Molekularno kloniranje i biohemijska karakterizacija nove kumarin glikoziltransferaze CtUGT1 iz Cistanche Tubulosa

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

SAŽETAK

UDP-glikoziltransferaze (UGT) su važna i funkcionalno raznolika porodica enzima uključenih u biosintezu sekundarnih metabolita. Kumarin je jedan od najčešćih kostura prirodnih proizvoda s kandidatskim farmakološkim aktivnostima. Međutim, do danas, mnogi su prijavili da GT iz biljaka uglavnom prepoznaju flavonoide kao akceptore šećera. Samo ograničeni GT mogu katalizirati glikozilaciju kumarina. U ovoj studiji je kloniran novi UGTCistanche tubulosa, vrijedna tradicionalna tonik kineska biljka, koja obiluje različitim glikozidima kao što su feniletanoidni glikozidi, lignan glikozidi i iridoidni glikozidi. Usklađivanje sekvenci i filogenetska analiza su to pokazaleCtUGT1je filogenetski udaljen od većine prijavljenih flavonoidnih UGT-a i u blizini fenilpropanoidnih UGT-a. Opsežni in vitro testovi enzima otkrili su da iakoCtUGT1nisu bili uključeni u biosintezu bioaktivnih glikozida uCistanche tubulosa, mogao bi katalizirati glukozilaciju kumarina umbelliferona 1, eskuletina 2 i himekromona 3 u značajnom prinosu. Glikozilirani proizvodi su identifikovani poređenjem sa referentnim standardima ili NMR spektroskopijom, a rezultati su pokazali daCtUGT1može regiospecifično katalizirati glukozilaciju hidroksil kumarina na poziciji C7- OH. Ključni ostaci koji su utvrdiliCtUGT1Dalje se raspravljalo o njegovoj aktivnosti na osnovu homološkog modeliranja i analize molekularnog spajanja. U kombinaciji s rezultatima mutageneze usmjerene na mjesto, otkriveno je da je H19 igrao nezamjenjivu ulogu kao ključna baza katalize.CtUGT1može se koristiti u enzimskoj pripremi bioaktivnih kumarinskih glikozida.

Ključne riječi:Biljne glikoziltransferaze, kumarinski glikozidi,Cistanche tubulosa, Modeliranje homologije, Mutageneza usmjerena na mjesto

Click to Cistanche ekstrakt koristi proizvode

Uvod

Glikozilacija je jedan od najčešćih tipova modifikacije strukture sekundarnih prirodnih proizvoda. Glikozilacija bi mogla promijeniti stabilnost i/ili rastvorljivost aglikona, i mnogo doprinijeti raznolikosti prirodnih/neprirodnih proizvoda zbog višestrukih tipova konjugacije. U biljkama su se ove reakcije obično odvijale pomoću glikoziltransferaza (UGT) zavisnih od uridin difosfata (UGT), vrste enzima koji kataliziraju prijenos monosaharidnih dijelova iz aktiviranog nukleotidnog šećera na molekulu akceptora glikozila koja može biti ugljikohidrat, ligokozid, glikozid. ili polisaharid [1,2]

Do danas su mnogi geni koji kodiraju UGT izolovani iz nekoliko biljaka [3]. Glikozilacija se uglavnom dešava na hidroksilnim grupama ili karboksilnim grupama širokog spektra sekundarnih proizvoda, kao što su flavonoidi [4], fenilpropanoidi [5], terpenoidi [6], steroidi [7], alkaloidi [8] itd. Kumarini su metaboliti fenilpropanoida široko rasprostranjeni u mnogim biljnim vrstama. Prirodni kumarini često postoje kao glikokonjugati, a ovi derivati ​​su pokazali širok spektar farmakoloških aktivnosti, uključujući antioksidativno [9], antivirusno [10,11], hepatoprotektivno [12], protuupalno [13], antikancerogeno [14] ], antimutageni [15] i inhibitorne aktivnosti holinesteraze (ChE) i monoaminooksidaze (MAO) [14,15], itd. Međutim, do danas, u poređenju sa najčešće prijavljenim i opsežnije istraživanim flavonoidima UGT, samo su ograničeni UGT bili prijavljeno je da može prenijeti šećernu skupinu na kumarine [16–18].

Biljke bogate različitim glikozidima mogle bi poslužiti kao idealan genski fond UGT-a s novim aktivnostima katalize. Nadalje, zabilježeno je da brojni UGT posjeduju značajan promiskuitet akceptora da kataliziraju glikozilaciju više supstrata, od kojih neki čak nisu bili razdvojeni u biljkama [19]. U ovom članku, nova glikoziltransferazaCtUGT1je identifikovan izCistanche tubulosa, tradicionalna ljekovita biljka koja obiluje različitim glikozidima kao što su feniletanoidni glikozidi (PhG), lignan glikozidi i iridoidni glikozidi. Heterološka ekspresija i karakterizacija funkcije su pokazali da iako rekombinantnoCtUGT1nije bio uključen u biosintezu ovih glikozida uCistanche tubulosa, može katalizirati glukozilaciju hidroksil kumarina, a reakcija se regiospecifično dogodila na 7- OH poziciji kumarina umbelliferon 1, eskalirajući 2, i himekromon 3 za proizvodnju tri farmakološki aktivna spoja (1a), cihoriin (2a) , i 4-metilumbeliferil glukozid (3a) sa značajnim prinosom, respektivno. Osim toga, benzofenon supstrat 4,4′-dihidroksi benzofenon (4), izoflavonski supstrat genistein (5) i antrakinon supstrat aloe-emodin (6) također mogu biti prihvaćeni od straneCtUGT1. Katalitička svojstva i ključni ostaci koji naglašavaju sposobnost katalizeCtUGT1su također procijenjeni na osnovu homološkog modeliranja, AutoDock analize i mutageneze usmjerene na mjesto.

