnevna komercijalna jaja koja posjeduju visoke titre majčinih antitijela. Izležene ptice su bile izazvane virulentnim NDV u dobi od 2 sedmice. Oslobađanje vakcine nakon vađenja, preživljavanje nakon izazivanja, izlučivanje virusa izazvanog izazovom i humoralni imuni odgovori procenjeni su u više vremenskih tačaka. Ptice vakcinisane rekombinantnim NDV (rNDV) imale su značajno smanjenu smrtnost nakon izleganja u poređenju sa divljim tipom LaSota vakcine.

Sve rNDV vakcine su bile u stanju da prodru u imunitet majke i izazovu snažan rani humoralni imuni odgovor. Nadalje, rNDV vakcine su zaštitile od kliničke bolesti i značajno smanjile izlučivanje virusa nakon ranog virulentnog izazivanja NDV dvije sedmice nakon izleganja. Titri antitijela na hemaglutinaciju-inhibiciju nakon izazivanja u vakcinisanim grupama ostali su uporedivi sa titrima prije izazivanja, što ukazuje na kapacitet proučavanih vakcina da spriječe efikasnu replikaciju virusa izazivanja. Preživljavanje nakon vađenja nakon vakcinacije vakcinama rNDV-IL4R ovisilo je o dozi, s povećanjem preživljavanja kako se doza smanjivala. Ovo poboljšano preživljavanje i podaci o dozi sugeriraju da nove atenuirane in ovo vakcine zasnovane na rNDV-u koje mogu prodrijeti u imunitet majke i izazvati jak imuni odgovor već 14 dana nakon izleganja, što rezultira visokom ili potpunom zaštitom od virulentnog izazova, pokazuju obećavaju kao doprinos kontroli Njukaslske bolesti.

Osim vakcinacije ljudi, ljudi mogu uzimati i hranu i suplemente. Cistanche sadrži razne hemijske supstance, kao što su polisaharidi, steroidi, alkaloidi, flavonoidi, itd. Ove supstance imaju značajnu ulogu u regulaciji imunog sistema. Među njima, polisaharidi mogu promovirati aktivaciju i proliferaciju imunoloških stanica i povećati imunitet tijela; steroidi mogu regulirati funkciju imunoloških stanica i pojačati imunološki odgovor; alkaloidi i flavonoidi mogu se oduprijeti oksidaciji, djeluju protuupalno, antibakterijski i dodatno poboljšati imunitet. Stoga, Cistanche ima značajan efekat regulacije imuniteta i može se koristiti kao zdrava hrana i lijek za poboljšanje imuniteta.

Kliknite na zdravstvene prednosti cistanchea

1. Uvod

Newcastle bolest (ND), razorna bolest peradi koja može dostići 100 posto smrtnosti kod naivnih ptica, uzrokovana je virulentnim sojevima virusa Newcastle bolesti (NDV) [1]. Ova vrsta virusa nedavno preimenovana u Avian orthoavulavirus 1, član je porodice Paramyxoviridae [2,3]. Virusi Newcastle bolesti imaju jednolančani, nesegmentirani, RNA genom negativnog smisla koji kodira za najmanje šest strukturnih proteina (30—nukleoprotein [NP]—fosfoprotein [P]—matriksni protein [M]—fuzioni protein [F]— hemaglutinin-neuraminidaza [HN]—i velika RNA-polimeraza [L]—50) i sadrži jednu od tri veličine genoma (15.186, 15.192 i 15.198 nukleotida) [4,5]. Newcastle bolest se smatra trećom najvažnijom bolešću peradi u svijetu [6] i ostaje endemska u mnogim zemljama širom Azije, Afrike i Amerike [7].

Kontrola ND uključuje strogu biosigurnost kako bi se spriječilo unošenje virulentnog NDV (vNDV) na farme peradi [8,9] i pravilno davanje vakcina [10]. Međutim, višestruke epidemije ND koje se javljaju širom svijeta [11] sugeriraju da trenutne vakcine i procedure vakcinacije nisu u potpunosti učinkovite. Pored konvencionalnih živih i inaktiviranih vakcina, višestruki koncepti za vakcinaciju protiv ND istraženi su u posljednje dvije decenije, uključujući vektorski kompleks antigen-antitijelo, čestice nalik virusu i ligandske vakcine sličnih receptoru, između ostalog [1, 8,9]. Nekoliko ptičjih vakcina, dizajniranih za koekspresiju imunostimulirajućih citokina, također je predloženo za poboljšanje zaštitnog imuniteta [12]. Drugi pristup koji je istražen je upotreba antigenski usklađenih vakcina. Iako se svi NDV smatraju pripadnicima jednog serotipa [3,13], postoji antigenska varijacija između sojeva [14]. Prethodne studije s pilićima različite dobi pokazale su da pilići cijepljeni sojevima koji su antigenski podudarni sa virusom izazivanja izlučuju značajno manju količinu izazovnog vNDV od količine koju izlučuju pilići cijepljeni heterolognim vakcinama [15–17]. Treba napomenuti da pasivno prenesena majčinska anti-NDV antitela, iako štite piliće tokom ključnih prvih nedelja života, ometaju razvoj imuniteta domaćina nakon vakcinacije [18].

