Nlrc3 nokaut miševi pokazali su bubrežne patološke promjene nakon infekcije HTNV-om

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hantaan virus (HTNV) inficira ljude i uzrokuje hemoragijsku groznicububrežnisindrom(HFRS). Razvoj dobro okarakteriziranih životinjskih modela HFRS mogao bi ubrzati testiranje kandidata za vakcinu i terapeutskih agenasa i pružiti koristan alat za proučavanje patogeneze HFRS. Budući da NLRC3 ima višestruku imunoregulatornu ulogu, istražili smo osjetljivost Nlrc3−/− miševa na HTNV infekciju kako bismo uspostavili novi model HFRS. Nlrc3−/− miševi su razvili gubitak težine,bubrežno krvarenje,i proširenje tubula nakon HTNV infekcije, rekapitulirajući mnoge kliničke simptome humanog HFRS-a. Štaviše, inficirani Nlrc3−/− miševi su pokazali veće virusno opterećenje u serumu, slezeni i bubrezima od divljeg tipa C57BL/6 (WT) miševa, a neki od njih su ispoljili više hematoloških poremećaja i značajnih patoloških promjena unutar više organa nego WT miševi. Naši rezultati identifikuju da HTNV inficirani Nlrc3−/− miševi mogu razviti kliničke simptome i patološke promjene koje liče na pacijente s HFRS, što sugerira novi model za proučavanje patogeneze i testiranje kandidatskih vakcina i terapeutika.

Ključne riječi:HFRS, HTNV, NLRC3, bubrežno krvarenje, proširenje bubrežnih tubula

UVOD

Hemoragijska groznica sabubrežnisindrom (HFRS) predstavlja akutnu intersticijsku nefropatiju nakon zoonotskog prijenosa hantavirusa sa glodara na ljude. Bolest se uglavnom javlja u Aziji i Evropi (1, 2). Najčešći patogeni koji uzrokuju HFRS su Dobrava virus (DOBV), Puumala virus (PUUV), Seoul virus (SEOV) i Hantaan virus (HTNV), od kojih svaki uzrokuje različitu težinu HFRS-a. Karakteristike bolesti su različite u Sjevernoj i Južnoj Americi, gdje hantavirusna infekcija uzrokuje hantavirusni plućni sindrom (HPS), uglavnom virusom Andes (ANDV) i Sin Nombre virusom (SNV) (3).

HFRS se javlja sa karakteristikama visoke temperature, hipotenzije,zatajenje bubrega i krvarenje(4). Može se podijeliti u pet kliničkih stadija: febrilni, hipotenzivni šok, oligurični, diuretički i rekonvalescentni. Akutna epizoda HTNV infekcije koja dovodi do HFRS-a često je praćena trombocitopenijom, leukocitozom, anemijom, povišenim serumskim kreatininom i jetrenim enzimima (5). Ovi klinički simptomi i znakovi se dijelom mogu objasniti činjenicom da HTNV uglavnom napada bubreg i izaziva ozljedu bubrega koju karakterizira akutni tubulointersticijski nefritis koji uključuje infiltraciju inflamatornih stanica (6), posljedično zahvaćajući više drugih organa (7)

Glodavci su prirodni rezervoari za hantaviruse koji uporno inficiraju životinje bez izazivanja bolesti (8). Njihovi izmet, kao što su pljuvačka, urin i izmet, postaju potencijalni zagađivači koji mogu zaraziti ljude koji udišu male čestice aerosola kontaminiranog izmeta. Hantavirusi generalno uzrokuju asimptomatsku infekciju kod odraslih miševa BALB/c i C57BL/6 (9), ali smrtonosnu neurološko oboljenje ili perzistentnu infekciju kod dojilja i novorođenih miševa (10, 11). Iako su nefropatske abnormalnosti pokazane kod eksperimentalno PUUV inficiranih makaki cynomolgus (Macaca fascicularis), ove životinje su pokazale samo blagu proteinuriju, infiltraciju imunoloških stanica i tubularna oštećenja bubrega, slično blagom slučaju HFRS (12). Osim toga, hrčci zaraženi HTNV nazalnim putem doveli su do trajne asimptomatske infekcije, koju karakterizira sporadična viremija, ali visoki nivoi kopija virusnog genoma u plućima, mozgu i bubrezima. Tvorovi zaraženi visokom dozom HTNV-a putem mišićne injekcije pokazali su postepeno smanjenje tjelesne težine (5-12 posto tokom vremena), ali netaknutobubrežne funkcije,odsustvo viremije i nedostatak prijenosa virusa na organe. Kod marmozeta, intramuskularna injekcija HTNV-a dovela je do visokog stepena serokonverzije i proizvodnje neutralizirajućih antitijela; dosljedno, ove životinje nisu imale oštećenje bubrega, viremiju ili prijenos virusa na organe (13).

