Novi alati za snimanje za mjerenje broja nefrona in vivo: mogućnosti za razvojnu nefrologiju

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstract

Sisarbubregje složen organ koji zahtijeva usklađenu funkciju do miliona nefrona. Broj nefrona je konstantan nakon nefrogeneze tokom razvoja, a gubitak nefrona tokom životnog vijeka može dovesti do osjetljivosti na akutne ilihronična bolest bubrega. Nove tehnologije su u razvoju za brojanje pojedinačnih nefrona u bubregu in vivo. Ovaj pregled ocrtava ove tehnologije i naglašava njihovu relevantnost za studije o razvoju i bolesti bubrega kod ljudi.

Kliknite ovdje da saznate više o upotrebi herba cistanches

Uvod

Bubreg sisara je složen organ koji je evoluirao da kontroliše širok spektar fizioloških procesa. Ovi procesi uključuju volumen krvi, krvni tlak, osmotski tlak, uklanjanje otpada i homeostazu metabolita. Normalan razvoj bubrega zahtijeva recipročno formiranje ureternog pupoljka i metanefričnog mezenhima. Nakon toga slijedi iterativni proces grananja i kaskada signalizacije za održavanje obnovljivog skupa progenitorskih stanica, koje proizvode diferencirane stanice koje obavljaju različite funkcije bubrega.

Trajanje i kraj nefrogeneze variraju među vrstama. Kod ljudi i primata koji nisu ljudi, rođenje i kraj ljudske nefrogeneze se dešavaju u sličnim vremenskim tačkama; nefrogeneza se završava oko 35. sedmice gestacije kod ljudi. Vrste koje daju leglo potomstva često imaju promjenjiv period prirodne postnatalne nefrogeneze. Da li broj nefrona varira u zavisnosti od vrste, soja,sex, te okolišni i genetski faktori? Broj ljudskih nefrona je veoma varijabilan (200,000 do 2,7 miliona), na osnovu studija na obdukciji. Širok raspon broja nefrona je također uočen u ljudskoj neonatalnoj autopsiji, što sugerira da je ovaj raspon uspostavljen tokom nefrogeneze.

Broj nefrona može odrediti podložnost brojnim bubrežnim patologijama, a gubitak nefrona može ubrzati razvoj kronične bolesti bubrega (CKD). Stoga je važno razmotriti uzroke niskog broja nefrona i gubitka i razumjeti zašto tako širok raspon broja nefrona ostaje kod ljudi. Sve je više dokaza da su genetika i epigenetski faktori određeni zdravljem i ishranom majke kritične determinante nefrogeneze. Razvoj fetusa je ograničen energijom dostupnom od majke, reguliran funkcijom placente. Evolucijski pritisak selekcije vođen reproduktivnom kondicijom dao je prioritet rastu mozga u odnosu na fetalni i rani postnatalni razvoj bubrega, pri čemu je preko 50 posto stope metabolizma u mirovanju dodijeljeno mozgu kroz prvu godinu života. Prema tome, pothranjenost majke, stres iz okoline ili infekcija dovode do intrauterinog ograničenja rasta ili preranog porođaja i smanjenja metilacije DNK u ćelijama progenitorima nefrona. Molekularni mehanizmi neophodni za razvoj zdravog bubrega uglavnom su proučavani na modelima glodara. Međutim, donedavno je bilo malo direktnih poređenja između razvoja bubrega kod glodara i ljudi.

Gubitak nefrona se tipično prevazilazi hipertrofijom i hiperfiltracijom preostalih nefrona, o čemu svjedoči održavanje GFR cijelog bubrega. Hipertrofija je kratkoročna adaptacija za održavanje metaboličke homeostaze kroz reproduktivne godine. Međutim, postoje fizička ograničenja za adaptivnu hipertrofiju, ograničena površinom cijevi potrebnom za transport i otporom protoku koji je rezultat povećanja dužine cijevi. Ovo ograničenje je prevaziđeno kod najvećih sisara (kitova) pakovanjem 100 miliona nefrona u male unipapilarne jedinice koje sadrže kratke tubule. Nakon reproduktivnih godina, sve veće stanične oksidativne ozljede koje su rezultat nakupljanja stresora (ishemija, hipoksija, infekcija) pospješuju kontinuirani gubitak nefrona koji se nadovezuje na starenje, što se odražava smanjenjem broja nefrona za 50 posto u normalnoj populaciji koja stari.