In ovo vakcinacija je pristup koji donosi višestruke prednosti – na primjer, značajno smanjenje troškova, standardizacija, masovna primjena cjepiva, automatizirana vakcinacija u klijalištu, ujednačena isporuka vakcine u svakom jajetu i bez stresa za ptice [19–21] – i atraktivna je metoda imunizacije za peradsku industriju [22]. Između 80 i 90 posto brojlerskih pilića koji se uzgajaju u SAD trenutno je ovo vakcinisano dva do tri dana prije izleganja [23,24], a automatizacija procesa omogućava do 70,000 jaja biti vakcinisan na sat [23].

Globalno, ova metoda primjene vakcine se primjenjuje u 26 od 30 vodećih zemalja u proizvodnji peradi u svijetu [23]. Trenutno je dostupno nekoliko in-ovo vakcina protiv ND, ali su sve generirane korištenjem ne-NDV vektora. Pokazalo se da vektorske vakcine bazirane na virusu boginja ptica (FPV) koje eksprimiraju NDV F i HN proteine ​​primijenjene in ovo štite živinu od izazova s ​​vNDV [25,26].

Međutim, rekombinantne FPV-ND vakcine nisu u širokoj upotrebi zbog imunoloških smetnji od prethodnih FPV vakcinacija ili izloženosti (FPV je obično prisutan u okruženju) i nedostatka optimizacije za primenu putem masovnih metoda [9]. Najrasprostranjeniji vektor za proizvodnju rekombinantne ND in ovo vakcine je Meleagrid alphaherpesvirus 1, poznatiji kao herpesvirus purana (HVT) ili serotip 3 virus Marekove bolesti [12,23]. Samo u SAD-u je 2018. proizvedeno 8,2 milijarde doza rekombinantnih HVT (rHVT)-ND vakcina u poređenju sa 3,6 milijardi doza konvencionalnih vakcina protiv ND [27].

Pored prednosti upotrebe in ovo, rHVT vakcine koje eksprimiraju NDV proteine ​​izazivaju jak i dugotrajan imunitet nakon jedne aplikacije [28]. Nadalje, na njih prolazno utiče prisustvo anti-NDV majčinskih antitela [8]. Međutim, rHVT-ND vakcine imaju neka ograničenja, kao što je odloženi imunitet, a čini se da je prethodna vakcinacija protiv HVT otporna na upotrebu dopunskih vakcina protiv HVT kod istih ptica [9,29]. Vakcine protiv HV-a su povezane sa ćelijama i moraju se skladištiti i transportovati u tečnom azotu, što predstavlja ograničenje za njihovu upotrebu u mnogim zemljama.

Izgledi za novim in ovo vakcinama rastu [23]. Različiti vektori su istraženi za in-ovo put primjene, a obećavajući rezultati su prijavljeni s nereplicirajućim humanim adenovirusom-[30] i alfavirus-vektorskim vakcinama [31]. Iako nije bilo napretka u rutinskoj komercijalnoj upotrebi, uloženi su i napori za razvoj novih in ovo ne-HVT NDV vakcina [32–35]. Primjena živih ND vakcina u ovo je izazov. Dok žive ND vakcine, kao što su LaSota, B1, Clone 30 i Ulster, da spomenemo samo neke, daju snažan imuni odgovor i obično se koriste za vakcinaciju pilića starih samo jedan dan, one su povezane sa visokom smrtnošću embriona kada primijenjen na 18 dana nacije embriona. Smrtnost od čak 100 posto korištenjem divljeg tipa niskovirulentnih virusa i 80 posto korištenjem genetski atenuiranih živih virusa zabilježena je nakon in-ovo upotrebe, a za ovu metodu primjene vakcine trenutno se ne koriste žive ND vakcine [36,37] .

Nova eksperimentalna vakcina sa vektorskom rekombinantnom NDV (rNDV) koja sadrži antisens ptičji interleukin 4 inserte (IL4), nazvan ZJ1*l-IL4R, nedavno se pokazala obećavajućim kandidatom za in ovo vakcinu nakon evaluacije bez specifičnih patogena (SPF). ) embrionirana kokošja jaja (ECE) [38]. Ova studija imala je za cilj daljnju procjenu primjenjivosti ove rekombinantne NDV-vektorske vakcine i njene rekombinantne okosnice (oslabljeno mjesto cijepanja od virusa divljeg tipa) i rekombinantnog LaSota-IL4R virusa za in-ovo vakcinaciju 18-dan komercijalna jaja s visokim titrom majčinih antitijela. Komercijalno dostupne vakcine LaSota i rHVT-ND uključene su kao kontrole. Pored toga, ova studija je imala za cilj da proceni zaštitnu efikasnost proučavanih vakcina protiv ranih izazova sa vNDV. Ovdje je demonstrirana sposobnost ovih rekombinantnih vakcina da efikasno savladaju imunitet majke, čak iu malim dozama, i da izazovu jak imuni odgovor. Eksperimentalne rNDV vakcine pokazale su 100 posto zaštitu nakon ranih izazova s ​​vNDV.