Uprkos njihovoj nesavršenosti, životinjski modeli koji su koristili pacove i miševe intenzivno su korišteni za proučavanje patogeneze Hantavirusa (14). Yoshimatsu et al. pokazalo je da infekcija SCID miševa sa HTNV uzrokuje smrtonosnu bolest gubitka s plućnim edemom (15, 16), a smanjenje neutrofila sprječava razvoj plućnog edema, ali nisu nađene karakteristične hemoragijske lezije HFRS (15). Shimizu et al. otkrili da HTNV izolovan od HFRS pacijenata može intravenozno zaraziti 6-nedeljne ženke BALB/c miševa, uzrokujući viremiju tokom 6-9 dana, pokazujući znakove bolesti uključujući privremeni gubitak težine, bore na kosi, izlučivanje bubrega (17 ). U istom modelu miša, došlo je do makroskopskog krvarenja na granici izmeđukorteks bubregai medule, ali nije ispitano da li su uočene histopatološke promjene povezane sa smanjenom funkcijom bubrega. Kod humaniziranih miševa, HTNV infekcija dovodi do gubitka težine, smanjene aktivnosti, naboranog krzna i ozljede pluća, za koje se čini da su pluća glavni ciljni organ za virusnu infekciju (18). Stoga je i dalje potreban odgovarajući životinjski model infekcije HTNV-om koji obuhvata većinu karakteristika bolesti HFRS-a.

cistanche reviewszaproširenje bubrežnih tubula

NLR su najistaknutija porodica intracelularnih urođenih imunoloških receptora i služe divergentnim funkcijama u regulaciji urođenog imuniteta. Iako najpoznatiji NLR (npr. NLRP3) pokazuju pozitivnu regulatornu funkciju u inflamatornoj i imunološkoj aktivaciji, neobična podgrupa NLR, definirana kao inhibitorni NLR, pokazuje inhibitornu funkciju u upalnim odgovorima. Da bi se razumio mehanizam urođene imunološke supresije posredovane NLR, ispitani su ligandi za inhibitorne NLR kao što su NLRC3 i NLRX1 (19). NLRC3 je negativni regulator koji prigušuje odgovor interferona tipa I (IFN-I) sekvestrirajući i atenuirajući stimulator aktivacije interferonskih gena (STING) (19). NLRX1, kao centralni homeostatski čuvar između mitohondrijalne biologije i imunološkog odgovora, bio je upleten u širok spektar bolesti, kako uzrokovanih patogenima, tako i drugih (20). Budući da HTNV bolest manifestira dosta poremećaja regulacije upale i imunološke aktivacije, odabrali smo Nlrc3-/- miševe da istražimo molekularne mehanizme bolesti.

Ova studija je pokazala da model miševa Nlrc3−/− podseća na sistematsku povredu uočenu kod pacijenata sa HFRS, koju karakteriše trombocitopenija,proširenje bubrežnih tubula i krvarenje.Analiza virusnog opterećenja otkrila je da Nlrc3−/− miševi imaju veće virusno opterećenje u više tkiva, uključujući serum, slezinu i bubrege. Naše studije uspostavljaju mišji model za HTNV infekciju koristan za procjenu kandidatskih vakcina i terapeutika.

METODE

VVirus dionice

HTNV soj {{0}} je donirao Changshou Hang (Kineski centar za kontrolu i prevenciju bolesti), a zatim je sačuvan i proširen u našoj laboratoriji. Vero E6 ćelije su korištene za razmnožavanje virusa, a infektivni titri su kvantificirani korištenjem 50 postotne infektivne doze kulture tkiva (TCID50) imunofluorescentnim testovima (IFA). Konverzija između TCID50 i jedinica za formiranje plaka (PSU) zasnovana je na sljedećem proračunu: 1 PFU ≈0,7×TCID50 (21).

generacija modela Nlrc3 Knockout miša

Modele miševa divljeg tipa C57BL/6J i Nlrc3 knockout (Nlrc3−/−) miševa dizajnirao je i razvio Shanghai Model Organisms Center, Inc (Šangaj, Kina). Za dobijanje Nlrc3−/− miša, Cas9 mRNA i sgRNA su pripremljene in vitro transkripcijom. Dvije sgRNA ciljane na brisanje eksona 2-3 gena Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. Zigote C57BL/6J miševa su primljene i ubrizgane in vitro transkribovanom Cas9 mRNA i sgRNA i prebačene na pseudotrudnoće primaoce. Genotip dobijenih F0 miševa je identificiran i potvrđen PCR-om i sekvenciranjem koristeći parove prajmera: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. Ukrštanjem sa C57BL/6J miševima, odabrani su pozitivni F0 miševi za dobijanje F1 heterozigotnih Nlrc3 nokaut miševa. PCR i analiza sekvenciranja potvrdili su dobijene F1 miševe. Za dobijanje heterozigotnih miševa Nlrc3−/−, ženke i mužjaci F1 heterozigotnih miševa su nasumično ukršteni. Za sva istraživanja korišćeni su miševi starosti 6-8 nedelja.