2. Eksperimentalno

2.1. Biljni materijal i hemikalije

Cistanche tubulosakorištena u ovoj studiji prikupljena je iz pustinjskih područja u autonomnim regijama Hetian, Xinjiang. Njihov botanički identitet potvrdio je profesor Pengfei Tu sa Univerziteta u Pekingu. Testirani kumarini i drugi supstrati u ovoj studiji kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, SAD), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina) i Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Kina ) osim ako nije drugačije navedeno. Referentni standardi za skimming (1a) i cichoriin (2a) su kupljeni od Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Kina).

2.2. Molekularno kloniranje CtUGT1 iz Cistanche tubulosa

Ukupna RNK odCistanche tubulosaekstrahiran je iz mesnate stabljike pomoću OMEGA kompleta biljne RNA (GA, SAD) i reverzno transkribovan na cDNK pomoću PrimeScript™ RT kompleta reagensa (TaKaRa, Japan) prema uputstvima proizvođača. Degenerisani prajmer je dizajniran za 3′RACE na osnovu aminokiselinskih sekvenci u konzerviranoj PSPG (Glikoziltransferaze biljnih sekundarnih proizvoda) kutiji biljnih glikoziltransferaza. Pojačanja na 3′-kraju i 5′-krajuCtUGT1izvedeni su pomoću Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, SAD) prema protokolu proizvođača uz korištenje prajmera (Tabela S1). cDNK pune dužineCtUGT1je amplificiran PCR-om upotrebom KOD-Plus Neo DNK polimeraze (TOYOBO, Japan) sa parovima prajmera specifičnim za gen (Tabela S1) pod sljedećim uvjetima: početni korak denaturacije na 94 ◦C u trajanju od 2 min, nakon čega slijedi 35 ciklusa denaturacije na 98 ◦C tokom 15 s, žarenje na 55 ◦C tokom 30 s, i produžavanje na 68 ◦C tokom 55 s, sa završnim korakom proširenja na 68 ◦C tokom 7 min. Svi dobijeni DNK fragmenti su klonirani u pEASY-Blunt vektor (TransGen Biotech, Kina) i sekvencionirani.

2.3. Usklađivanje sekvenci i filogenetska analiza

Poravnanje sekvenceCtUGT1sa prijavljenim glikoziltransferazama (Tabela S2) izvršeno je korištenjem softverskog paketa DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Kanada). Motivi i domeni su analizirani pomoću alata za očuvane domene (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Filogenetsko stablo je konstruirano bootstrap softverom MEGA 7.0.14 korištenjem metode spajanja susjeda sa 1000 bootstrap replika [20]. Prevedena proteinska sekvencaCtUGT1je usklađen sa poznatim biljnim glikoziltransferazama deponovanim u bazi podataka NCBI GenBank (Tabela S3) sa ClustalW.

2.4. Heterološka ekspresija i pročišćavanje proteina CtUGT1 u Escherichia coli

Regija kodiranja odCtUGT1je amplificiran sa BamH I i Not I kao restrikcijskim mjestima korištenjem prajmera prikazanih u Tabeli S1. PCR reakcije su sprovedene upotrebom KOD-Plus-Neo DNK polimeraze (TOYOBO, Osaka, Japan). Dobijene sekvence su verifikovane kloniranjem u pEASY-Blunt vektor (TransGen Biotech, Kina). Potvrđeni proizvod amplifikacijeCtUGT1je naknadno digestiran i subkloniran u ekspresijski vektor pET-28a( plus ) (Novagen, SAD). Verifikovani konstrukt je zatim transformisan u E. coli Transetta (DE3) da bi se dobio rekombinantni soj. Kultura rekombinantnog soja preko noći je inokulirana u Luria-Bertani (LB) podlogu koja sadrži 50 ug⋅mL− 1 kanamicina i 40 ug⋅mL− 1 hloromicetina u omjeru 1:1{{ 19}}0. Kulture su uzgajane na 37 ◦C, 200 rpm sve dok vrijednost OD600 nije dostigla 0,4–0,6. Izopropil- -D-tiogalaktopiranozid (IPTG) je naknadno dodan do konačne koncentracije od 0,5 mM i ćelije su uzgajane 16 h na 18 ◦C, 180 rpm. Zatim su ćelijske pelete sakupljene centrifugiranjem (7600 × g, 10 min, 4 ◦C) i ponovo suspendovane u 3 mL/g ohlađenog pufera za lizu (Napomena sa dodatnim podacima 1) i poremećene ultrazvukom na ledu. Ostaci ćelija su uklonjeni centrifugiranjem na 7600 × g, 4 ◦C oko 30 min. Pre-ekvilibrirana Histrap kolona (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) korištena je za afinitetnu hromatografiju prema uputama proizvođača. Rekombinantni protein je eluiran sa 10 zapremina kolone pufera za eluiranje (Napomena sa dodatnim podacima 1) koji sadrži 250 mM imidazola. Čistoća proteina je analizirana pomoću 10% SDS-PAGE. Pročišćeni protein je koncentriran u epruveti za ultrafiltraciju od 30 kDa (Sigma-Aldrich, SAD) i odsoljen pomoću PD-10 kolone (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) s puferom za odslađivanje (Napomena sa dodatnim podacima 1). Koncentracija proteina je određena Bradford metodom koristeći BSA kao standard.

