Kompleksi nano proteina mlijeka i sluzi: karakterizacija i antikancerogeno djelovanje, 1. dio

Za više detalja kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Theantikancerogenaaktivnost prirodnih spojeva nedavno je privukla multidisciplinarna istraživanja. U ovoj studiji istražena je kompleksacija mliječnih proteina (MP) sa sluzi Isabgol ljuske (IHM) i sluzi Ziziphus Spina Christi (NabM). U tom kontekstu, mjerena su fizičko-hemijska svojstva kompleksa sluzi proteina mlijeka (MPMC) uključujući pH, Carrov indeks, rastvorljivost u vodi i indekse apsorpcije vode, te je proučavano ponašanje protoka. Osim toga, profil aminokiselina, probavljivost proteina, te fenolni iflavonoidiistražen je sadržaj MPMC, a mikrostruktura kompleksa je vizualizirana transmisijskom elektronskom mikroskopom. Theantioksidansi antikancerogene potencije MPMC protiv dvije kancerogene ćelijske linije, raka jetre kod ljudi HEPG-2 i raka dojke MCF-7, u poređenju sa dvije normalne ćelijske linije, naime, Bj-1 i MCF{{ 3}}F, testirani su testom uzimanja neutralnog crvenog. Rezultati su otkrili da MPMC ima aktivnost čišćenja protiv DPPH, ABTS i HS radikala. Štaviše, MPMC ima potencijal da spriječi oštećenje DNK izazvano oksidativnim stresom u Tip-Fentonovoj reakciji. Rezultati neutralnog crvenog testa pokazali su značajnu inhibiciju rasta i HEPG-2, MCF-7, dok nije otkriven značajan citotoksični efekat protiv Bj-1 i MCF-12F. RT-qPCR rezultati su pokazali da je MPMC stimulirao apoptozu što je otkriveno povećanjem regulacije pro-apoptoznih genskih markera Caspase-3, p53, Bax. U međuvremenu, gen protiv apoptoze Bcl-2 je bio smanjen. Međutim, nije primijećena značajna razlika u normalnim ćelijskim linijama tretiranim MPMC. U zaključku, MPMC se može smatrati obećavajućim antikancerogenim entitetom koji se može koristiti u razvoju novih terapeutika za rak sa uporedivom aktivnošću i minimalnim nuspojavama u usporedbi s konvencionalnim kemoterapijama raka. .

Ključne riječi: mlečni proteini; sluz od isabgol ljuske; Nabeq sluz; kompleksi sluzi mliječnih proteina; antikancerogena aktivnost

Kliknite da saznate više o proizvodima

1. Uvod

Rakje primarni uzrok smrtnosti širom svijeta sa približno 10 miliona smrtnih slučajeva u 2020. [1]. Rana dijagnoza i razvoj novih terapija jedina su nada da se pobijedi rak. Konvencionalni tretmani raka kao što su hemoterapija i zračenje su relativno skupi i praćeni značajnim nuspojavama.

Stoga je naučni i istraživački interes usmjeren na korištenje prirodnih spojeva (tj. proteina, polisaharida i polifenola) iz njihovih izvora koji imaju antikancerogeni potencijal jer se smatra da imaju manje toksične nuspojave u odnosu na konvencionalne tretmane.

Polisaharidiiz biljnih izvora u posljednje vrijeme dobija sve veću pažnju zbog svojih bioaktivnih svojstava [2,3]. Brojne studije su bile zainteresirane za izolaciju bioaktivnih polisaharida i polifenola iz prirodnih biljnih izvora kao što su voće, povrće, žitarice i začinsko bilje zbog njihovog blagotvornog farmakološkog djelovanja [4].