Uprkos našem rastućem razumijevanju razvoja bubrega i uloge gestacijskog okruženja u uspostavljanju zdravlja bubrega, još uvijek nam nedostaje integrirani pogled na pojedinačne nefrone u kontekstu intaktnog, funkcionalnog organa. Trenutne nepristrasne metode za procjenu broja glomerula zahtijevaju destrukciju bubrega, ograničavajući njihov potencijal u longitudinalnoj analizi i upotrebi in vivo. Razvoj neinvazivnih tehnika snimanja za praćenje broja funkcionalnih nefrona tokom životnog ciklusa pružio bi ključne informacije za predviđanje progresije hronične bolesti bubrega i za mjerenje efikasnosti novih intervencija.

Razvijaju se novi radiološki alati za rješavanje ovih izazova i pružanje neinvazivnih sredstava za praćenje i mjerenje mase nefrona in vivo. Ova tehnologija ima potencijal da pruži nove uvide u razvoj bubrega i njihovu ulogu u napredovanju bolesti kasnije u životu. Opažanja dostupna ovom tehnologijom uključuju broj nefrona, volumen glomerula i hipertrofiju, i moguće funkciju jednog nefrona. Ovaj pregled će opisati trenutno stanje ove nove tehnologije i dati pogled na njene potencijalne primjene u pretkliničkoj nauci i kliničkim istraživanjima.

Ex vivo pristupi mjerenju broja nefrona i veličine glomerula

Najviše razvijeni pristupi mjerenju broja nefrona i veličine glomerula temelje se na stereologiji zasnovanoj na dizajnu. Tkivo se priprema i seče za mikroskopiju, a veličine struktura, kao što su glomeruli, posmatrane na stakalcima se analiziraju kako bi se zaključili prosječni volumeni struktura u originalnom tkivu. Ovo se može izvesti u ekscidiranim organima ili iz tkiva biopsije sistematskim i nasumičnim uzorkovanjem tkiva. Tehnika disektor-frakcionatora otkrila je populacijske razlike u broju nefrona i hiperfiltraciji kod ljudi25 i intenzivno se koristila za proučavanje životinjskih modela ljudskih bolesti.

Kako bi se izbjeglo dijeljenje koje zahtijeva stereologija, nedavno su razvijeni novi pristupi slikanju za dopunu podataka biopsije i mjerenja broja nefrona. Magnetna rezonanca (MRI) se najčešće zasniva na detekciji protona vode u tkivu, prvenstveno iz vode, pomoću magnetnih polja. Subjekt ili uzorak se stavlja unutar velikog magnetnog polja. Tipične jačine magnetnog polja koje se koriste za kliničku magnetnu rezonancu kreću se od 1,5T do 7T. Pretklinički MRI sistemi često koriste mnogo veće jačine polja za visok odnos signal-šum i poboljšani kontrast i rezoluciju slike. MRI pruža širok spektar tehnika kontrasta slike za snimanje mekih tkiva i ne zahtijeva jonizujuće zračenje. MRI takođe pruža visoku rezoluciju u pretkliničkim i kliničkim sistemima.

Kationski feritin (CF) je uveden kao intravenozno ubrizgan kontrastni agens za detekciju i snimanje glomerula u cijelom bubregu MRI. Nabijene nanočestice, uključujući feritin, koristile su se decenijama za istraživanje strukture i funkcije bazalne membrane pomoću elektronske mikroskopije (EM). CF je izvorno kreirao Danon kao tragač za elektronsku mikroskopiju, koji je pokazao da se može vezati za anionska mjesta . Molekul feritina se detektuje u EM zbog svog jezgra od željeznog oksida gustog u elektronima. Ovo isto jezgro od željeznog oksida je često magnetno, što ga čini detektiranim MR. Ova tehnika, MRI sa kationskim feritinom (CFE-MRI), korištena je za brojanje svakog glomerula kod zdravih bubrega pacova30, ex vivo, i korištena je za mjerenje intra-renalne distribucije volumena glomerula. CFE-MRI je također korišten za brojanje i mjerenje svakog glomerula u bubregu miša3], a glomerularni volumeni su mapirani kako bi se otkrile prostorne varijacije u veličini glomerula. Ove nalaze su potvrdile više grupa. Mjerenja i kod pacova i kod miša korištenjem CFE-MRI potvrđena su stereologijom disektor-frakcionatora.

CFE-MRI je također izveden u intaktnim ljudskim donorskim bubrezima gdje je CF ubrizgan direktno u bubrežnu arteriju, a bubreg je ispran fiziološkom otopinom prije nego što je fiksiran i snimljen. CFE-MRI u ljudskim bubrezima pružio je trodimenzionalni prikazbubrežni glomerularmorfologiju, koja pokazuje heterogenu glomerularnu hipertrofiju i regije gubitka nefrona vjerovatno povezane s pacijentovom neliječenom hipertenzijom. Regije gubitka nefrona bile su u korelaciji sa histologijom iz istih regiona, pokazujući i vaskularnu i glomerularnu sklerozu.