2.5. Testovi enzimske aktivnosti i specifičnost supstrata CtUGT1

Da se ispita aktivnost glikozilacijeCtUGT1, enzimski testovi su izvedeni u reakcijskoj smjesi (150 μL) sastavljenoj od 0.4 mM aglikona, 0,8 mM UDP-glukoze (UDPG) i 50 ug pročišćenogCtUGT1proteina u puferu za odsoljavanje. Sve reakcije su inkubirane na 30 ◦C tokom 12 h i prekinute dodavanjem 300 μL hladnog metanola. Smjese su centrifugirane na 15,000 ×g 30 minuta da bi se prikupio supernatant za HPLC-UV/ESI-MS analize. Tri paralelna testa su rutinski sprovedena za svaku reakciju. HPLC (Agilent 1260, SAD) opremljen je detektorom diodnog niza i kolonom CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan) pri brzini protoka od 1 mL⋅min−1 i temperaturi kolone održavana na 30 ◦C. Mobilna faza se sastojala od A (tj. 0,1 posto vodenog rastvora mravlje kiseline) i B (tj. acetonitrila). Gradijentni programi su navedeni u tabeli S4. HRESI-MS podaci su snimljeni na LCMS-IT-TOF sistemu, opremljenom sa ESI interfejsom (Shimadzu, Kjoto, Japan) sa He kao kolizijskim gasom ultra visoke čistoće i N2 kao gasom za raspršivanje. Optimizirani parametri izvora ESI bili su sljedeći: brzina protoka plina u omotaču, 1,5 mL⋅min−1; protok pomoćnog gasa, 1,5 mL⋅min− 1; napon raspršivanja, 4,5 kV; temperatura kapilara, 200 ◦C. Spektri su snimljeni u opsegu 100–1500 m/z za MS analizu sa punim skeniranjem.

2.6. Efekti vremena reakcije, pH vrijednosti i temperature na aktivnost enzima i kinetičke studije CtUGT1

Efekti vremena reakcije, pH vrijednosti i temperature na aktivnost enzimaCtUGT1testirani su korištenjem UDPG-a kao donora šećera i 3 kao akceptora šećera u uvjetima reakcije kao što je gore opisano. Za određivanje optimalnog pH, aktivnost enzima je upoređena u 1{{3}0 mM puferu (limunska kiselina-natrijum citrat) sa pH vrijednostima u rasponu od 3.0 do 6.{{ 14}}, 10{{20}} mM pufer (KH2PO4-K2HPO4) sa pH vrijednostima u rasponu od 6.0 do 8.{{29} }, 100 mM pufer (Tris-HCl) sa pH vrijednostima u rasponu od 7,0 do 9,0, 100 mM pufer (Na2CO3-NaHCO3) sa pH vrijednostima u rasponu od 9,0 do 11,0. Da bi se odredila optimalna temperatura reakcije, reakcije su inkubirane na različitim temperaturama u rasponu od 0 do 65 ◦C. Vremenski tokovi reakcije su evaluirani u 12 različitih vremenskih tačaka između 0 i 24 h. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Reakcione smeše su analizirane pomoću HPLC-MS kao što je gore opisano. Za kinetička proučavanjaCtUGT1, enzimske analize su izvedene u konačnoj zapremini od 100 μL koja sadrži 100 mM KH2PO4-K2HPO4 pufera (pH 8,0), 25 ug prečišćenogCtUGT1, 3 mM UDPG, i različite koncentracije (50–3000 μM) od 3. Reakcije su sprovedene na 37 ◦C tokom 30 min, a zatim prekinute sa 100 μL ledeno hladnog metanola. Sve ove reakcije izvedene su u tri primjerka, a aktivnost enzima je procijenjena kvantificiranjem odgovarajućih glukoziliranih derivata. Kinetički parametri, uključujući Michaelis–Menten konstantu (Km) i Vmax, izračunati su nelinearnom regresijskom analizom pomoću softvera GraphPad Prism 5.

2.7. Selektivnost donora supstrata i šećera CtUGT1

Za istraživanje preferencija supstrataCtUGT1, testirano je ukupno 27 supstrata koji pripadaju različitim strukturnim tipovima koristeći UDPG kao donor. Njihove hemijske informacije su navedene u tabeli S5, a njihove strukture su prikazane na sl. S1 i S2. Istražiti selektivnost donatora šećeraCtUGT1, analize su provedene korištenjem umbelliferona (1), eskuletina (2), himekromona (3), 4,4′-dihidroksi benzofenona (4), genisteina (5) i aloe-emodina (6) kao supstrata sa UDPG, UDP- N acetil galaktozamin, UDP-galaktoza, GDP-manoza, GDP-fukoza, UDP galakturonska kiselina, UDP-ramnoza kao donatori šećera, respektivno. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Reakcione smeše su analizirane pomoću HPLC-MS kao što je gore opisano.

2.8. Priprema 4-metilumbeliferil glukozida (jedinjenje 3a) od strane CtUGT1

Preparativna reakcijska smjesa se sastojala od {{0}}.034 mmol supstratnog jedinjenja 3, 0,04 mmol UDPG, 5 mg prečišćenogCtUGT1u 50 mL reakcijskog pufera. Reakcije su lagano mešane pri optimalnim uslovima (100 mM KH2PO4-K2HPO4 sa pH 8,0; 37 ◦C). Nakon inkubacije na 37 ◦C tokom 24 h, reakcioni supernatant je odvojen hromatografijom na koloni sa makroporoznom smolom (MCI GEL CHP) nakon centrifugiranja na 12,000 × g tokom 30 minuta. Mobilna faza je bila gradijent eluiranja od 100 posto vode do 100 posto metanola. Svaka frakcija je analizirana HPLC-UV. Frakcije koje su sadržavale samo ciljane produkte su isparene do suha pod sniženim pritiskom i karakterizirane 1H nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) spektroskopijom i 13C NMR spektroskopijom.