Plantago ovata (Psyllium ili Isabgol) i Ziziphus Spina-Christi (Nabeg ili Sidr) poznati su izvori bioaktivnih polisaharida. IHM i NabM su odabrani kao obećavajući bioaktivni materijali. Prethodne studije su pokazale da IHM i NabM kompleksi sa mliječnim proteinima poboljšavaju funkciju jetre i smanjuju rizik od kardiovaskularnih bolesti[5]. Isabgol ljuska se pokazala efikasnom u liječenju dijareje, zatvora, ulceroznog kolitisa, sindroma iritabilnog crijeva, hiperholesterolemije i dijabetesa. Štaviše, antikancerogeno dejstvo isabgol ljuske protiv kolorektalnog karcinoma pripisuje se sadržaju vlakana, koja smanjuju njegove efekte smanjujući vreme tranzita. To će dovesti do smanjenja metabolizma žuči od strane crijevne mikroflore, razrjeđivanja žučnih kiselina povećanjem stolice, promjene metabolizma mikrobnih žučnih kiselina zbog fermentacije vlakana, smanjenja pH vrijednosti i proizvodnje kratkih lanaca masnih kiselina, ili direktnim vezivanjem na žučne kiseline i time sprečavaju njihov metabolizam [6]. Glavne biološki aktivne komponente Ziziphus Spina-Christi su vitamin C, fenoli, flavonoidi i triterpenske kiseline. Njegove bioaktivnosti uključuju antikancerogeno, antibakterijsko, antidijabetičko, antiproliferativno i antioksidativno djelovanje [7. Isabgol ljuska i plodovi Nabeq koriste se za proizvodnju sluzi od Isabgol ljuske (IHM), odnosno Nabeq sluzi (NabM), respektivno [5].

S druge strane, proteinske terapije za rak su dobile sve veći interes zbog ključnih karakteristika kao što su niska citotoksičnost, jaka specifičnost i lakoća modifikacije [8]. Osim što osiguravaju nutritivne potrebe za esencijalnim aminokiselinama, mliječni proteini su među biološkim makromolekulama koje imaju mnoga funkcionalna svojstva kao što su antioksidativna, imunomodulatorna, antidijabetička, antimikrobna i antikancerogena svojstva [9,10]. Na primjer, antikancerogena aktivnost peptida dobijenih iz mliječnih proizvoda (tj. -Kazomorfina izolovanih iz -kazeina i 1-fragmenata kazeina 90-95 i 90-96[Arg{10}}Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) identificirani u goveđem mlijeku podržavaju pretpostavku da mliječni proteini nisu samo nutritivne vrijednosti, već imaju i potencijal za prevenciju i liječenje raka [11,12]

Kompleksacija između mliječnih proteina i polisaharida, kao što je kompleks proteina mlijeka i hitozana, ranije je proizvedena kao pokušaj poboljšanja funkcionalnih svojstava njihovih prirodnih komponenti [13]. Zbog dostupnosti i lakoće pripreme, takvi kompleksi imaju potencijal da se koriste u razvoju jeftinijih terapija protiv raka. Takvi terapeutici će biti jeftiniji i pokazivati ​​uporedivu aktivnost sa trenutno korištenim kemoterapeutima.

Nekovalentno vezivanje kroz hidrofobne i elektrostatičke interakcije primarni su faktori u povezivanju mliječnih proteina sapolisaharidi[14]. Štaviše, proteini pokazuju iznenađujuću otpornost na interakciju sa drugim komponentama u opsegu pH od 2 do 11. Pri specifičnom pH, površinska reaktivnost proteina se povećava razvijanjem strukture proteina [15].

U tom kontekstu, naša grupa se nedavno fokusirala na funkcionalnu ulogu kompleksa mliječnih proteina na ljudsko zdravlje. Međutim, kompleksi mliječnih proteina s IHM ili NabM, pokazali su antihiperlipidemijska i jetrena zaštitna svojstva [9]. Stoga je, na osnovu prethodnih studija, pretpostavljeno da bi kompleksi proteina i polisaharida mlijeka mogli imati zanimljivu antikancerogenu aktivnost. Osim toga, nijedna publikacija nije sprovela istraživanje antikancerogenog djelovanja kompleksa mliječnih proteina s IHM i NabM. Stoga su glavni ciljevi ove studije bili karakterizacija fizičko-hemijskih svojstava novoproizvedenih kompleksa sluzi proteina mlijeka uključujući profil aminokiselina i funkcionalna svojstva ovih kompleksa. Osim toga, istražena je antikancerogena aktivnost kompleksa mliječnih proteina s IHM i NabM sluzi protiv dvije ljudske kancerogene ćelije (MCF7 i HEPG2) u poređenju sa nekanceroznim ćelijskim linijama (Bi-1 i MCF-12F ). Također smo rasvijetlili način djelovanja proizvedenih kompleksa sluzi proteina mlijeka.