2. Materijali i metode

2.1. Virusi

Virulentna guska/Kina/ZJ1/2000 (ZJ1, GenBank pristupni broj AF431744) NDV, član pod-genotipa VII.1.1 (bivši VIId), korišten je kao izazovni virus u ovoj studiji. Rekombinantni ZJ1 virus (atenuirana verzija ZJ1) s nisko virulentnim mjestom cijepanja (ZJ1*L) koji je prethodno generiran u našoj laboratoriji putem reverzne genetike [39] korišten je kao okosnica za stvaranje rekombinantnih ZJ1*L vakcina i kao vakcina virus. LaSota (LS) vakcinalni soj niske virulentnosti korišten je kao kontrola vakcine i kao okosnica za stvaranje rekombinantne LS-IL4R vakcine. Svi virusi su dobijeni iz skladišta Southeast Poultry Research Laboratory (SEPRL) Nacionalnog centra za peradarstvo Sjedinjenih Država (USNPRC), američkog Ministarstva poljoprivrede (USDA). Dodatno, komercijalno dostupna rHVT-ND vakcina (umetak fuzionog gena) je također korištena kao kontrola.

Rekombinantne NDV eksperimentalne vakcine korišćene u ovoj studiji stvorene su korišćenjem reverzne genetike, kao što je prethodno opisano [38,39]. Ukratko, kodirajuća sekvenca ptičjeg IL4 klonirana je u okosnicu ZJ1*L i LS u obrnutoj orijentaciji (IL4R) između P i M gena, generirajući dva rekombinantna oslabljena živa virusa – naime, ZJ1*L-IL4R i LS- IL4R (GenBank pristupni brojevi MM680659 i MM680665, respektivno). Rekombinantni virusi su spašeni korištenjem modificiranog virusa vakcinije Ankara koji eksprimira T7 polimerazu (MVA/T7), slijedeći prethodno objavljene protokole [38–41]. Šematski prikaz konstrukcija je dat na dodatnoj slici S1A. Za potrebe ovog rada, termin "DV vakcine" korišćen u daljem tekstu odnosi se na ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R i LS-IL4R.

Radne zalihe svih NDV su razmnožene u {{0}} na 11-dnevna SPF embrionirana kokošja jaja (ECE) [42]. Virusne zalihe korištene za inokulaciju jaja u ovoj studiji razrijeđene su u bujonu infuzije mozga (BHI) (BD Biosciences, MD, SAD), koja sadrži 200 µg/mL gentamicina, 2{{22} }00 U/mL penicilina i 4 µg/mL amfotericina B, na tri različita ciljna titra, 105,5/0,1 mL, 104,5/0,1 mL i 103,5/0,1 mL embrion zarazne doze (EID50) , koji je razrijeđen na 105,5/0,1 mL i 104,5/0,1 mL EID50. Titri razrijeđenih radnih zaliha živih vakcina potvrđeni su povratnim titracijama u 9- do 11-dan starim SPF ECE prema standardnim procedurama, kako je gore navedeno. Vakcina rHVT-ND je direktno razrijeđena korištenjem razrjeđivača saharoza fosfat glutamat albumina za rHVT vakcine opisane u Centru za veterinarske biološke testove pri USDA [43].

2.2. Jaja

Dvjesto šezdeset i dva komercijalna (ne-SPF) jaja iz jata neslica rase Hy-Line Rockside W-36 (Mansfield, GA, SAD) ljubazno su donirana za ovaj eksperiment. Jato nesilica je rutinski vakcinisano LaSota vakcinom. Imunitet jata je redovno testiran ELISA-om, i iako se ovi rezultati ne mogu direktno prevesti u titre hemaglutinacije-inhibicije (HI), prosječni nivoi anti-NDV antitijela roditeljskog jata bili su vrlo visoki (tj. 15.534 sa graničnom vrijednosti za pozitivno uzoraka od 1159). Izvor SPF ECEs (42 jaja) bilo je SEPRL SPF jato bijelog leghorna. Sva jaja su inkubirana na temperaturi od 37,5 ◦C i relativnoj vlažnosti od 55-60 procenata tokom 18 dana.

2.3. Vakcinacija

Komercijalna (n {{{{10}}}}) i SPF (n=42) jaja, nakon 18 dana embrioniranja (DOE), podijeljena su u 14 grupa sa 21 jajetom u svakoj grupa (osim BHI i Hatch kontrolnih grupa, koje su imale po 26 jaja). Koristeći špriceve od 1 mL, 24 G × 1/2, svako jaje je inokulirano u alantoičnu šupljinu sa 0.1 mL razrijeđene vakcine ili BHI, osim u kontrolnoj grupi Hatch, u kojoj se jajima nije manipulisalo na sve. Bilo je trinaest grupa inokulisanih jaja, podeljenih u sedam eksperimentalnih i šest kontrolnih grupa. Sedam eksperimentalnih grupa je bilo kako slijedi: ZJ1*L-IL4R 104,5, ZJ1*L-IL4R 105,5, LS-IL4R 103,5, LS-IL4R 104,5, LS-IL4R 105,5, ZJ1*L 104,5, i svaka ZJ15. odgovarajuću dozu EID50 inokuluma po 0,1 mL kako je navedeno u nazivu grupe. Dodatno je formirano šest kontrolnih grupa. Dvije kontrolne grupe komercijalnih jaja su inokulirane kao što je gore opisano sa BHI i rHVT-ND, respektivno. Dvije kontrolne grupe komercijalnih jaja su inokulirane kao što je gore opisano sa LS 104.5 i LS 105.5 EID50 dozom inokuluma po 0.1 mL. Dve kontrolne grupe SPF jaja su inokulisane sa ZJ1*L 103.5 i ZJ1*L-IL4R 103.5. Šematski prikaz dizajna studije dat je na dodatnoj slici S1B, C.