2.9. Molekularno spajanje i mutageneza CtUGT1 usmjerena na mjesto

Proteinski modelCtUGT1ustanovljen je korištenjem SWISS-MODELA [21–25]. Kristalna struktura Medicago truncatula glikozil transferaze UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) odabrana je kao šablonska struktura [26]. Uspostavljeni model je procijenio VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina je korišten za molekularne studije spajanja [29]. Kristalna struktura UGT74F2 [30], glikoziltransferaze iz Arabidopsis thaliana, u kompleksu sa ligandom UDP i salicilnom kiselinom (PDB ID 5U6M) korištena je kao kontrolna struktura za analizu džepova donatora šećera i džepa akceptora šećera. . Auto-Dock-Tools 1.5.6 iz MGLTools (alata Laboratorije za molekularnu grafiku) korišteni su za pripremu UDPG donatora šećera i supstrata 1, 2 za molekularno spajanje. Bočni lanci ostataka oko šupljine aktivnog mjesta bili su fleksibilni, a rotirajuće veze liganada su ostavljene da se rotiraju. Najbolje rangirana poza prema Vina docking modelu s najvećim (kcat/mol) afinitetom podvrgnuta je vizualnoj analizi pomoću softvera PyMOL 2.0.

Za ispitivanja mutageneze, gen optimiziran za sekvencuCtUGT1(Napomena sa dodatnim podacima 2) sintetiziran je i testiran kao divlji tip. Lokalno usmjerena mutagenezaCtUGT1je sprovedeno korišćenjem sistema brze mutageneze (TransGen Biotech). Mutanti su amplificirani iz šablona optimiziranog gena koji je konstruiran u pET-28vektor korištenjem specifičnih prajmera prikazanih u Tabeli S1. Konstruisani mutanti su verifikovani PCR-om i sekvenciranjem pre transformacije u E. coli (DE3) za heterolognu ekspresiju. Pročišćavanje proteina i enzimske reakcije su izvedene i analizirane kao što je gore opisano.

3. Rezultati i diskusija

3.1. CDNK kloniranje CtUGT1 gena pune dužine izCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) je tradicionalna kineska ljekovita biljka koja proizvodi širok spektar bioaktivnih prirodnih glikozida. Trebao bi postojati znatan broj novih gena za glikoziltransferaze koji su postojali u njegovom genomu. Za traženje novih glikoziltransferaza sa zanimljivim aktivnostima katalize, dizajniran je degenerirani prajmer za 3′-RACE zasnovan na konzerviranom PSPG motivu za kloniranje permisivnih UGT izCistanche tubulosa. Dobijena 3′ krajnja sekvenca je dalje analizirana NCBI blastom i specifičan prajmer za 5′-RACE je dizajniran na osnovu dobijene sekvence. Amplificirani 5′ cDNK krajevi i 3′ cDNK krajevi su spojeni i puna dužinaCtUGT1sekvenca, uključujući 1739 nukleotida, dobijena je (slika S3) i navedena u napomeni o dodatnim podacima 3. Nakon toga, otvoreni okvir za čitanje (ORF) odCtUGT1je pronađen pomoću alata NCBI ORF Finder i kodirajuća sekvenca od 1482 bp je uspješno klonirana RT-PCR amplifikacijama korištenjem specifičnih prajmera u Tabeli S1. cDNK sekvenca CtUGT1 je dostavljena NCBI (pristupni broj MW629113).

3.2. Analiza sekvence i heterologna ekspresija CtUGT1

TheCtUGT1očekivalo se da gen kodira protein od 493 aminokiselinske ostatke sa procijenjenom molekulskom masom od 55,78 kDa. NCBI eksplozija je otkrila da je izvedena proteinska sekvencaCtUGT1dijeli najveći identitet (76,39 posto) sa UGT86A1-slikim enzimima. Biohemijske funkcije ove vrste enzima nisu u potpunosti okarakterisane. Predviđeno je da oni mogu biti uključeni u adaptaciju biljaka na abiotske stresove. Poravnanje aminokiselinskih sekvenci CtUGT1 i drugih biljnih glikoziltransferaza je prikazano na slici S4.

Visoko očuvana 44 ostatka PSPG motiva pronađena su na C-terminalcuCtUGT1. Unutar PSPG-boxa, peptidna sekvenca HCGWNS nalazi se na 373. aminokiselini, koja je otkrivena u 95 posto svih glikoziltransferaza [31]. Konačni ostatak PSPG motiva bio je glutamin, što ukazuje da ovaj enzim ima tendenciju da koristi UDPG kao svog donatora šećera [32] (slika S4). Filogenetsko stablo je konstruisano na osnovu predviđenih polipeptidnih sekvenciCtUGT1i različite vrste glikoziltransferaza biljnog porijekla koje su bile uključene u biosintezu različitih sekundarnih metabolita. Do sada je većina prijavljenih glikoziltransferaza iz biljaka prepoznala flavonoide kao svoje supstrate, kao što su flavon 7-O-glikoziltransferaze, flavonoid 3-O-glukoziltransferaze, izoflavon 7-O-glikoziltransferaze i halkon glikoziltransferaze. Rezultati filogenetskih analiza su to pokazaliCtUGT1nije grupiran u kladu flavonoida GT. Umjesto toga, nalazi se u blizini UGT74T1 i UGT74S1 (lignan glikoziltransferaze iz Linum usitatissimum) i NtGT2 (kumarin glikoziltransferaza iz Nicotiana tabacum), što ukazuje daCtUGT1može imati neke nove aktivnosti katalize prema fenilpropanoidnim supstratima (slika 1), posebno ako se uzme u obzir da su samo ograničeni članovi funkcionalno identificirani koji pripadaju ovim kladama.