2. Rezultati i diskusija

2.1. Fourier-transformska infracrvena (FTIR) spektroskopija

Infracrveni spektri IHM, MP i MP/IHM ilustrovani su na slici 1A. Spektar IHM-a je pokazao karakterističnu traku arabinoksilana na 100-1200 cm-1 i trake za amid I i amid II grupu na 1550 i 1650 cm-1, respektivno. MP spektar pokazuje trake na 1700-1600 i 1200-900 cm-I koje odgovaraju amidu I (uglavnom C=O rastezanje proteina) i mliječnim ugljikohidratima, respektivno [16]. Navedeni pikovi IHM i MP su rezervisani u spektru kompleksa IHM/MP. Slično, karakteristične trake galakturonske kiseline u NabM su održavane u spektru NabM/MP kompleksa (Slika 1B). Ovo bi ukazivalo na odsustvo hemijske interakcije između polisaharidne sluzi i MP i time potvrdilo predloženi mehanizam elektrostatičke privlačnosti između MP i polisaharida (IHM i NabM). Takva zapažanja su u skladu s onima Vukića i saradnika, koji su izvijestili o formiranju kompleksa između proteina mlijeka surutke i pektina putem elektrostatičkih i hidrofobnih interakcija što je rezultiralo dobrom konzistentnošću kompleksa [17].

2.2. Fizičko-hemijska i funkcionalna svojstva MP i MPMC

Vrijednosti nasipne gustine (BD), gustine izvlačenja (TD), Carrovog indeksa i mjerenja pH navedene su u Tabeli 1. BD i TD MP bili su veći od IHM-a, a IHM je imao najmanju nasipnu i izdubljenu gustinu od testiranih uzoraka . Slično, MP/IHM kompleks je značajno imao (str<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI i WAI su važne funkcionalne karakteristike u prehrambenoj tehnologiji. Tabela 1 pokazuje da su WSI i WAI MP značajno porasli nakon kompleksiranja sa IHM i NabM. To je najvjerovatnije zato što su materijali na bazi Isabgola visoko topljivi u vodi s efektom zgušnjavanja nakon dodavanja adekvatne količine vode [19]. Pored toga, Qaisrani et al. izvijestili su da arabinoksilani Isabgol ljuske imaju kapacitet zadržavanja vode do deset puta veći od njihove suhe težine [20]. Štaviše, MP/IHM ima veći WSI i WAI od MP/NabM budući da IHM ima veći WSI i WAI od NabM. Dodatno, povećanje procenta WSI za MPMC u odnosu na MP dovelo je do povećanja disperzibilnosti ciljnih aktivnih komponenti kada se koriste u terapijskim pitanjima [21]. To je bilo jasno u antikancerogenim rezultatima koji su pokazali da ovi kompleksi imaju citotoksični učinak od MP.

2.3. Bioactive Components

2.3.1. Fenolni spojevi PHM i NabM

Hrana sadrži vrlo važne bioaktivne spojeve (tj. fenole i flavonoide) koji djeluju kao antioksidansi i antikancerogeni. HPLC analiza je potvrdila i kvantificirala prisustvo mnogih fenolnih jedinjenja u Nab i IHM kao što je prikazano na slici 2. Rezultati pokazuju visok sadržaj različitih biološki aktivnih jedinjenja kao što su galna kiselina (177,96 mg/kg), katehol (13,87 mg/kg) p-hidroksi benzojeva kiselina (24,02 mg/kg), katehin (5,93 mg/kg) i rutin (123,70 mg/kg) u ekstraktu PHM i katehol (410,72 mg/kg) p-hidroksi benzojeva kiselina (426,71 mg/kg) (72,05 mg/Kg) Rutin (1750,57 mg/Kg), i ruzmarin (1771,72 mg/Kg) u NabM (Slika 2A,B). Sadržaj ovih jedinjenja je veoma važan za zdravstvene dobrobiti. Antikancerogeno dejstvo fenolnih jedinjenja je ranije prijavljeno. Ovaj efekat se uglavnom pripisuje antioksidativnom dejstvu ovih jedinjenja.