Nakon inokulacije, jaja su stavljena u Turbofan Hova-Bator inkubatore (GQF Manufacturing Company Inc., GA, SAD) koji su naknadno stavljeni u izolatore u objektu nivoa biosigurnosti životinja 2 (ABSL-2). Inkubatori su regulirani termostatima da održavaju konstantnu temperaturu od 37,5 ◦C i relativnu vlažnost između 55 i 60 posto.

2.4. Izležavanje, uzorkovanje, mortalitet

Nakon izleganja u 21 DOE, pilići su smješteni u izolatore negativnog tlaka (ABSL-2) i davali im hranu i vodu s pristupom ad libitum. Pet ne-SPF pilića iz kontrolne i BHI grupe žrtvovano je i iskrvavljeno odmah nakon izleganja da bi se ustanovio osnovni titar majčinih anti-NDV HI antitijela. Svi pilići su izvagani 1, 8 i 13 dana nakon izleganja (DPH). Orofaringealni i kloakalni brisevi su sakupljeni u BHI od svake ptice na 2 i 4 DPH. Klinički znakovi i mortalitet zabilježeni su dva puta dnevno tokom perioda nakon izleganja, a uzorci krvi su uzeti na 13 DPH.

2.5. Challenge

Dvanaest jedinki iz svake grupe (osim LS 1{{10}}5.5, u kojem su sve ptice umrle do 6 DPH) prebačeno je u ABSL-3E objekat u 13 DPH. Ptice su stavljene u izolatore sa negativnim pritiskom i ostavljene da se aklimatiziraju 24 h prije izazova. Sve ptice su izazvane na 14 DPH sa virulentnim ZJ1 NDV na 106 EID50/0,1 mL okulo-nazalnim putem. Ptice su svakodnevno posmatrane zbog kliničkih znakova i mortaliteta. Orofaringealni i kloakalni brisevi su sakupljeni od svake ptice 2 i 4 dana nakon izazivanja (DPC). Sve preživjele ptice su izvagane i iskrvavljene na 14 DPC i eutanazirane su dislokacijom grlića materice nakon anestezije sa 0,2 mL otopine ketamina/ksilazina (66 mg/mL ketamina i 6,6 mg/mL ksilazina) primijenjene intramuskularno sa {{2uge need}.

2.6. RT-PCR u realnom vremenu

RNK je ekstrahirana iz svih podloga za bris koristeći MagMAX 96 AI/ND komplet za izolaciju virusne RNK (Ambion, Inc. Austin, TX, SAD) s KingFisher procesorom magnetnih čestica (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) prema uputama proizvođača , uz modifikaciju uklanjanja inhibitora koju su opisali Das et al. [44]. Kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu (rRT-PCR) za NDV detekciju ciljajući na matriks (M) gen izveden je korištenjem AgPath-ID jednostepenog RT-PCR kompleta (Ambion) i ABI 750{{31 }} Brzi PCR sistem u realnom vremenu (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) koji koristi prajmere i sondu koje su prethodno opisali Wise et al. [45]. Uslovi analize su bili reverzna transkripcija u trajanju od 10 min na 45 ◦C; početna denaturacija u trajanju od 10 min na 95 ◦C; 40 ciklusa denaturacije po 10 sekundi na 94 ◦C, žarenje prajmera 30 sekundi na 56 ◦C i izduženje prajmera 10 sekundi na 72 ◦C. Ukupni reakcioni volumen od 25 µL za svaki uzorak sastojao se od vode molekularnog kvaliteta – 2,5 µL; 2X pufer—12,5 µL; prednji prajmer—0,25 µL (20 pmol/µL); reverzni prajmer—0,25 µL (20 pmol/µL); sonda—0,50 µL (6 pmol/µL); 25X mešavina enzima—1,0 µL; i RNA šablon— 8,0 µL. Za kvantifikaciju virusa, uspostavljena je standardna krivulja za svaki virus, s RNA ekstrahiranom iz iste titrirane zalihe virusa koja se koristi za inokulaciju jaja (za uzorke brisa prikupljenih nakon valjenja) ili virusa izazvanog izazovom (za uzorke brisa prikupljenih nakon vađenja). -izazov).

Rezultati su prijavljeni kao EID50/mL. Izračunata donja granica detekcije testova bila je između 101,7 i 101,9 EID50/mL. Važno je napomenuti da rRTPCR otkriva virusne nukleinske kiseline i da procijenjene vrijednosti ne predstavljaju nužno infektivne viruse. Vrijednosti EID50/mL nemaju za cilj predstavljanje infektivnosti i koriste se da obezbijede sredstva za relativno poređenje širenja virusa između grupa. Uprkos korištenju protokola ekstrakcije nukleinskih kiselina za uklanjanje inhibitora, veliki volumen RNA šablona je možda uticao na proračune iz standardne krive. Treba napomenuti da je ista količina RNK šablona korištena u svim reakcijama, a potencijalni inhibitori rezidua bi podjednako utjecali na sve rezultate.

2.7. HI Assay

Test inhibicije hemaglutinacije (HI) korišten je za procjenu prisutnosti i titara antitijela u uzorcima seruma prikupljenim tokom eksperimenta. Prateći standardne procedure [46], virus koji je korišten kao okosnica za svaku vakcinu korišten je kao antigen za svaku odgovarajuću grupu seruma (ZJ1*L za sve ZJ1 grupe i LS za sve LS grupe). Za uzorke seruma prikupljene nakon izazivanja, virulentni ZJ1 virus je korišten kao antigen u HI testu. Titri su izračunati kao recipročna vrijednost posljednjeg HI-pozitivnog razrjeđenja seruma, a uzorci sa HI titrima log2 3 i ispod smatrani su negativnim.