Infekcija životinja i priprema uzoraka

Ukupno 5×105 PFU HTNV-a u 50 ul podloge inokulirano je intraperitonealnim putem. Miševi u kontrolnim grupama primali su identične količine PBS-a. Korišteno je dvadeset do dvadeset pet miševa Nlrc3−/− ili WT. Svaki tip miševa je podijeljen u pet grupa za uzorkovanje 0, 3, 6, 9 i 12 dana nakon infekcije. Tjelesna težina i analna temperatura bilježe se svakodnevno. U svakoj vremenskoj tački, četiri do pet životinja iz obe grupe je eutanazirano za testiranje. Za virološku analizu, uzeti su uzorci svježeg tkiva iz srca, jetre, slezene, pluća, bubrega i mozga, a zatim su odmah zamrznuti na -80 stepeni. Miševi su perfuzirani hladnim PBS, a organi su fiksirani u 4 posto paraformaldehida na 4 sata za histološku i imunohistohemijsku analizu. Uzorak krvi je uzet za testiranje virusnog opterećenja i rutinski pregled krvi, a serum je izolovan za biohemijsku analizu.

Cytokine Assay

Ukupno 25 mL seruma od svakog miša je analizirano na 13 različitih citokina pomoću LEGENDplex™ miša Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) prema uputstvima proizvođača. Za detekciju je korišten citometar FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, CA). Podaci su analizirani pomoću LEGENDplex v8.0. Softver.

RT-PCR test u realnom vremenu

Uzorci tkiva svakog miša su izvagani i uronjeni u PBS i homogenizovani pomoću automatizovanog homogenizatora-TissueLyser II (QIAGEN, Njemačka), koristeći frekvenciju 3{24}}/s i vrijeme 5 min. Za ukupnu ekstrakciju RNK, 200 mL homogenata tkiva prebačeno je u 500 mL TRIzol reagensa, nakon čega je uslijedila ekstrakcija hloroformom i taloženje izopropanolom. 140 mL uzoraka seruma je prebačeno u 560 mL AVL pufera koji sadrži RNK nosač (Qiagen, UK) za ekstrakciju RNK pomoću QIAamp Viral RNA Mini kita (Qiagen, UK). Konačno, RNK je ponovo rastvorena u vodi bez RNaze. HTNV specifičan RT-PCR test u realnom vremenu je izveden za detekciju virusne RNK iz svakog uzorka. Prajmerske sekvence specifično ciljane za HTNV s segment su usvojene na sljedeći način: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' i R-5'- TGATTCTTCCACCATTTGT-3'. One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Takara, Japan) je korišten za qRT-PCR test. Konačna glavna mješavina (20 mL) se sastojala od 2 mL RNK, 5,6 mL dH2O bez RNase, 0,8 mL prosljeđivanja i Reverse prajmera (10 mM), 0,8 mL PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2 i 10 mL One Step 2× TB Green RT-PCR pufer 4. Korišćeni uslovi ciklusa bili su 42 stepena tokom 5 minuta, 95 stepeni tokom 10 sekundi, a zatim je usledilo 40 ciklusa od 95 stepeni u trajanju od 0 sekundi, 65 stepeni tokom 15 sekundi i 95 stepeni tokom 0 sekundi. Reakcije su vođene i analizirane na platformi LightCycler (Roche Diagnostics, SAD).

Apsolutna kvantifikacija virusnog opterećenja

Oligonukleotidi virusne RNK kao standard RNK dobijeni su in-vitro transkripcijom iz DNK pomoću MAXIscript Kit-a (Thermo Scientific, UK), koji se sastojao od 562 baze HTNV RNK ciljane analizom (22), a zatim kvantificirane ultramikro mikropločom spektrofotometrom ( BioTek Epoch, SAD), koncentracija standardne RNK zalihe bila je 800 ng/mL. Za procjenu virusnog opterećenja u svakom uzorku, standardna RNK je pripremljena sa 10-strukim serijskim razrjeđenjem, u rasponu od 1010 kopija do 103 kopije po reakciji. Naša standardna RNK ima ograničenje detekcije od 1010 kopija do 101 kopija po reakciji, i stoga smo postavili prag detekcije za ovaj test na 100 kopija genoma po reakciji. Analiza u toku rada, standardne krive su uspostavljene sa nagibom od -3.6624, presekom Y od 41,68 ciklusa i R2 vrijednošću od 0,9996.