Da bi se dalje otkrila njegova katalizačka aktivnost,CtUGT1sekvenca je eksprimirana pod kontrolom T7 lac promotora u E. coli Transetta (DE3) ćelijama kao His6-označeni fuzioni protein. His-označeni rekombinantCtUGT1je efikasno prečišćen do homogenosti Ni-NTA afinitetnom hromatografijom. Molekularna težina pročišćenog rekombinantnog CtUGT1 bila je približno 55 kDa (slika S5), što je u skladu sa predviđenom molekulskom masom.

3.3. In vitro specifičnost akceptorskog supstrata CtUGT1

Za testiranje aktivnosti glikozilacijeCtUGT1, urađeni su in vitro enzimski testovi. UDPG je korišten kao donator šećera. Akceptori šećera su odabrani na osnovu različitih razloga. Prvo,CtUGT1gen je kloniran izCistanche tubulosačije su glavne hemijske komponente PhGs. Da biste provjerili da liCtUGT1je uključen u biosintezu PhGs, uobičajenih aglikona PhG uCistanche tubulosakao što su tirozol (NP1, slika S2) i salidrozid (NP2, slika S2) prvo su odabrani kao supstrati. Nažalost, HPLC i HRESI-MS analize nisu pronašle nikakve glikozilovane proizvode, što je pokazalo daCtUGT1možda neće biti uključeni u biosintezu PhGs.

Drugo, na osnovu poravnanja sekvenci i rezultata filogenetske analize (slika 1),CtUGT1bio je filogenetski povezan s lignanoidnim i kumarin glikoziltransferazama, što sugerira daCtUGT1je vjerovatno fenilpropanoid glikoziltransferaza. Da bi se potvrdilo ovo predviđanje, tri supstrata kumarina 1, 2 i 3 zajedno sa jednim lignanoidnim supstratom magnololom NP17 testirana su kao akceptori šećera. Kao negativna kontrola korišteni su enzimi inaktivirani toplinom (100 ◦C, 10 min). HPLC-HRESI-MS analiza reakcija koristeći NP17 kao supstrat nije pronašla nikakav proizvod. U kontrastu,CtUGT1pokazao očiglednu sposobnost glukozilacije u odnosu na testirane kumarinske supstrate (1,2,3). Koristeći supstrat 1 kao primjer, kao što je prikazano na slici 2A, novi pik (1a) sa smanjenim vremenom zadržavanja (11,46 min) u poređenju sa supstratom 1 (19,75 min) je proizveden od straneCtUGT1sa prinosom od 37,78 posto. Njegov UV apsorpcioni spektar odgovara 1. HRESI-MS spektar je pokazao da pik 1a pokazuje [M plus H] plus pri m/z 325,1029 i [M plus Na] plus pri m/z 347,0710 (izračunato 347,0737 za CNa8O8 ) sa predviđenom formulom C15H16O8, koja je bila 162 amu veća od one od 1 i u skladu sa teoretskom formulom glukoziliranog proizvoda (slika 2A). Slično, glukozilirani proizvod supstrata 2 (14,21 min, slika 2B) i 3 (21,92 min, slika 2C) je također pronađen u vremenu zadržavanja od 10,85 min i 13,80 min, sa stopom konverzije od 22,03 posto i 68,67 posto. , odnosno. Molekularna masa proizvoda tačno se poklapala sa izračunatom masom glukoziliranih proizvoda, što je to i potvrdiloCtUGT1može katalizirati glukozilaciju kumarinskih jedinjenja 1–3 (Tabela 1).

Nakon toga, imajući u vidu da je većina nedavno prijavljenih enzima pokazala promiskuitet katalize in vitro, da bi se dalje istražio spektar supstrataCtUGT1, ekspanzivni enzimski testovi su sprovedeni prema različitim jedinjenjima koja pripadaju različitim vrstama prirodnih proizvoda, uključujući flavonoide, fenolna jedinjenja, kumarine, stilbene, antrakinone, benzofenon, naftalen i iridoid (slike S1-S2), koristeći UDPG kao donator šećera. Utvrđeno je da benzofenon supstrat 4,4′-dihidroksi benzofenon (4), izoflavonski supstrat genistein (5) i antrakinon supstrat aloe-emodin (6) takođe mogu biti katalizovaniCtUGT1da bi se formirao odgovarajući glukozilirani proizvod 4a, 5a, 6a većeg polariteta (slika 3). HRESI-MS analiza je pokazala da su pikovi jona svih proizvoda za 162 amu veći od onih supstrata, što sugerira daCtUGT1može katalizirati glukozilaciju ovih spojeva kako bi se formirao njihov odgovarajući monoglukozidni proizvod. Stope konverzije 4, 5 i 6 bile su 4,12 posto, 14,14 posto i 23,33 posto, respektivno (Tabela 1).

Selektivnost donatora šećeraCtUGT1takođe je istražen. Uz UDPG, šest drugih donora, uključujući UDP-N-acetil galaktozamin, UDP galaktozu, GDP-manozu, GDP-fukozu, UDP-galakturonsku kiselinu i UDP ramnozu, testirano je korištenjem supstrata 1-6 kao akceptora. Rezultati su to pokazaliCtUGT1ekskluzivno odabran UDPG kao donator šećera. Nije uočen proizvod kada su testirani drugi aktivni šećeri (podaci nisu prikazani).