Ove početne studije fokusirale su se na promjene u broju nefrona i glomerularnoj morfologiji s kroničnom i akutnom bolešću bubrega. U Bennettu et al-26, distribucija CF u bubrezima je redistribuirana zbog rane glomerularne patologije u pacovskom modelu fokalne i segmentne glomeruloskleroze, prije prikaza proteinurije. Kod miševa, CFE-MRI je primijenjen za otkrivanje i mapiranje glomerularne hipertrofije u modelu oligosindaktilizma (Os/ plus ) redukcije nefrona31. Nedavno smo to pokazaliakutna povreda bubregau modelu neonatalnog kunića izazvao je uočljiv gubitak glomerula sa vaskularnom reorganizacijom35 Stoga, praćenje promjena u označavanju CF pomoću MRI može biti važan alat za razumijevanje utjecaja oštećenja tokom razvoja i njegovog utjecaja na zdravlje bubrega kasnije u životu.

Postoje neka važna razmatranja u validaciji CFE-MRI korištenjem drugih tehnika, kao što je direktorska-frakciona stereoologija korištena u ovim ranim studijama. CFE-MRI može mjeriti samo glomerule koji su perfuzirani, dok histološki pristupi također otkrivaju glomerule koji nisu. Ako se ova dva direktno uporede kada postoje nedovoljno ili neperfundirani glomeruli, MRI mjerenja će biti niža. Strukturni i funkcionalni faktori, kao što su onkotski pritisak, brzine kapilarne perfuzije i GBM struktura, koji utiču na akumulaciju CF u GBM, slabo su shvaćeni, tako da je moguće da je glomerularni unos moduliran procesima bolesti koji moduliraju CFE-MRI na načine koji nisu opisani. Konačno, oštećenje GBM ili proteinurija mogu uzrokovati curenje CF u tubule, što dovodi do difuznog, a ne punktatnog označavanja glomerula uočenog MRI. U studijama razvoja, struktura naboja GBM i glomerularna filtracija variraju s gestacijskom dobi. U svim ovim slučajevima važno je razumjeti parametre koji su uključeni u označavanje CF kroz kontinuirana istraživanja. Također je ključno utvrditi toksikologiju CF, koja se čini minimalnom kod zdravih životinja, ali se mora istražiti sa svakim novim modelom.

Xray-CT je nedavno demonstriran za mjerenje mikrostrukture bubrega i mapiranje broja nefrona u intaktnom bubregu, ex vivo. Primarna prednost CT-a je njegova jednostavnost i brzina upotrebe te niska cijena u odnosu na MRI. Nedostatak je upotreba jonizujućeg zračenja, što može ograničiti njegovu upotrebu in vivo ili u kliničkim primjenama. Bez obzira na to, C nudi snimanje u visokoj rezoluciji obilježenih struktura ex vivo koje se zatim mogu zajedno registrovati s anatomijom mekog tkiva korištenjem drugih modaliteta snimanja.

Mikroskopija svjetlosnog lista nakon optičkog čišćenja cijelog organa korištena je za mjerenje broja glomerula i veličine kapilarnog pramena u intaktnim bubrezima miša. Ovaj atraktivan pristup ima prednost automatizacije i vizualizacije cijelog glomerula u mikroskopskoj rezoluciji u cijelom organu ili u uzorcima velikih organa.

In vivo pristupi direktnom mjerenju broja nefrona i veličine glomerula

Utemeljeni i novi alati za merenje broja nefrona ex vivo omogućili su da se zaključi inter- i intra-subjektna heterogenost u broju nefrona i zapremini glomerula. Ovi alati počinju rješavati kritične praznine u našem znanju o strukturi bubrega i o tome kako se ona odnosi na funkcioniranje bubrega, in vivo. Ova pitanja uključuju: 1) Kakav je odnos između broja glomerula i veličine sa individualnom filtracijom nefrona?, 2) Kakva je prostorna distribucija broja nefrona i veličine glomerula i njihov odnos sa patologijom?, i 3) Da li stopa starenja glomerula promjena zdravlja i bolesti bubrega? Klinički, moguće je procijeniti broj nefrona in vivo korištenjem kombinacije rendgenskih snimaka/CT i biopsije. Ova vrsta rada počinje da pruža kritičnu vezu između broja nefrona i bubrežne funkcije. Nekoliko publikacija je pokazalo da se MRI može koristiti za otkrivanje pojedinačnih glomerula kod žive životinje. Rani rad u ovoj oblasti korišćenjem CFE-MRI bio je ograničen na specifične regije bubrega. U jednom izvještaju razvijeno je bežično pojačalo za lokalno povećanje signala u bubrezima kako bi se omogućila ko-registracija pojedinačnih nefrona tokom filtracije i funkcije4. Nedavno su dvije publikacije objavile mjerenja pojedinačnih glomerula in vivo u cijelom bubregu pomoću CFE-MRI i kod pacova i kod miševa. Ovaj pristup je također korišten u longitudinalnom eksperimentu, pokazujući da se CFE-MRI potencijalno može koristiti za praćenje promjena u broju nefrona tokom vremena kao odgovor na terapiju ili za praćenje razvoja bubrega.