Analiza nivoa proteina Western blottingom

Lizati tkiva pripremljeni su od uzoraka mišjeg tkiva. Za detekciju koncentracije proteina korišten je komplet za analizu proteina bicinhoninske kiseline (BCA) (Thermo Scientific, UK). Za analizu proteina, 30 mg ukupnog proteina iz svakog uzorka je postavljeno na SDS-poliakrilamidni gel i prebačeno na NC membrane. Zatim je 5 postotna otopina obranog mlijeka korištena za blokiranje na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 sata. Zatim je dodano 1:1000 razrijeđeno monoklonsko antitijelo 1A8 protiv HTNV-NP (pripremljeno i pročišćeno u našoj laboratoriji) (23, 24) i inkubirano na 4 stepena preko noći. Konačno, membrane su inkubirane sa sekundarnim antitijelima, HRP-konjugiranim zečjim anti-mišjim IgG ili HRP-konjugiranim mišjim anti-zečjim IgG na sobnoj temperaturi 2 sata. Zatim je dodat hemiluminiscentni supstrat HRP da bi se detektovali proteini. Denzitometrijska analiza intenziteta proteinskih traka izvršena je korišćenjem softvera Image J (NIH, SAD). b-aktin je korišten kao kontrola opterećenja za normalizaciju.

Imunohistohemijski test

Uzorci tkiva su stavljeni u parafin i isečeni na 4 mm za imunohistohemijsko bojenje. Sekcije se podvrgavaju deparafinizaciji i rehidraciji i inaktivaciji endogenih peroksidaza. Sekcije su podvrgnute preuzimanju antigena u citratnom puferu (PH=6) na 95 stepeni tokom 10 minuta. Zatim je 5 posto normalnog kozjeg seruma korišten za blokiranje na sobnoj temperaturi u trajanju od 40 minuta. mAb 1A8 je korišćeno kao primarno antitelo za HTNV NP antigen i inkubirano sa presecima tkiva na 4 stepena preko noći. Nakon toga uslijedilo je bojenje FITC anti-mišjim IgG (Invitrogen) na 37 stepeni u trajanju od 1 sata, a zatim DAPI tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. 3DHISTECH (Mađarska) je korišten za akviziciju slike, a CaseViewer2.4 za analizu podataka.

Histološki pregled

Kako bi se očuvala morfologija stanica i tkiva, 4 posto neutralnog puferiranog formalina korišteno je za fiksiranje uzoraka tkiva za histopatološke analize. Ova tkiva su obrađena u rezove od 5 mm, a zatim obojena hematoksilinom i eozinom (H&E). Konačno, preseci su pregledani svetlosnom mikroskopijom, a slike su snimljene od strane 3DHISTECH (Mađarska), analizirane od strane CaseViewer2.4. Stepen lezija je vizuelno ocijenjen korištenjem unaprijed postavljenog 4-sistema ocjena: unutar normalnih granica kao 0, minimalno kao 1, blage kao 2, umjerene kao 3, teške kao 4.

Studije o životinjamaSvi eksperimenti na životinjama odobreni su od strane Komiteta za laboratorijska eksperimentisanja Četvrtog centra za životinje VMA. (br. 20210403).

StatistikaPodaci su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism 9. Osim ako nije drugačije navedeno, svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Korišteni su t-testovi ili jednosmjerna ANOVA kako je navedeno u legendama slika. P-vrijednost manja od 0.05 se smatra značajnom.

REZULTATI

Detekcija virusnog opterećenja u različitim organima Nlrc3−/− miševa nakon intraperitonealne infekcije HTNV-om

Da bi se okarakterizirala osjetljivost Nlrc3−/− miševa na HTNV infekciju, grupa Nlrc3−/− miševa je intraperitonealno inficirana sa 5×105 PFU HTNV po mišu, koristeći WT miševe kao kontrolu. Sve životinje su svakodnevno praćene kliničkim simptomima, temperaturom i promjenama tjelesne težine. Miševi su žrtvovani 3, 6, 9 i 12 dana nakon infekcije (dpi) da bi se analizirali različiti laboratorijski parametri, virusno opterećenje i patologija. Nlrc3−/− miševi su počeli gubiti na težini od 4 dpi, a za 6 dpi, zabilježen je gubitak težine > 5 posto njihove početne tjelesne težine. Za poređenje, WT miševi nisu pokazali gubitak težine (slika 1A). U obje grupe nije zabilježena temperatura (Slika 1B). Kako bi se procijenila diseminacija i replikacija HTNV-a kod miševa zaraženih virusom, serum i glavni organi (uključujući srce, jetru, slezenu, pluća, bubrege i mozak) prikupljeni su za apsolutnu kvantifikaciju broja kopija virusne RNK. Rezultati su pokazali da se viremija javila na 3 dpi u obje grupe (Nlrc3−/− miševi: 943 ± 140 ekvivalenata kopija po mL; WT miševi: 803 ± 277 kopija po mL). Značajno je da je serumsko virusno opterećenje WT miševa dostiglo vrhunac na 3 dpi i brzo se smanjilo nakon toga, dok je kod Nlrc3−/− miševa, virusno opterećenje zadržalo srednji nivo do 6 dpi, a zatim se progresivno smanjilo na niski nivo od 9 dpi (Slika 1C). Osim toga, prikupili smo punu krv miševa zaraženih HTNV-om 0, 3, 6 i 9 dana nakon infekcije da bismo odredili replikaciju virusa u krvi. Rezultati su pokazali da se virusno opterećenje povećalo za 3 dpi, a zatim smanjilo što ukazuje na replikaciju virusa u krvnim stanicama. Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 1, broj kopija virusa kod Nlrc3-/- miševa bio je veći nego kod WT miševa (Nlrc3-/- miševi: 5752 ± 502 kopija po ml; WT miševa: 3589 ± 869 kopija po ml) pri 3 dpi. Štaviše, 2-višestruko veće virusno opterećenje otkriveno je u slezeni Nlrc3−/− miševa (3033 ± 175 ekvivalenata kopija po mg) nego WT miševa (1520 ± 425 kopija po mg) na 6 dpi; isti obrazac je uočen u bubrezima na 9 dpi (Nlrc3−/− miševi: 500 ± 87 ekvivalenata kopija po mg; WT miševi: 270 ± 40 kopija po mg) (Slika 1C). Sve u svemu, skromno veće virusno opterećenje otkriveno je kod Nlrc3−/− miševa nego kod WT miševa.