2.8. Statističke analize

Za analizu podataka korišten je softver Prism v.7.03 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornija, SAD), a odstupnici su identificirani korištenjem ROUT testa. D'Agostino-Pearsonov test normalnosti je urađen kako bi se procijenilo da li vrijednosti u svakoj grupi dolaze iz Gaussove distribucije. Na osnovu distribucije normalnosti, za višestruka poređenja između grupa korišten je neparametarski Kruskal-Volisov test sa Dunnovim post-testom. Za statističke svrhe, svim uzorcima briseva iz kojih virusi nisu otkriveni data je numerička vrijednost od 1 log ispod granice detekcije za svaki virus. Krivulje preživljavanja analizirane su pomoću Log-rank (Mantel–Cox) testa. Statistička značajnost je postavljena na p-vrijednost < 0,05.

3. Rezultati

3.1. Izležavanje, preživljavanje nakon izleganja i tjelesne težine

Preživljavanje nakon izleganja za sve grupe izvaljene iz komercijalnih jaja prikazano je kao krivulje preživljavanja na slici 1 (odvojeno na slikama 1A i B radi jasnoće i izbjegavanja zagušenja grafike). Kombinovani grafikon je dostupan na dodatnoj slici S2. Kontrolna grupa izleganja (nije inokulirana) uključena je u dizajn kako bi se osiguralo da ne postoji abnormalna valivost ili smrtnost nakon valjenja koja nije povezana sa inokulacijom jaja.

Kao što se očekivalo, vrlo niska (rHVT-ND) do nikakva (Hatch i BHI) smrtnost nakon izleganja uočena je u tri kontrolne grupe. Nasuprot tome, LS kontrolne grupe su imale 57,1 posto i 0 posto preživljavanja kada su korištene doze od 104,5 odnosno 105,5, što je ranije prijavljeno za konvencionalne ND žive vakcine. Dva jaja se nisu izlegla u grupi LS-IL4R 105.5, a jedno jaje se nije izleglo u grupi LS 104.5. Promjenjiv mortalitet uočen je u ostalim grupama u zavisnosti od vakcine i doze inokulacije. Grupe ZJ1*L-IL4R 104,5 i 105,5 imale su 90,5 posto i 71,4 posto preživljavanja, respektivno, a preživljavanje zabilježeno u grupama ZJ1*L 104,5 i 105,5 bilo je 80,9 posto i 76,2 posto, respektivno), ali razlika je bila nije statistički značajno. Preživljavanje u grupi LS-IL4R 103,5 bilo je 95,2 posto. Stope preživljavanja uočene u grupama LS-IL4R 104,5 i 105,5 bile su 85,7 posto i 66,7 posto, respektivno (Slika 1B).

Nije bilo značajnih razlika u preživljavanju između eksperimentalnih grupa vakcinisanih ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R i LS-IL4R i kontrolnih grupa Hatch, BHI i rHVT-ND, ali je postotak preživljavanja u ovim kontrolnim grupama bio brojčano veći. , s uočenom negativnom korelacijom između doze vakcine i preživljavanja nakon izleganja (preživljavanje se povećavalo kako se doza vakcine smanjivala). Kontrolna grupa LS 1{{10}}5,5 imala je značajne razlike u preživljavanju u poređenju sa eksperimentalnim grupama (p vrijednosti između 0.0001 i 0,02). Kontrolna grupa LS 104,5, iako nije statistički različita, imala je znatno niže stope preživljavanja u poređenju sa eksperimentalnim grupama sa istom dozom. Dvije LS kontrolne grupe imale su značajne razlike u preživljavanju u poređenju sa kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND (p vrijednosti između 0,0001 i 0,04). Klinički znaci nisu uočeni ni u jednoj grupi nakon izleganja. U grupama u kojima je postojao mortalitet nakon izleganja, ptice su pronađene mrtve svakodnevnim kontrolama.

Sve ptice su izvagane 1., 8. i 13. dana nakon izleganja (Tabela 1). Na 1 DPH, prosječna tjelesna težina po jedinki u većini grupa bila je između 38,5 i 42,6 grama (g). Postojale su značajne razlike u tjelesnoj težini samo između rHVT-ND i ZJ1*L-IL4R 104,5 grupa s jedne strane i ZJ1*L 104,5 i kontrolne LS 1{{4{{42} }}}4,5 od drugog (ptice u dvije prve grupe bile su teže od ptica u kontrolnoj grupi) (p vrijednosti između 0.0001 i 0,017, respektivno). Na 8 DPH, dvije ZJ1*L grupe i LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5 grupa i kontrolna LS grupa (prosječna težina 50-63 g) imale su tjelesnu težinu značajno nižu u odnosu na ptice iz Hatcha, BHI i rHVT-ND kontrolne grupe (prosječna težina 77–82 g) (p vrijednosti između 0,0001 i 0,03). Iste grupe koje su se značajno razlikovale od kontrola na 8 DPH (osim LS-IL4R 104,5) imale su značajno nižu tjelesnu težinu od kontrolnih Hatch, BHI i rHVT-ND grupa sa 13 DPH (p vrijednosti između 0,0001 i 0,01). Ptice iz inokuliranih SPF kontrolnih grupa nisu uključene u ovo poređenje, jer su SPF jaja (i ptice izlegle iz njih) tradicionalno manja i lakša od komercijalnih jaja.