2.3.2. Ukupna fenolna, flavonoidna i antioksidativna aktivnost MP i MPMC

Nekoliko izvještaja je pokazalo da spojevi koji pokazuju antioksidativna svojstva uglavnom pokazuju antikancerogeno djelovanje[22]. Ukupni sadržaj fenola(TP) i ukupnih flavonoida(TF) određen je u NabM, IHM, MP i njihovim kompleksima (Slika 3A, B). Rezultati su pokazali da su TP i TF viši u NabM i MP/NabM u poređenju sa IHM i MP/IHM. Međutim, sadržaji TP i TF bili su značajno niži u MP u odnosu na MPC. Ovi rezultati su se složili sa podacima koje su objavili Singh et al.[23] koji su otkrili da su TP i TF NabM 1,6 GAE mg/100 g suhe težine i 47 mg CE/100 g suhe težine, respektivno. Kompleksi MP/NabM i MP/IHM pokazali su značajno povećanje od 309 posto i 59 posto u TP i 476 posto i 123 posto u TF u odnosu na MP, respektivno. Konjugacija MP sa IHM i NabM dovela je do gubitka od 23 posto i 36 posto TPC odgovarajućih IHM i NabM, respektivno. TF je smanjen za 44 posto u IHM-u i 46 posto u NabM-u kada se kombinuje sa MP. To je najvjerovatnije bilo zbog niskog TP i TF MP.

Potencijalna aktivnost uklanjanja radikala MP/IHM i MP/NabM u poređenju sa MP koristeći DPPH, ABTS i HS ilustrovana je na slici 3C-E. Podaci dobijeni iz aktivnosti tri antioksidansa imali su sličan trend koji ukazuje da je NabM pokazao veću antioksidativnu aktivnost od IHM-a i to je u kontekstu rezultata fenola i

sadržaj flavonoida. Antioksidativni kapacitet MP je povećan nakon kompleksiranja sa NabM i IHM. Sa izuzetkom ABTS testa, antioksidativna aktivnost NabM povećana je konjugacijom sa MP. Antioksidativna aktivnost je pokazala da MPMC ima veću antioksidativnu aktivnost u odnosu na MP. Naša hipoteza ukazuje na moguću interakciju između MP i polisaharida koja dovodi do sticanja potencijalne antioksidativne aktivnosti kao što su opisali Li et al. [24]. Ranije je objavljeno da postoji pozitivna korelacija između kapaciteta čišćenja i sadržaja fenola/flavonoida 5]. Međutim, ne možemo isključiti da se proizvode novi bioaktivni peptidi obogaćeni aminokiselinama koje sadrže sumpor, što objašnjava visoku antioksidativnu aktivnost MPMC u poređenju sa nekompleksiranim komponentama. Štaviše, mali peptidi se oslobađaju u frakcijama surutke što utiče na visoka antioksidativna svojstva [4]. Konačno, sadržaj fenola i flavonoida utiče na različite ćelije raka. Dodatno, tokom in vitro testova ćelijske kulture, ove aktivnosti i mehanizmi su uočeni. Antioksidativna i antikancerogena aktivnost fenola pripisuje se dvostrukim vezama i hidroksilnim supstitucijama na aromatičnim prstenovima [25].

2.4.Aminokiselinski profil MP i MPMC

Aminokiselinski profili MP, NabM, MP/IHM i MP/NabMare ilustrovani na slici 4. Nije bilo značajnih razlika u profilima aminokiselina MP i njegovih kompleksa sa IHM i NabM. Ovo ukazuje da nekovalentna interakcija MP sa polisaharidnom sluzi nije promijenila sastav mliječnih proteina. Rezultati pokazuju visok sadržaj glutaminske kiseline u MP i MPMC (slika 4) [26].

2.5. Reološka svojstva MP i MPMC

2.5.1. Prividna viskoznost

Slika S1 prikazuje viskoznost uzoraka proteina pri različitim vrijednostima okretaja u minuti. IHM i NabM su imali visoku viskoznost pri sporoj rotaciji, ali se viskoznost značajno smanjivala kako se brzina rotacije povećavala. Ovi nalazi su se složili s Chenom i Cheom koji su zabilježili da se prividna viskoznost vodotopive sluzi zelene lave (Monostroma iridium) smanjuje povećanjem brzine smicanja [27].

Rezultati na slici S1 također pokazuju da je kompleksiranje MP sa IHM i NabM rezultiralo značajnim povećanjem (p manje od ili jednako 0.05) prividnog viskoziteta MP. To se može pripisati jedinstvenim svojstvima IHM-a (hidrokoloidnog materijala) koji ima učinak povećanja viskoznosti [28].