3.4. Biohemijska svojstva i kinetički parametri CtUGT1

Biohemijska svojstvaCtUGT1su istraživani koristeći 3 kao akceptor šećera i UDPG kao donator šećera kao što je prikazano na slici 4. Aktivnost katalizeCtUGT1je testiran u temperaturnom opsegu od 4–60 ◦C, optimalna aktivnost je otkrivena na 37 ◦C (slika 4A). Analiza aktivnosti enzima između pH 3.0 i 9.0 pokazala je da je optimalna pH vrijednost uočena pri pH 8,0 (100 mM pufer KH2PO4-K2HPO4, slika 4C). Prinos produkta glukozilacije 3a se linearno povećao u roku od 1 h, a stopa rasta se izjednačila nakon 5 h (slika 4B). Prividna vrijednost km odCtUGT1za 3 je bio 218,7 ± 7,176 μM, a Vmax je bio 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Enzimska priprema i strukturna identifikacija glukoziliranih proizvoda

Na osnovu rezultata enzimske analize,CtUGT1ima tendenciju da bude specifična glukoziltransferaza koja bi mogla katalizirati glukozilaciju različitih vrsta prirodnih proizvoda. HPLC-HR-MS informacije o proizvodima sažete su u Tabeli 1. Među njima, supstrati kumarina su pokazali značajnu stopu konverzije. Dalje je analizirana aktivnost enzima protiv kumarina. Treba napomenuti da su sva tri testirana kumarinska supstrata prihvaćena od straneCtUGT1imaju hidroksilnu grupu na poziciji C-7, dok eskuletin (2) ima dodatnu hidroksilnu grupu na poziciji C-6. HPLC profil glukoziliranog produkta eskuletina prikazan je na slici 2. Uočen je samo jedan proizvod, što sugerira da se reakcija glukozilacije regiospecifično dogodila na poziciji C-6 ili C-7. Da bi se potvrdilo mjesto glikozilacije, proizvod 2a je identificiran poređenjem s autentičnim glukozidima HPLC-UV/HRESI-MS analizom. Prilikom dodavanja autentičnog glukozida cihoriina (glukoziliranog na 7-OH poziciji 2) u reakcioni sistem, pik se preklapao sa 2a, ko-HPLC profil je dodatno potvrdio da je glikozilirani proizvod 2 kataliziranCtUGT1je cihoriin [33], što je dokazalo da je glukozilni dio specifično prebačen na C7-OH poziciju. Proizvod 1a je također identificiran poređenjem s referentnim standardom. UV-HPLC spektri zajedno sa ko-HPLC analizom (slika 2) otkrili su da je hemijska struktura 1a pripisana kao skiming [34], što je glukozilirani proizvod 1 na poziciji C7-OH.

Proizvod 3a je pripremljen iz povećane reakcije i strukturno karakteriziran HRESI-MS, 1H NMR i 13C NMR spektroskopijom (slike S13, S14 i Napomena 4). U 1H NMR signalu, u poređenju sa supstratom 3, fenol hidroksil signal na poziciji C{{10}} je nestao, a ugljični signal C-7 se pomjerio za δ 1.{{25} } ppm u visoko polje, dok su C-6 i C-8 signali prešli u nisko polje u 13C NMR. Ovi nalazi su potvrdili da je glukopiranozilni ostatak vezan za fenolnu hidroksilnu grupu na C-7 poziciji 3 [35]. Osim toga, 1H NMR spektar je pokazao anomerne protonske signale na δH 5.00 (1H, d, J=7.0 Hz); komponenta šećera je naznačena kao -D-glukopiranoza. Ovaj rezultat je pokazaoCtUGT1je kumarin O-glukoziltransferaza koja je katalizirala glukozilaciju hidroksil kumarina na 7-OH poziciji.

3.6. Modeliranje homologije, molekularno spajanje i mutageneza CtUGT1 proteina usmjerena na mjesto

To su otkrile opsežne enzimske reakcijeCtUGT1mogao katalizirati glukozilaciju tri kumarina u njihov odgovarajući glukozilirani proizvod, a glukozilirani položaj se posebno dogodio na poziciji 7- OH. Identificirati ključne ostatke koji su odredili aktivnosti katalizeCtUGT1, homološko modeliranje, molekularno spajanje i ispitivanje mutageneze usmjerene na mjesto CtUGT1. Homologno molekularno modeliranje za CtUGT1 je uspostavljeno korištenjem SWISS-MODEL-a [21–25]. Kristalna struktura Medicago truncatula glikozil transferaze UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), određena u rezoluciji od 2,1 Å, pokazala je najveći ukupni rezultat s maksimalnom homologijom sekvence i niskom E-vrijednošću, izabrana je kao šablonska struktura [26]. Procjena racionalnosti uspostavljenog modela prikazana je na dijagramu Ramachandran (slika S6), 88,5 posto ostataka u uspostavljenom modelu je u najpovoljnijem regionu. Homološki model CtUGT1 sastoji se od dva slična Rossmannova tipa nabora motiva na N- i C-terminalu, respektivno (slika 5A). N-terminalni domen ima sedam lanaca paralelnih listova oko deset spirala. C-terminalni domen sadrži šestolančane listove okružene sa devet spirala (slika 5A, S7).