Slika 1. Preživljavanje pilića nakon izleganja nakon inokulacije komercijalnih jaja na 18 dana embrionalne nacije eksperimentalnim in ovo NDV vakcinama. Hy-Line Rockside W-36 jaja su inokulirana rekombinantnim virusima i LaSota. Tri kontrolne grupe su inokulirane BHI ili rHVT-ND vakcinom, ili nisu bile inokulirane (Hatch kontrolna grupa). Ptice su praćene 13 dana nakon izleganja. Krivulje preživljavanja su prikazane na dvije slike: (A) kontrolne grupe i ZJ1*L grupe i (B) kontrolne grupe i LS-IL4R grupe. Različita nadnaslovna slova ukazuju na statistički značajne razlike između grupa (p-vrijednost < 0.05). Skraćenice grupa: HATCH—jaja nisu inokulirana; BHI—jaja inokulirana sa BHI; rHVT-ND—jaja inokulirana rekombinantnom HVT vakcinom; ZJ1*L—jaja inokulirana rekombinantnim ZJ1*L virusom čije je mjesto cijepanja modificirano da bude niske virulencije; ZJ1*L-IL4R—jaja inokulirana sa rekombinantnim nisko virulentnim ZJ1*L sa interleukin-4 genom umetnutim u obrnutoj orijentaciji; LS—jaja inokulirana sojem LaSota; LS-IL4R—jaja inokulirana rekombinantnim LaSota virusom sa genom za interleukin-4 umetnutim u obrnutoj orijentaciji. Doza virusa koju su jaja u svakoj grupi primila je predstavljena kao broj iza naziva grupe u EID50/po jajetu.

Tabela 1. Srednje težine (i standardne devijacije) pilića 1, 8 i 13 dana nakon izleganja nakon inokulacije komercijalnih jaja na 18 dana embrionalne nacije s eksperimentalnim in ovo vakcinama i 14 dana nakon izazivanja virulentne Newcastle bolesti virus.

3.2. Izbacivanje vakcinalnih virusa nakon vakcinacije, kao što je demonstrirano rRT-PCR

Kod 2 DPH, nije bilo značajnih razlika u izlučivanju virusa među grupama vakcinisanih. (Slika 2A). Slično, kod 4 DPH, razlike između grupa nisu bile statistički značajne. (Slika 2B). Ni kod jedne kontrolne ptice Hatch i BHI nije otkriveno izlučivanje virusa.

Slika 2. Prosječno izlučivanje vakcine nakon valjenja od pilića izleženih iz komercijalnih jaja inokuliranih 18 dana od embrionalne nacije s eksperimentalnim in ovo vakcinama. Svaka tačka podataka predstavlja jednu pticu i titre NDV otkrivene u orofaringealnim (OP) i kloakalnim (CL) brisevima u različitim danima nakon izleganja (DPH). Linjanje je prikazano odvojeno za 2 dana nakon izleganja (A) i 4 dana nakon izleganja (B). Stupci predstavljaju standardne devijacije srednje vrijednosti. Svim brisevima iz kojih virus nije otkriven je data numerička vrijednost od 1 log ispod granice detekcije za svaki od odgovarajućih virusa. Granica detekcije rRT-PCR prikazana je kao horizontalna isprekidana linija (koristi se najniža granica). Skraćenice grupa: HATCH—jaja nisu inokulirana; BHI—jaja inokulirana sa BHI; rHVT-ND—jaja inokulirana rekombinantnom HVT vakcinom; ZJ1*L—jaja inokulirana rekombinantnim ZJ1*L virusom čije je mjesto cijepanja modificirano da bude niske virulencije; ZJ1*L-IL4R—jaja inokulirana sa rekombinantnim nisko virulentnim ZJ1*L sa interleukin-4 genom umetnutim u obrnutoj orijentaciji; LS—jaja inokulirana sojem LaSota; LS-IL4R—jaja inokulirana rekombinantnim LaSota virusom sa genom za interleukin-4 umetnutim u obrnutoj orijentaciji. Doza virusa koju su jaja u svakoj grupi primila je predstavljena kao broj iza naziva grupe u EID50/po jajetu.

3.3. Humoralni imunološki odgovor nakon izleganja

Analiza uzoraka seruma prikupljenih na 13 DPH (dijagonalne pruge ispunjene šipkama) HI testom (detekcija hemaglutinacijskih antitijela na NDV) prikazana je na slici 3. Da bi se ustanovio titar pasivno prenesenih anti-NDV majčinih HI antitijela u komercijalnim jajima, deset pilićima je puštena krv odmah nakon izleganja (0 DPH). HI titri pri izranjavanju varirali su između log2 5 i log2 8, sa prosjekom log2 7.17 (Slika 3, isprekidana horizontalna crvena linija). Antitijela na 13 DPH u grupama Hatch, BHI i rHVT-ND (prosjek log2 4.7) su rezidualna majčinska antitijela, jer ove grupe ili nisu bile vakcinisane ili su vakcinisane rHVT-ND vakcinom, što čini ne indukuju HI antitela na NDV. Titri antitela u grupama ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R i LS 104.5 bili su značajno viši u poređenju sa kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND. Nisu uočene značajne razlike između različitih doznih grupa vakcina sa istom kičmom. Grupe LS-IL4R imale su niže titre HI nakon vakcinacije u poređenju sa grupama ZJ1*L-IL4R i ZJ1*L, iako ove razlike nisu bile statistički značajne. Treba napomenuti, iako su brojčano nešto veći, titri HI nakon vakcinacije ptica u svim LS-IL4R grupama nisu se značajno razlikovali od titara izmjerenih kod kontrolnih nevakcinisanih ptica.