2.5.2. Ponašanje protoka

Ponašanje protoka (krive posmičnog naprezanja/brzine smika) proteina mlijeka i njihovih kompleksa ilustrovano je na slici S2. Sa povećanjem brzine smicanja, raste i napon na smicanje. Transformacijom podataka o posmičnom naprezanju i brzini posmika u jednadžbu stepena, vrijednosti indeksa konzistentnosti protoka (K) i indeksa ponašanja tečenja (n) prikazane su u tablici S1. IHM i MP/IHM su imali najveći indeks konzistentnosti protoka. To bi moglo biti zbog visokog viskoziteta vodotopive sluzi IHM-a zbog njegovog visokog kapaciteta za zadržavanje vode i želiranje u vodenom mediju. Rezultati su također pokazali da IHIM, NabM i MP/IHM imaju ponašanje smičnog stanjivanja (nenjutnovske tekućine) sa niskom vrijednosti n u rasponu od 0.25 do 0.64. Ovi rezultati su došli u skladu sa Thanatcha i Praneeom koji su proučavali fizičko-hemijska svojstva Ziziphus mauritiana[29]. S druge strane, n vrijednost MP je bila približno 1(0.99) što ukazuje na Njutnov tok. Slično, n vrijednost za MP/NabM kompleks bila je 0.95 kao što je prikazano u Tabeli S1.

2.6.Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija MP i MPMC

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija korišćena je za ispitivanje termičke stabilnosti MP i njegovih kompleksa sa IHIM i NabM. Termogrami MP i MPMC su ilustrirani na slici S3, a DSC parametri su dati u Tabeli 2. Uočeno je da nije bilo jasnog endotermnog pika na MP termogramu, ali je postojao istaknuti endotermni vrh za MP/IHM i široki endotermni vrh za MP/NabM. To je vjerovatno zbog postupne eliminacije slobodne vode, tačke topljenja NabM, sporog geliranja i denaturacije proteina [30].

Također je zapaženo da je MPMC stabilniji na toplinu od nekompleksiranog proteina, što se vidi po niskoj temperaturi denaturacije MP (101,44 stepena) u poređenju sa MP/IHM i MP/NabM (148,24 i 121,4 stepena, respektivno), kao što je prikazano u tabeli 2. Štaviše, zabilježena je temperatura degradacije MPC od 302,3 stepena, dok nije uočena degradacija MPMC sa porastom temperature do 350C. Ovi nalazi su u skladu sa nekoliko studija, koje su otkrile da se termička stabilnost mlečnih proteina povećava interakcijom sa fenolnim jedinjenjima koja sprečavaju agregaciju proteina [2,31].

Toplota koja ulazi ili izlazi iz sistema tokom reakcije je entalpija (AH). Veća entalpija MP/IHM i MP/NabM u poređenju sa nekompleksiranom MP mogla bi biti posljedica potencijalne kemijske reakcije između proteina mlijeka (surutke i kazeina) i između mliječnih proteina i polisaharida na visokoj temperaturi (Maillardova reakcija)[ 31.

2.7. Transmisiona elektronska mikroskopija (TEM) MP i MPMC

Slika 5 prikazuje mikrostrukturu IHM, NabM, MP i MPMC. Utvrđeno je da je veličina čestice MPMC u nano opsegu (114-250 nm), i da je manja od veličine čestice MP (191-300 nm). Dodatno, TEM MPMC (Slika 5D, E) je otkrio razgranati obrazac formiranih kompleksa. Ovo se može pripisati elektrostatičkoj privlačnosti između proteina mlijeka i polisaharida Goh, et al. [32]. Štaviše, veća razgranata struktura MP/IHM u poređenju sa MP/NabM mogla bi biti odgovorna za njegov veći viskozitet kao što je prikazano na slici S1.