Da dodatno razjasnimo aktivni džepCtUGT1, izvršeno je molekularno spajanje. Pošto UGT85H2 ima samo strukturu apo forme, drugi homolog UGT74F2 sa UDP i salicilnom kiselinom kao dva liganda odabran je kao kontrolni šablon. UDPG je pripremljen kao donator šećera. Kao akceptori šećera pripremljena su dva kumarinska supstrata 1 i 2. Vezna mjesta donora i akceptora glikozila su izračunata i spojena odvojeno kao što je prikazano na slici 5. Rezultati su pokazali da se oba džepa za vezivanje nalaze unutar dubokog rascjepa u području interakcije čvrsto zbijenog N-terminus domena i C -terminus domenaCtUGT1i prostorno blizu jedna drugoj (slika 5A). C-terminus odCtUGT1uglavnom je uključen u kontakt sa donorom glikozila kao što je opisano u UGT-ovima drugih biljaka, a većina okolnih ostataka je hidrofilna i visoko konzervirana. Kao što je tipična PSPG kutija, ostatak W377 u ovom motivu mogao bi formirati vodonične veze sa glukoznom grupom UDPG (slika 5B); N378 i S379 u ovom motivu mogu formirati vodonične veze sa difosfatnom grupom UDPG (slika 5B). Osim toga, prema rezultatima pristajanja, ostaci W356 i Q359 mogu stupiti u interakciju sa uridin grupom kroz interakciju vodonične veze kako bi stabilizirali donora u aktivnom džepu. Da bi se potvrdila funkcija ovih predviđenih ključnih ostataka, odabrano je ukupno 16 mjesta i podvrgnuto skeniranju alanina mutagenezi. Aktivnosti katalize ovih mutanata testirane su korištenjem svih šest gore navedenih pozitivnih supstrata. HPLC analize su pokazale da, kada su ostaci G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 i D398 bili mutirani u glykoslacionu aktivnost proteina, aktivnost proteina je bila mutirana. potpuno izgubljen u odnosu na sve testirane podloge. Ovi rezultati sugeriraju da su gornjih 16 ostataka ključni ostaci koji su odredili vezivanje donora UDPG i aktivnost glikozilacijeCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 posto) kao što su V14, V132, E153, T212 i I209 (slika S8). Predviđa se da bi ovi hidrofobni ostaci koji okružuju aromatični prsten mogli formirati van der Waalsove interakcije sa supstratom u džepu za vezivanje.

4. Diskusija

Glikozilacija je jedan od najvažnijih koraka modifikacije u putevima biosinteze mnogih sekundarnih metabolita. Glikozilacija bi mogla povećati bioraspoloživost prirodnih proizvoda poboljšavajući njihovu topljivost u vodi i smanjujući njihovu toksičnost. Kumarin se smatra najjednostavnijim oblikom u ogromnoj klasi fenolnih supstanci koje se pojavljuju u prirodi, konstruiranih od -pironskog prstena spojenog s benzenskim prstenom. Prirodna i sintetička jedinjenja na bazi kumarina privukla su veliku pažnju medicinskih hemičara i naučnika koji dizajniraju lekove kao posledica svojih raznovrsnih farmakoloških i bioloških svojstava [36]. Dalja glikozilovana modifikacija kumarina mogla bi pomoći u obogaćivanju strukturne raznolikosti ovih spojeva i poboljšanju njihove rastvorljivosti i biodostupnosti. U biljkama, takav proces glikozilacije katalizira UDP-glikoziltransferaza. Iako je višestruko UGT identificirano iz različitih biljaka, do danas je većina prijavljenih UGT bila uključena u glikoziliranu modifikaciju flavonoida. Samo ograničeni UGT-ovi su prijavljeni da mogu prihvatiti kumarine kao supstrate. U ovoj studiji, novi gen za glikoziltransferazuCtUGT1kloniran je iz tradicionalne kineske biljkeCistanche tubulosa. Usklađivanje sekvenci i rezultati filogenetske analize su to pokazaliCtUGT1je filogenetski udaljen od većine prijavljenih flavonoidnih UGT-a i mnogo blizak fenilpropanoidnim UGT-ovima. Opsežni testovi enzima otkrili su da CtUGT1 ne može katalizirati glikozilaciju jedinjenja fenil etanola u formiranje PhGs, što je glavna kemijska komponentaCistanche tubulosa. Umjesto toga, mogao bi prepoznati kumarine kao svoje supstrate i provesti reakciju glikozilacije. Razjašnjenje strukture proizvoda pokazalo je da mjesto glikozilacije kataliziranoCtUGT1regiospecifično se dogodilo na C7-OH poziciji kumarina. Koristeći CtUGT1, tri kumarinska glikozida uključujući skiming (1a), cihoriin (2a) i 4-metilumbeliferil glukozid (3a) uspješno su enzimski sintetizirana i strukturno identificirana. Sva ova tri spoja prijavljena su kao farmaceutski aktivne molekule. Na primjer, smatra se da 1a posjeduje različite farmakološke aktivnosti, uključujući renoprotektivnu aktivnost, antiinflamatorna, antikancerogena i antiamebna svojstva [37]. 2a pokazao je visoku antibakterijsku aktivnost protiv nekih Gram-pozitivnih bakterija kao što su Bacillus cereus i Staphylococcus aureus [38]. 3a može pomoći biljkama da poboljšaju svoje sposobnosti odgovora na kemikalije i toksine [39].

Osim kumarina, opsežni testovi enzima su to otkriliCtUGT1također je pokazao vidljivu aktivnost glukozilacije prema benzofenon supstratu 4, izoflavonskom supstratu 5 i antrakinon supstratu 6, što ukazuje da CtUGT1 ima određenu toleranciju supstrata. ipak,CtUGT1nije mogao katalizirati biosintezu komponenti glikozida uCistanche tubulosakao što su feniletanoidni glikozidi (PhG), lignanoidni glikozidi i iridoidni glikozidi. Osim toga, prema dosadašnjim istraživanjima, nisu izolirani kumarinski glikozidiCistanche tubulosa. Dakle, in vivo funkcijaCtUGT1još treba dalje istražiti. Glukozilacijska aktivnost CtUGT1 prema kumarinskim supstratima čini ovaj enzim korisnim alatom za enzimsku glikozilacijsku modifikaciju kumarina i također ukazuje da bi sekundarni metabolički enzimi biljaka mogli obavljati neprocjenjive aktivnosti katalize koje su daleko izvan njihovih prirodnih funkcija.