Slika 3. Titri HI antitijela prije i nakon izazivanja (i standardna devijacija) od pilića izvaljenih iz komercijalnih jaja inokuliranih 18 dana od embrionalne nacije s eksperimentalnim in ovo vakcinama i ranim izazovom virulentnog virusa Newcastle bolesti 14 dana nakon izleganja. Dijagonalne pruge ispunjene trakama predstavljaju titre prije izazivanja 13 dana nakon izleganja. Čvrsto popunjene trake predstavljaju titre nakon izazivanja 14 dana nakon izazivanja. Statistički značajne razlike između različitih grupa prikazane su malim slovima iznad svake grupe (p-vrijednost<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Klinički znakovi i preživljavanje nakon ranog izazova s ​​CDV-om

U kontrolnim grupama, prvi klinički znaci koji su uočeni bili su u grupama Hatch i BHI na 3 DPC. Tri ptice u grupi Hatch i jedna ptica u BHI grupi su imale otežano disanje. Na 4 DPC, naborano perje i podrhtavanje glave su viđeni u BHI i hatch grupama, a na 5 DPC u rHVT-ND grupi; u potonjoj grupi, ataksija i teški tortikolis su također zabilježeni kod dvije ptice. Ptice u Hatch kontrolnoj grupi su pokazale letargiju na 5 DPC, a dvije ptice u BHI grupi pokazale su paralizu. Letargija i paraliza su uočeni u rHVT-ND grupi na 6 i 7 DPC. Opisthotonos, tortikolis i otežano disanje uočeni su u kontrolnim grupama Hatch i BHI počevši od 9 DPC. U rHVT-ND grupi, tortikolis je uočen već sa 5 DPC, otežano disanje i ataksija su počeli sa 6 DPC, a opisthotonos je počeo sa 13 DPC. Do 14 DPC, sve ptice osim dvije Hatch, jedne BHI i dvije rHVT-ND ptice (83,3 posto, 91,6 posto, odnosno 83,3 posto morbiditeta) su ili uginule ili su razvile pretežno neurološke kliničke znakove kao što su ataksija, opistotonus, tremor , i paralizira. Ptice koje su pokazivale ozbiljne kliničke znakove, prestale jesti ili piti, ili su ostale ležati, eutanazirane su i prijavljene kao mrtve sljedećeg dana radi izračunavanja vremena preživljavanja. Nisu uočeni nikakvi klinički znaci ni u jednoj od grupa ZJ1*L i ZJ1*L-IL4R. Blagi klinički znaci opistotonosa ili tortikolisa uočeni su kod jedne ptice (8,4 posto morbiditeta) u svakoj od LS-IL4R grupa i LS 104,5 grupi na 14 DPC.

Preživljavanje nakon izazivanja virulentnog ZJ1 NDV prikazano je kao krivulje preživljavanja na slici 4. Dok su sve grupe inokulirane rekombinantnim vakcinama i LS pokazale 100 posto preživljavanja, ptice u grupama Hatch, BHI i rHVT-ND imale su 58,3 posto, 58,3 posto, odnosno 66,6 posto preživljavanja. Preživljavanje nakon izazova u kontrolnim grupama Hatch i BHI bilo je značajno niže u poređenju sa eksperimentalnim vakcinalnim grupama. Treba napomenuti, iako je tjelesna težina ptica u inokuliranim grupama fluktuirala nakon izleganja u poređenju sa kontrolama Hatch, BHI i rHVT-ND, sve rNDV vakcinisane ptice (282–328 g) premašile su tjelesnu težinu nevakcinisanih kontrolne ptice nakon izazova (255–266 g) (Tabela 1). Međutim, nije uočena značajna razlika u tjelesnoj težini između bilo koje od ispitivanih grupa.

Slika 4. Preživljavanje pilića nakon inokulacije komercijalnih jaja 18 dana od embrionalne nacije s eksperimentalnim in ovo vakcinama i ranog izazivanja virulentnog virusa Newcastle bolesti 14 dana nakon izleganja. Ptice su praćene 14 dana nakon izazivanja. Različita nadnaslovna slova ukazuju na statistički značajne razlike između grupa (p-vrijednost < 0.05). Skraćenice grupa: HATCH—jaja nisu inokulirana; BHI—jaja inokulirana sa BHI; rHVT-ND—jaja inokulirana rekombinantnom HVT vakcinom; ZJ1*L—jaja inokulirana rekombinantnim ZJ1*L virusom čije je mjesto cijepanja modificirano da bude niske virulencije; ZJ1*L-IL4R—jaja inokulirana sa rekombinantnim nisko virulentnim ZJ1*L sa interleukin-4 genom umetnutim u obrnutoj orijentaciji; LS—jaja inokulirana sojem LaSota; LS-IL4R—jaja inokulirana rekombinantnim LaSota virusom sa genom za interleukin{19}} umetnutim u obrnutoj orijentaciji. Doza virusa koju su jaja u svakoj grupi primila je predstavljena kao broj iza naziva grupe u EID50/po jajetu.