Zatim smo ispitali nivoe HTNV nukleoproteina (NP). Kao što je prikazano na slikama 2A, C, Nlrc3−/− miševi su pokazali više nivoe virusnog antigena od WT miševa u slezeni i bubrezima. Statistička analiza virusnih antigena u bubrezima i slezeni prikazana je na slikama 2B, D, respektivno. Niski nivoi virusnih antigena otkriveni su u srcu, jetri, plućima i mozgu Nlrc3−/− miševa (dodatna slika 2). Nivoi virusnog NP proteina u srcu, plućima i mozgu Nlrc3−/− miševa bili su niži od WT miševa na nivou proteina (dodatne slike 2B, F, H), ali su statistički značajnosti prikazane između srca i mozga i na mRNA i nivoi proteina (dodatne slike 2A, E, I). Ovaj nalaz sugerira da je aktivan virus

replikacija se dogodila u krvi, slezeni i bubrezima Nlrc3−/− miševa nakon HTNV infekcije. Konačno, koristili smo imunofluorescenciju za detekciju nivoa ekspresije HTNV NP u slezeni i bubrezima. Intenzitet fluorescencije HTNV NP FL bio je veći u bubrezimabubrežnitubule (Slika 2E) i crvena pulpa slezine (Slika 2F) miševa Nlrc3−/− nego WT miševa na 6 dpi i 9 dpi. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da su Nlrc3−/− miševi podložniji intraperitonealnoj infekciji HTNV-om.

Rutinski testovi krvi Nlrc3−/− miševa nakon infekcije HTNV-om

Općenito je prihvaćeno da je patologija HFRS uglavnom imunološki posredovana, uključujući imunološke komplekse, aktivaciju komplementa, odgovor T ćelija (24-26) i proizvodnju citokina izazvanu HTNV (26, 27), što uzrokuje višestruke povrede organa. Osim toga, trombocitopenija je uobičajena klinička karakteristika kod onih zaraženih virusima virusne hemoragične groznice (VHF). Stoga smo prvo izvršili hematološki test koristeći punu krv prikupljenu od Nlrc3−/− i WT miševa na 3, 6, 9 i 12 dpi. Rezultati su pokazali da se broj PLT kod WT miševa smanjio na 3dpi, a zatim se postupno oporavljao, ali je nastavio da se smanjuje kod Nlrc3−/− miševa sve dok nije dostigao najnižu vrijednost na 9 dpi, značajno nižu od one u WT na 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

značajno povećana kod Nlrc3−/− miševa na 6 dpi, ali ne i kod WT miševa (Slika 3C). Neutrofili kod oba tipa miševa su se blago smanjili, ali su se oporavili na prosječni nivo pri 6 dpi (slika 3D). Broj limfocita se značajno smanjio na 3 dpi, dok su počeli rasti kod WT miševa na 6 dpi, broj limfocita je ostao na niskom nivou na 6 dpi kod Nlrc3−/− miševa (Slika 3E). Odnos CD3 plus CD4 plus T ćelija naspram CD3 plus CD8 plus T ćelija u perifernoj krvi određen je drugom citometrijom i utvrđeno je da je povećan na 3 dpi, a zatim brzo preokrenut na 6 dpi, u skladu sa promjenama koje se često opažaju kod pacijenata sa HFRS (Slika 3F), kod kojih su se CD4 plus T ćelije dramatično smanjile, a CD8 plus T ćelije ostaju nepromijenjene ili kompenzatorno proširene što rezultira obrnutim omjerom CD4/CD8. Ovi nalazi sugeriraju da je intraperitonealna inokulacija HTNV-a u Nlrc3−/− miševe, u određenoj mjeri, inducirala glavne kliničke karakteristike pacijenata inficiranih HTNV-om, kao što su trombocitopenija i obrnuti odnos CD4/CD8 T ćelija.