Izjava o konkurentskim interesima

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Priznanje

Ovaj rad je finansijski podržala Pekinška fondacija za prirodne nauke (Grant br. 7192112); Program sponzorisanja mladih elitnih naučnika od strane CAST-a (Grant br. CACM− 2018− QNRC1− 02); Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (Grant br. 81402809); Državni fond za stipendije Kineskog vijeća za stipendije (Broj granta 201906555010) i Naučna fondacija za elitne mlade stipendiste Pekinškog univerziteta kineske medicine (grant br. 2018-JYB-XJQ006).

Dodatak A. Dodatni podaci

Dodatni podaci za ovaj članak mogu se naći na mreži na https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Od: ' Molekularno kloniranje i biohemijska karakterizacija nove kumarin glikoziltransferazeCtUGT1odCistanche tubulosa' byXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Reference

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Filogenetička analiza multigenske porodice UDPglikoziltransferaze Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glycosidases for oligosaccharide synthesis, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Neobična biosinteza šećera i glikodiverzifikacija prirodnih proizvoda, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Napredak u in vivo i in vitro glikozilacijama flavonoida, Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molekularno kloniranje i karakterizacija UDP-glukoze: hlapljiva benzenoid/fenilpropanoid glukoziltransferaza u cvjetovima petunije, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijaković, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosintetičke UDP-glikoziltransferaze iz biljaka, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Istraživanje funkcionalnog značaja enzima sterol glikoziltransferaze, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Primarna in vivo steroidna alkaloid glukoziltransferaza iz krompira, Phytochemistry. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Antioksidativna aktivnost citrusnih limonoida, flavonoida i kumarina, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Antivirusna aktivnost angelicina protiv gamaherpes virusa, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Derivati ​​na bazi kumarina sa snažnom anti-HIV aktivnošću, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Antioksidativna aktivnost i hepatoprotektivni potencijal Cedrelopsis grevei na oksidativni stres izazvan cipermetrinom i oštećenje jetre kod mužjaka miševa, BMC Complement. Altern. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Kumarin: potencijalno jezgro za antiinflamatorne molekule, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Derivati ​​kumarina kao antikancerogena sredstva za terapiju karcinoma pluća: pregled, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: prirodna, privilegirana i svestrana skela za bioaktivna jedinjenja, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/molecules23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, kloniranje i karakterizacija glukoziltransferaze koja reaguje na 7-hidroksilnu grupu flavonola i 3-hidroksilnu grupu kumarina iz ćelije duhana, arh. Biochem. Biophys. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosinteza kumarinskih glikozida transgenim dlakavim korijenima Polygonum multiflorum, Biosci. Biotechnol. Biochem. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Molekularno kloniranje i karakterizacija kumarin glukoziltransferaze u dlakavim korijenima Pharbitis nil (Ipomoea nil), Plant Tissue Cult. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Molekularna i strukturna karakterizacija promiskuitetne Cglikoziltransferaze iz Trolliusa Chinensis, Angew. Chem. Int. Ed. inž. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: analiza molekularne evolucione genetike verzija 7.0 za veće skupove podataka, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: modeliranje homologije proteinskih struktura i kompleksa, Nukleinske kiseline Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Automatsko uporedno modeliranje strukture proteina sa SWISS-MODEL i Swiss-Pdb preglednikom: istorijska perspektiva, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, SWISS-MODEL repozitorijum-nove karakteristike i funkcionalnost, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo ograničenja udaljenosti primijenjena na procjenu kvaliteta modela, Bioinformatika. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modeliranje proteinske kvaternarne strukture homo- i hetero-oligomera izvan binarnih interakcija putem homologije, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, Kristalna struktura Medicago truncatula UGT85H2-uvida u strukturnu osnovu multifunkcionalnog (izo)flavonoida glikoziltransferaza, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Procjena modela proteina sa trodimenzionalnim profilima, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: program za provjeru stereohemijskog kvaliteta proteinskih struktura, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: poboljšanje brzine i tačnosti spajanja s novom funkcijom bodovanja, efikasnom optimizacijom i višenitnošću, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Razlike u konjugacijama glukoze salicilne kiseline od strane UGT74F1 i UGT74F2 iz Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glikoziltransferaze u sintezi biljnih prirodnih proizvoda: karakterizacija porodice supergena, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Promjena specifičnosti donora šećera biljnih glikoziltransferaza mutacijom u jednoj tački, Arch. Biochem. Biophys. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glukozilacija fenolnih jedinjenja pomoću dlakavog korijena Pharbitis nil: I. Glukozilacija kumarina i derivati ​​flavona, Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hidroliza toksičnih prirodnih glukozida katalizirana ciklodekstrin dicijanohidrinima, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformacija derivata hidroksikumarina kultivisanim ćelijama suspenzije Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Nedavni napredak sredstava protiv raka na bazi kumarina: ažuriran pregled, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Efekti derivata kumarina, 4-methylumbelliferona, na klijanje sjemena i uspostavljanje sadnica u Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Osam novih seskviterpenoida eudesmane- i eremophilane tipa iz Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Određivanje i farmakokinetička studija skimminga pomoću UHPLC-MS/MS u plazmi štakora, J. Pharm . Biomed. Anal. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.