3.5. Odbacivanje nakon izazova kao što je demonstrirano rRT-PCR

Na 2 DPC, ptice u kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND ispuštale su visoke titre virusa (1{{20}}5,3-5,7 EID50/mL) oralnim putem, dok su sve grupe vakcinisane imao niži od 104 EID50/mL srednjih titara izlučivanja (Slika 5A). Rezultati za širenje virusa kroz kloaku bili su ispod granice detekcije testa u svim grupama. Na 2 DPC, ptice u svim ZJ1*L i ZJ1*L-IL4R grupama i one u grupi LS-IL4R 105.5 imale su značajno manje virusne RNK otkrivene oralnim putem u poređenju sa kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND (p vrijednosti su se kretale između 0,001 i 0,02). Na 4 DPC, izlučivanje oralnim putem u grupama Hatch, BHI i rHVT-ND je bilo visoko (106,2-6,9 EID50/mL) (Slika 5B).

Nasuprot tome, manje izlučivanje je uočeno u svim grupama vakcina pri 4 DPC u poređenju sa 2 DPC, sa najvišim srednjim titrom od 102,9 EID50/mL u ZJ1*L 104,5 grupi i najnižim srednjim titrom od 101,5 EID50/mL u ZJ1* l-IL4R 104.5 grupa (virusna RNK nije otkrivena kod nekih ptica). Sve eksperimentalne grupe vakcine protiv rNDV ispuštaju značajno manje virusa oralnim putem u poređenju sa kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND (p vrijednosti od<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Slika 5. Prosječno izlučivanje virusa nakon izazivanja iz pilića nakon inokulacije komercijalnih jaja 18 dana od pojave embriona eksperimentalnim in ovo vakcinama i ranog izazivanja virulentnog virusa Newcastle bolesti 14 dana nakon izleganja. Svaka tačka podataka predstavlja titre NDV otkrivene u orofaringealnim (OP) i kloakalnim (CL) brisevima u različitim danima nakon izazivanja (DPC). Linjanje je prikazano odvojeno za 2 dana nakon izazivanja (A) i 4 dana nakon izazivanja (B). Stupci predstavljaju standardne devijacije srednje vrijednosti. Svim brisevima iz kojih virus nije otkriven je data numerička vrijednost od 1 log ispod granice detekcije. Granica detekcije rRT-PCR predstavljena je kao horizontalna isprekidana linija.

Statistički značajne razlike između različitih grupa prikazane su malim slovima iznad svake grupe (p-vrijednost < 0.05). Skraćenice grupa: HATCH—jaja nisu inokulirana; BHI—jaja inokulirana sa BHI; rHVT-ND—jaja inokulirana rekombinantnom HVT vakcinom; ZJ1*L—jaja inokulirana rekombinantnim ZJ1*L virusom čije je mjesto cijepanja modificirano da bude niske virulencije; ZJ1*L-IL4R—jaja inokulirana sa rekombinantnim nisko virulentnim ZJ1*L sa interleukin-4 genom umetnutim u obrnutoj orijentaciji; LS—jaja inokulirana sojem LaSota; LS-IL4R—jaja inokulirana rekombinantnim LaSota virusom sa genom za interleukin-4 umetnutim u obrnutoj orijentaciji. Doza virusa koju su jaja u svakoj grupi primila je predstavljena kao broj iza naziva grupe u EID50/po jajetu.

3.6. Serologija nakon izazova

Sve ptice u kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND pokazale su povećane (više nego duplo) titre HI-antitijela na 14 DPC (iznad log2 10) u poređenju sa titrima prije izazivanja na 13 DPH (log{ {6}}.7). Razlike u titrima u ove tri grupe pre i posle izazivanja bile su značajne (p-vrednost<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Inokulirane SPF kontrolne grupe

Preživljavanje u SPF kontrolnim grupama nakon izleganja bilo je 66,7 posto u grupi inokuliranoj sa ZJ1*L 103,5 i 57,1 posto u grupi inokuliranoj sa ZJ1*L-IL4R 103,5 (dodatna slika S3A). Aktivno izlučivanje virusa otkriveno je kod ptica u SPF kontrolnim grupama kroz oba puta, s višim titrima otkrivenim u uzorcima orofaringealnog brisa (vidi dodatnu sliku S3B). Titri HI nakon vakcinacije inokuliranih SPF kontrolnih ptica bili su veći od titara u kontrolnim grupama Hatch, BHI i rHVT-ND i dostigli su srednje vrijednosti log2 7.08 i log2 7. 58 na 13 DPH u grupama ZJ1*L-IL4R 103.5 i ZJ1*L-IL4R 103.5, respektivno (vidi dodatnu sliku S3C). U dvije inokulirane SPF kontrolne grupe nisu primijećeni nikakvi klinički znakovi ili smrtnost nakon izazivanja (pogledajte dodatnu sliku S3D za krivulje preživljavanja). Ptice iz inokuliranih SPF kontrolnih grupa su izbacile značajno manje virusa oralnim putem pri 2 DPC i 4 DPC u poređenju sa kontrolnim grupama (p vrijednosti od<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com