Patološke promjene u bubrezima inficiranih Nlrc3−/− miševa pokazuju izraženo bubrežno intersticijalno krvarenje i proširenje bubrežnih tubulaZatim su patološke promjene kod miševa inficiranih HTNV procijenjene H&E bojenjem i utvrđeno je da postoje u bubrezima svih inficiranih Nlrc3−/− miševa koji se manifestiraju kao edembubrežnitubularne epitelne ćelije. Na 6 dpi, uočene su hemoragične lezijebubrežnimedula (slika 4A).Bubrežni tubuldilatacija je uočena već kod 3 dpi, njena ozbiljnost je dostigla vrhunac na 9 dpi i trajala do 12 dpi, a izraženija je kod Nlrc3−/− miševa nego kod WT miševa (Slike 4B, C). Ovi nalazi su ukazali

da akutna nefropatija koju karakterišebubrežnih tubuladilatacija ibubrežno intersticijalno krvarenjeje indukovana kod miševa zaraženih HTNV-om Nlrc3−/−. Što se tiče ostalih patoloških promjena na jetri, slezeni, plućima, ove dvije grupe miševa su pokazale slične rezultate. Oni su uglavnom uključivali ekstramedularnu hematopoezu u slezeni, zadebljanje alveolarnog zida u plućima i degeneraciju jetre (dodatne slike 3A-F). Na osnovu gore navedenog, patološke karakteristike uočene u bubrezima Nlrc3−/− miševa tokom akutne faze HTNV infekcije veoma su ličile na kliničko-patološke promene u slučajevima HFRS kod ljudi.

Na osnovu toga, dodatno smo ispitali povezane indekse krvi i urina kod miševa za funkcionalne poremećaje bubrega. Mišji serumi su sakupljeni za procjenu alanin aminotransferaze (ALT), kreatin kinaze MB frakcije (CK-MB), uree, kao i mokraćne kiseline (UA). Kao što je prikazano na slici 4D, u poređenju sa kontrolnim WT miševima, nivo UA u serumu bio je značajno povišen na 3 dpi kod Nlrc3−/− miševa, CK-MB u serumu je bio značajno povišen na 9 dpi kod Nlrc3−/− miševa, ali nivoi u serumu ALT, UREA i CREA nisu pokazali povišenje (dodatna tabela 1).

Renaluključenost u HFRS inficiranu PUUV uključuje prolaznu proteinuriju, mikroskopsku, ali rijetko vidljivu hematuriju i oligurični AKI, nakon čega slijedi poliurija i oporavak. Tipična karakteristika proteinurije u ovoj bolesti je njeno brzo smanjenje nakon akutne faze bolesti (6). U velikoj kohorti pacijenata sa akutnim tubulointersticijskim nefritisom uzrokovanim različitim etiologijama, proteinurija je nađena samo kod jedne četvrtine pacijenata, dok je kod svega 2% svih pacijenata pronađena proteinurija nefrotskog opsega (28). Sakupili smo urin na 0, 3, 6 dpi i otkrili da je nivo proteina u urinu povećan na 3 dpi, akutnoj fazi infekcije. Koncentracija proteina u urinu je značajno povećana i prosječna vrijednost je bila blizu 0.3 g/L pri 3 dpi kod inficiranih Nlrc3−/− miševa i WT miševa (Slika 4E).

Ispitati upalne ćelije koje su infiltrirane ububrežniintersticija nakon HTNV infekcije, izvršili smo imunohistohemijsko (IHC) bojenje sa CD3, F4/80 i CD11b. Rezultati su pokazali da se grupa imunih ćelija pozitivnih na CD3 infiltrirala ububrežniintersticija nakon HTNV infekcije (slika 5A), a mijeloične ćelije pozitivne na CD11b pojavile su se u kortikalnom tubulointersticijalu (slika 5B). Udio infiltriranih CD3 plus T ćelija i CD11b plus mijeloidnih ćelija je značajno veći kod inficiranih Nlrc3-/- miševa nego WT miševa, ali makrofagi pozitivni na F4/80 raspoređeni su po cijelom bubrežnom korteksu i meduli i nisu pokazali značajne razlika između ova dva tipa miša (slika 5C).