Primarni izazov sa CFE-MRI in vivo je osjetljivost. Deoksihemoglobin u krvi je paramagnetičan i može uzrokovati artefakt magnetske osjetljivosti u kapilarama koji smanjuje dinamički raspon za otkrivanje glomerula označenih CF. Da bi se ovo riješilo, feritin se može modificirati kako bi uključio više željeza, a jezgro CF od metalnog oksida može se modificirati kako bi se lakše otkrilo bez artefakta osjetljivosti. Međutim, druge strategije detekcije imaju kompromise u prinosu proizvoda ili brzini snimanja, tako da prva demonstracija CFE-MRI nije koristila ove pristupe. Ključ za CFE-MRI je kontrola pokreta i osiguranje da je radiofrekventna (RF) zavojnica dovoljno osjetljiva na cijeli bubreg.

Izgledi za razvojnu nefrologiju: Struktura i funkcija Ovdje smo opisali nove alate za direktno mjerenje nefrona, kako ex vivo tako i in vivo. Rendgen CT omogućava brzo dobijanje slike i fenotipizaciju, ex vivo. Alati kao što je RTG CT u kombinaciji s biopsijom imaju prednost što se brzo primjenjuju u klinici, s nedostatkom invazivnosti, upotrebe jonizujućeg zračenja i potencijala za pristrasnost uzorka. Pristupi zasnovani na magnetnoj rezonanciji prevazilaze potrebu za jonizujućim zračenjem i obezbeđuju kombinovani kontrast mekog tkiva, a mogu se koristiti i ex Vivo i in vivo. CFE-MRI zahtijeva injekciju kontrastnog sredstva koje se mora smatrati sigurnim prije nego što se može koristiti u klinici. Dok je in vivo mjerenje broja nefrona u povojima, nove sekvence akvizicije slike za brzo snimanje, pored poboljšanog hardvera i obrade slike, imaju potencijal da ove MRI alate učine praktičnim za rutinsku upotrebu. Kako tehnika bude sazrijevala, druge pulsne sekvence će biti raspoređene kako bi se smanjila osjetljivost na artefakt osjetljivosti izazvan CF, a fizika lokalnog magnetskog okruženja će se bolje razumjeti kako bi potencijalno otkrila još više informacija. Postoje i jedinstvene mogućnosti za kombinovanje glomerularne i tubularne morfologije sa drugim strategijama za dobijanje slike kako bi se obezbedio potpuni prikaz mikrostrukture, ukupne anatomije i fiziologije bubrega in vivo. Ove kombinovane informacije mogu se koristiti za proučavanje razvoja gubitka nefrona tokom vremena, primarne karakteristike i akutnih i hroničnih bolesti bubrega i progresivnih bolesti bubrega tokom razvoja.

Nedavno usavršavanje vizualizacije i segmentacije slike, putem analitičkih alata ili umjetne inteligencije, omogućava izdvajanje velikih količina informacija iz trodimenzionalnih slika tkiva. Neke nove tehnike, poput snimanja tenzora osjetljivosti, obećavaju da će pružiti nove informacije koje se mogu koristiti kao surogat za mikrostrukturu tkiva. U bubrezima, ovo može olakšati kombinovane mape glomerula, tubula, vaskulature i intersticija iz kombinacije ko-registriranih slika. Također može biti moguće direktno registrovati ove slike na optičku sliku ili na informacije dobijene drugim radiološkim modalitetima snimanja. Važno je u svakom slučaju opsežno potvrditi ove nove alate i na kraju standardizirati neke protokole nabavke u institucijama kako bi se obezbijedio visok nivo ponovljivosti. Dostupnost i jednostavnost korištenja novih alata vjerovatno će pokrenuti nove pristupe u nauci o podacima za integraciju informacija iz svih ovih kontrastnih mehanizama i modaliteta kako bi se ponudio novi, kvantitativni pogled na bubrege kod velikog broja ispitanika. U razvoju, ovi alati se eventualno mogu kombinovati u longitudinalnim studijama. Usvajanje i kreiranje novog mašinskog učenja bit će ključno za ovaj napor.

Preostali izazov je prevesti mjerenja broja nefrona za in vivo snimanje kod ljudi49. Klinička mjera broja nefrona ili volumena glomerula bi potencijalno omogućila individualizirane terapije prilagođene zapažanjima kod specifičnih pacijenata i mogla bi pružiti potpuno novi pogled na ljudske bubrege razvoj.