2.8. Biološke studije o MP i MPMC

2.8.1. Antikancerogena aktivnost MP i MPMC

Citotoksični efekat različitih koncentracija (1, 5, 10 i 20 ug/mL) MP i MPMC na ćelije HepG-2 i MCF-7 u poređenju sa MCF-12F i Bij{ {7}} normalne ćelije su ilustrovane na slikama 6 i 7. MPMC je pokazao antikancerogeno dejstvo na ćelije HepG-2 i MCF-7, slike 6A, B, respektivno. Krivulja koja odgovara na dozu pokazala je smanjenje vitalnosti ćelija kao odgovor na veće koncentracije. S druge strane, nije uočen značajan citotoksični efekat MP i MPMC na normalne ćelije Bj-1 i MCF-12F (Slika 6C, D). Naši rezultati su također pokazali da MP/NabM ima veću antikancerogenu aktivnost protiv HepG-2 i MCF{18}} ćelijskih linija raka, sa vrijednostima IC50 od 5,13 i 10,07 ug/mL, respektivno. Dodatno, MP/IHM je pokazao umjereni citotoksični učinak protiv ćelijskih linija raka u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. Sve u svemu, naši citotoksični podaci sugeriraju da kompleksiranje MP sa IHM i NabM značajno povećava antikancerogenu aktivnost u poređenju s nekompleksiranim proteinima mlijeka, kao što je prikazano u Tabeli 3. Također je bilo evidentno da su Hep G-2 ćelije osjetljivije na MP i MPMC u poređenju sa MCF-7 ćelijama što se manifestuje nižim vrijednostima IC50.

Antitumorski efekat antitumorskih peptida dobijenih iz mliječnih proteina je ranije objavljen. U tom kontekstu, Jeong i Hong [33] su primijetili da tripsin hidrolizati -laktalbumina imaju citotoksični efekat na ljudski karcinom kostiju SJSA-1, ljudski kolorektalni karcinom HCT 116 i ćelijske linije humanog raka želuca NCI-N87. Utvrđeno je da o-laktalbumin stupa u interakciju s modulatorima ćelijske površine i mijenja brzinu rasta stanica, intracelularni kalcij i brzinu transporta kalcija [34]. Vrijedi napomenuti da je goveđi laktoferin inducirao apoptozu u MCF7 stanicama na način ovisan o dozi [35]. Štaviše, frakcije kazeina i proteina sirutke u mlijeku pokazale su antitumorske efekte na životinjskom modelu, kao i in vitro antiproliferativnu aktivnost [36]. Osim toga, Elzoghby et al.[37] izvijestili su da se nanočestice kazeina mogu koristiti za kapsuliranje hidrofobnog lijeka protiv raka, flutamida, za kontrolu oslobađanja lijeka, poboljšanje njegove antitumorske aktivnosti i smanjenje njegove hepatotoksičnosti.

Antikancerogeno dejstvo IHIM-a i NabM-a je ranije prijavljeno [6,38]. Citotoksični efekat MP i MPMC može se pripisati prisustvu aminokiselina kao što su glutamin, arginin i cistein za koje se navodi da pokazuju antikancerogenu aktivnost protiv kolorektalnog karcinoma [39]. Ovi rezultati su u skladu sa visokim sadržajem glutaminske kiseline MPMC (Slika 5).

2.8.2. Određivanje nivoa proteina p53, Bax, kaspaze-3 i Bd{5}}

Kako bi se istražio mehanizam citotoksičnosti MPMC, nivo proteina markera apoptoze p53, Bax, Caspase-3 i Bcl-2 određen je u HepG-2, MCF-7 , Bj-1 i MCF-12F ćelijske linije tretirane sa IC0 MPMC (slika 8). Nivo pro- i anti-apoptotičkih markera povezan je sa indukcijom apoptoze u ćelijskim linijama raka[40,41]. Rezultati su pokazali da su MP/NabM i MP/IHM pojačali apoptozu u HepG-2 i MCF-7, ali ne i u MCF-12F i Bj-1 ćelijskim linijama. Nivo kaspaze-3, p53, Bax značajno je povećan u poređenju sa odgovarajućim kontrolama (Slika 8), dok je Bcl-2 protein smanjen u svim tretmanima. Zanimljivo je da je MP također pokazao značajnu promjenu u proteinskim markerima apoptoze. Ovo je bilo u skladu sa rezultatima antikancerogene studije i moglo bi se nazvati citotoksičnim efektom brojnih peptida koji potiču od mliječnih proteina kao što je gore diskutovano (Odjeljak 2.8.1).