HTNV infekcija izazvala je robustan citokinski odgovor kod miševa Nlrc3−/−

Prekomjerna proizvodnja inflamatornih citokina se obično javlja kod ispitanika s HFRS-om i dovela je do hipoteze da disregulacija citokina može igrati ključnu ulogu u patogenezi bolesti. Vaheri et al. (8) otkrili su da višestruke citokine proizvode različite ćelije, kao što su makrofagi, monociti i limfociti, kao odgovor na proupalne signale kao što je virusna infekcija. Wang et al. prijavili su da su serumske koncentracije TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 i RANTES (ali ne i IL-4) bile mnogo povišene kod pacijenata sa HFRS (29), u poređenju sa kontrolama; i da su najveće koncentracije obično nađene tokom febrilne, hipotenzivne i oligurične faze, posebno u teškim i kritičnim slučajevima HFRS. Visoki nivoi IL-6 u plazmi bili su povezani sa teškimbubrežnineuspjeh i trombocitopenija kod PUUV-induciranog HFRS-a i može se koristiti kao marker težine bolesti.

Naši rezultati su pokazali da HTNV infekcija dovodi do povećane proizvodnje citokina, uključujući CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a i IFN-g u Nlrc3−/− miševi, a nivoi ovih citokina dostigli su maksimum na 6 ili 9 dpi; u poređenju, WT miševi su imali slabije citokinske odgovore tokom procesa infekcije (Slika 6).

Zaključno, u ovoj studiji smo otkrili da nakon intraperitonealne inokulacije HTNV-a, kod miševa Nlrc3−/− dolazi do gubitka težine,bubrežno krvarenjei proširenje tubula. Ove karakteristike više liče na kliničke simptome HFRS nego bilo koji drugi prethodno objavljeni životinjski modeli. Štaviše, miševi Nlrc3−/− su takođe pokazali veće virusno opterećenje u serumu, slezeni i bubrezima nego kod WT miševa i kod miševa Nlrc3−/− su se razvili hematološki poremećaji i značajne patološke promene u više organa, čime je ustanovljena HTNV infekcija Nlrc3−/ − miševi kao novi model za proučavanje HFRS.

DISKUSIJA

HFRS mišji model koji je ovdje opisan pokazuje da HTNV inficirani Nlrc3−/− miševi predstavljaju odgovarajući model malih životinja koji se može koristiti za procjenu HFRS vakcina i terapeutika. Nlrc3−/− model miša liči na sistematsku ozljedu uočenu kod ljudi, koju karakteriziraju trombocitopenija, limfocitopenija, povišeni nivoi AST u serumu (disfunkcija jetre), LDH, MB frakcije kreatin kinaze i UA(disfunkcija bubrega). Nadalje, Nlrc3−/− miševi su razvili gubitak težine i očigledanbubrežno krvarenje. Replikacija virusa i histopatološke promjene u ciljnim organima otkrivene su u plućima, slezeni, jetri i bubrezima. Pored toga, u krvi, slezeni i bubrezima Nlrc3−/− miševa pronađen je skromno veći nivo opterećenja virusnom RNK. Za usporedbu, WT miševi su razvili blage histološke promjene uprkos otkrivanju virusne RNK u krvi, slezeni i bubrezima.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 posto) (30). Na primjer, hrčci zaraženi HTNV nazalnim putem doveli su do trajne asimptomatske infekcije, koju karakterizira sporadična viremija, ali visoki nivoi kopija virusnog genoma u plućima, mozgu i bubrezima. Tvorovi zaraženi visokom dozom HTNV-a putem mišićne injekcije pokazali su postepeno smanjenje tjelesne težine (5-12 posto tokom vremena), ali netaknutobubrežne funkcije, odsustvo viremije i nedostatak prijenosa virusa u organe. Kod marmozeta, intramuskularna injekcija HTNV-a dovela je do visokog stepena serokonverzije i proizvodnje neutralizirajućih antitijela; dosljedno, ove životinje nisu imale oštećenje bubrega, viremiju ili prijenos virusa na organe (13).

Što se tiče zapažanja da su hematološke promjene uočene samo u jednoj vremenskoj točki i da promjene citokina nisu značajne, mislimo da se mogu objasniti prirodom HTNV infekcije, koja je slična mnogim drugim virusnim infekcijama koje zahvaćaju više organa, pa stoga često teško je pronaći trajne promjene jednog parametra. Sve u svemu, naši nalazi su generalno u skladu sa postojećim znanjem u ovoj oblasti. Nadalje, otkriće Nlrc3−/− miševa koji su podložniji infekciji HTNV-om i pokazuju mnoge promjene slične patološkim promjenama HFRS-a je novi doprinos ovoj oblasti. Općenito je prihvaćeno da su ljudske vaskularne endotelne stanice primarni cilj za hantavirus , što dovodi do promenljivog stepena generalizovane kapilarne dilatacije i edema (31).

Virusni antigeni se mogu naći unutar kapilarnog endotela različitih tkiva (Hantavirusi usmjeravaju permeabilnost endotelnih stanica tako što senzibiliziraju stanice na faktor vaskularne permeabilnosti VEGF, dok angiopoetin 1 i sfingozin 1-fosfat inhibiraju propusnost usmjerenu na hantavirus). Histološka analiza je pokazala da je uočen bubreg Nlrc3−/− miševabubrežnih tubuladilatacija na 9 dpi, Nlrc3−/− miševi sa težim patološkim promjenama od WT miševa i perzistirali su na 12 dpi. Kod Nlrc3−/− miševa, edem bubrežnih tubularnih epitelnih ćelija i značajno renalno intersticijalno krvarenje uočeni su u bubregu. Dalje, izražena ekstramedularna hematopoeza u crvenoj pulpi slezene uočena je na 6, 9 i 12 dpi, a proširenja germinalnog centra i povećan broj multinuklearnih džinovskih ćelija na 12 dpi. Jetra je također pokazala tešku hepatocitnu degeneraciju i raštrkanu nekrozu 3, 6, 9 i 12 dpi. Upala pluća i zadebljanje alveolarnog zida uočeni su na 6 dpi. Ovaj nalaz sugerira da je HTNV infekcija imala značajan i dugotrajan utjecaj na jetru i bubrege kod HTNV inficiranih Nlrc3−/− miševa. Pored toga, Nlrc3-/- miševi su se pokazali istaknutimproširenje bubrežnih tubula, intersticijsko krvarenje i disfunkcija bubrega nakon HTNV infekcije. Nivo UA u serumu bio je značajno povišen na 3 dpi, što je jasan pokazatelj bubrežne disfunkcije. Koncentracija proteina u urinu je značajno povećana i prosječna vrijednost je bila blizu 0.3 g/L pri 3 dpi kod inficiranih Nlrc3-/- miševa. Isti trend povećanja UA nije primijećen kod WT miševa. Ovi rezultati sugeriraju da naš model rekapitulira više patoloških karakteristika ljudske HTNV infekcije.

N protein (NP) se proizvodi u izobilju u ćelijama inficiranim hantavirusom i može se otkriti već 4 h nakon infekcije (32). Ove karakteristike objašnjavaju glavni razlog zašto je krajnja tačka ELISA-e otkrivanje proteina hantavirusa N i testovi imunofluorescencije za procjenu broja virusnih čestica i progresije virusne infekcije. Različite metode mogu uticati na dobijene rezultate i zaključke. Virusni protein i viremija su dva različita parametra virusne infekcije i ne moraju se uvijek mijenjati sinhrono. Rezultati kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu pokazali su da je došlo do prolaznog povećanja nivoa NP na 6 dpi u slezeni, gdje je virus možda prošao kroz prolaznu replikaciju, nakon čega je uslijedilo njegovo uklanjanje. Kao što se očekivalo, akumulacija virusnog proteina je uočena nakon vrhunca viremije, koji se pojavio na 3 dpi. Zaista, replikacija virusa u slezeni i bubrezima održavana je na umjerenom nivou na 9 i 12 dpi, praćena sintezom N proteina (slezena pri 9 dpi: WT miševi: 192 ± 128 kopija po mg; Nlrc3−/− miševi: 431 ± 229 kopija po mg; slezina pri 12 dpi: WT miševi: 160 ± 85 kopija po mg; Nlrc3−/− miševi: 226 ± 118 kopija po mg). Međutim, količina HTNV NP na nivou proteina dostigla je maksimum na dan 6 pi i ostala je povišena tokom 9 i 12 dpi. Razlika u kinetici kopija virusne RNK i količini proteina može odražavati njihovo različito raspadanje u različitim organima.

Uloga citokina je obično složenija u modelima bolesti. Kod HFRS izazvanog PUUV, teškazatajenje bubregai trombocitopenija su povezani sa visokim nivoima IL-6 u plazmi (33). Naša analiza je pokazala da HTNV infekcija dovodi do povećane proizvodnje citokina, uključujući CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a i IFN-g u Nlrc3−/− miševa, ali ne toliko kod WT miševa. Vrijedi napomenuti da su pri 9 dpi, Nlrc3−/− miševi pokazali značajne patološke promjene u slezeni i bubrezima, praćene snažnim odgovorom citokina u ovom trenutku. Ovi nalazi ukazuju na to da bi visok nivo citokina mogao biti povezan s patogenezom bolesti.

Ukratko, rezultati koje ovdje izvještavamo pokazuju da nakon inokulacije s HTNV intraperitonealnim putem, kod Nlrc3−/− miševa dolazi do gubitka težine, trombocitopenije, rendalnu disfunkciju i krvarenje.Oni više nalikuju kliničkim simptomima HFRS-a nego bilo koji drugi prethodno objavljeni životinjski modeli. Ovaj model se može koristiti za procjenu potencijalnih vakcina i terapeutika i dubinsko proučavanje patogeneze HFRS in vivo.