2.8.3. Zaštita DNK od oštećenja MPMC od oksidativnog cijepanja RNH1 plazmida

RNH1 plazmidna DNK ima tri oblika na elektroforezi u agaroznom gelu poredani od vrha do dna kao otvorena kružna, linearna i superzamotana kružna DNK. Oksidativni stres Fentonovog reagensa je izazvao oštećenje DNK. Nakon toga, nivo DNK oblika se mijenja. Međutim, otvoreni kružni i linearni oblici ukazuju na oštećenje DNK, a superzamotana kružna DNK ukazuje na veći zaštitni potencijal. U ovom testu smo testirali da li MP i MPMC na svom IC50 mogu zaštititi od degradacije superzamotanog kružnog oblika kao odgovor na oksidativni stres. Kao rezultat toga, i MP/NabM i MP/IHM pokazali su visok zaštitni kapacitet sličan kontroli DNK (trake 3 i 4, slika 9A). S druge strane, nije uočena značajna razlika u DNK tretiranoj MP u poređenju sa DNK kontrolom i DNK tretiranom samo Fentonovim reagensom (traka 5).

2.8.4. Zaštita od oštećenja DNK MPMC od oksidativnog cijepanja genomske DNK

Koristeći PCR tehniku, ispitana su zaštitna svojstva MPMC na oštećenje genomske DNK izazvano Fentonovom reakcijom. Općenito, oštećenje DNK smanjuje broj kopija određenih gena, što dovodi do nižeg intenziteta trake u gel elektroforezi. Testiran je gustina trake MTHFR gena krvne genomske DNK inkubirane sa Fentonovim reagensom sa i bez IC5s0 MP, MP/NabM i MP/IHM. Utvrđeno je da MP/NabM i MP/IHM (trake 3 i 4, slika 9B) sprečavaju oštećenje DNK, a zatim štite mjesto rezanja MTHFR šablona. Stoga je proizveden veći intenzitet trake PCR produkta u gelu za elektroforezu u poređenju sa odgovarajućim kontrolama (Slika 9B). Ovi rezultati su pokazali da antioksidativna aktivnost MPMC inhibira proizvodnju slobodnih radikala koji su posredovali oštećenju DNK.

2.8.5. Gene Expression

U skladu sa dobijenim podacima od proteinskog markera apoptoze, rezultati RT-qPCR otkrili su da inkubacija HepG-2, MCF-7 ćelija sa MP, MP/NabM i MP/IHM izaziva značajnu regulaciju pro- apoptotički mRNA markeri, naime, Casp3, p53 i Bax, dok je nivo ekspresije anti-apoptotičkog markera Bcl-2 bio značajno smanjen (Slika 10A-D). Kaspaze su proteini koji igraju vitalnu ulogu u započinjanju i održavanju apoptoze. Međutim, pojačana regulacija proteina kaspaze 3 ukazuje na izvođenje glavnog intrinzičnog puta apoptoze (Slika 10A, B) koji je karakteriziran kolapsom mitohondrijske membrane s oslobađanjem citokroma c izazvanim Baxom i aktivacijom kaspaze 9 što dovodi do naknadno angažovanje kaspaze 3 [42]. Povećana regulacija Casp3, p53 i Bax, zajedno sa smanjenjem ekspresije Bcl{20}}, otkrila je da MP, MP/NabM i MP/IHM izazivaju apoptozu. U tom smislu, pojačana regulacija p53 stimulira ekspresiju Baxa, što će zauzvrat inducirati oslobađanje citokroma c, nakon čega slijedi aktivacija kaspaze-9 i -3. Međutim, poznato je da Bcl-2 kao anti-apoptoza inhibira oslobađanje citokroma c [43], tretman je rezultirao značajnim smanjenjem nivoa transkripta mRNA anti-apoptotičkog markerskog gena Bcl-2 zbog MP/NabM i MP/IHM tretman, koji olakšava oslobađanje citokroma c bez otpora izazvano Baxom i kasniju apoptozu. U ovoj studiji, MP/NabM je ozbiljno posredovao apoptozom u poređenju sa MP/IHM i MP kao što je uočeno na (Slika 10). Uočeni antikancerogeni efekti MP/NabMor MP/IHM se odvijaju kroz modulaciju ap53-zavisnog puta apoptoze, budući da su nivoi proteina i transkripta mRNA značajno povećani.

Kliknite na link za dodatne informacije:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049190.html