Metformin poboljšava stabljiku matičnih ćelija ljudskih masnoća pomoću Downmodulacije

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Masno tkivo igra važnu ulogu u regulaciji metaboličke homeostaze tako što pohranjuje višak masti i štiti druge organe od lipotoksičnosti. Starenje je povezano s centralnom preraspodjelom masti, što kulminira smanjenjem potkožnog tkiva osjetljivog na inzulin i povećanjem visceralnih masnih depoa otpornih na inzulin. Matične ćelije izvedene iz masnog tkiva (ASC) igraju važnu ulogu u regeneraciji masnog tkiva. Ostarjeli ASC pokazuju smanjenu stabljiku i regenerativni potencijal zbog akumulacije oksidativnog stresa i oštećenja stanica povezanih s mitohondrijskom disfunkcijom. Metformin je dobro uspostavljen antidijabetički lijek koji je pokazao efekte protiv starenja kod različitih organizama i životinjskih modela. U ovoj studiji analizirali smo učinak liječenja metforminom na stabljiku humanih ASC u ćelijskoj kulturi i modelima kulture cijelog masnog tkiva. Naši rezultati pokazuju da metformin poboljšava stabljiku ASC-a, smanjujući njihovu stopu proliferacije i diferencijaciju adipocita. Istražujući mogući osnovni mehanizam, uočili smo smanjenje aktivnosti mTOR i ERK u ASC tretiranim metforminom. Osim toga, primijetili smo povećanje aktivnosti autofagije nakon liječenja metforminom. Zaključujemo da liječenje metforminom poboljšava stablo ASC smanjujući mTOR i ERK signalizaciju i poboljšavajući autofagiju. Buduće in vivo evaluacije na životinjskim modelima i ljudima otvorit će put za kliničku adaptaciju ovog dobro uspostavljenog lijeka za oživljavanje stabljike ostarjelih matičnih stanica.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi:masne matične ćelije; masno tkivo; stabljika; diferencijacija; proliferacija; metformin;mTOR; ERK; autofagija

1. Uvod

Masno tkivo je dinamičan organ koji doprinosi važnoj homeostatskoj ulozi u regulaciji ravnoteže nutrijenata, osjetljivosti na inzulin i imunološke modulacije. Masno tkivo obavlja ovu ulogu skladištenjem i oksidacijom viška masnih kiselina, čime se sprječava steatoza i lipotoksičnost u drugim organima [1]. Inzulinska rezistencija povezana sa godinama je najraširenija metabolička bolest. Otprilike 25 posto američke populacije starije od 65 godina pati od dijabetesa, što rezultira većom stopom mortaliteta, smanjenim funkcionalnim statusom, povećanim rizikom od hospitalizacije i prevelikim opterećenjem zdravstvene ekonomije [2]. Iako je povezanost između dijabetesa i gojaznosti odavno prepoznata, veza između starenja i dijabetesa tipa 2 ostaje nedostižna [3]. Prvo zapažanje koje se odnosi na pad tolerancije na glukozu sa starenjem je napravljeno 1921. godine [4]. Nekoliko studija je od tada identificiralo smanjenu osjetljivost na inzulin kao primarni uzrok poremećaja metabolizma glukoze usljed starosti [5,6]. Na osnovu anatomske lokalizacije, masno tkivo se može široko podijeliti na dva depoa: potkožni i visceralni depoi masnog tkiva. Lokacija i funkcija depoa masnog tkiva važni su u smislu osjetljivosti na inzulin; na primjer, visceralni depo je otporniji, dok je potkožni depo osjetljiviji na inzulin [7]. Postepeni gubitak volumena potkožnog masnog tkiva usljed starenja dovodi do smanjenog unosa glukoze i lipida, što dovodi do prelijevanja lipida i ektopičnog taloženja lipida u mišićima i jetri, što doprinosi razvoju inzulinske rezistencije [8].

Masno tkivo se sastoji od različitih tipova ćelija. Enzimskom digestijom masnog tkiva kolagenazom nastaju dvije glavne frakcije: frakcija adipocita i stromalna vaskularna frakcija (SVF)[9]. SVF se sastoji od matičnih ćelija dobijenih iz masnoće (ASC), limfocita, endotelnih ćelija, pericita i fibroblasta [10]. ASC su imuno-fenotipski definirane kao CD34 plus CD90 plus CD29 plus CD45-CD31 ćelije mezenhimskog porijekla, koje pokazuju sposobnost diferencijacije tri linije u kosti, hrskavicu ili masnoću [11,12]. U bijelom masnom tkivu, ove stanice se uglavnom nalaze u vaskularnoj stromi oko malih krvnih žila i mogu proliferirati i diferencirati se u adipocite[11]. Matične ćelije izvedene iz masnog tkiva (ASC) igraju važnu ulogu u regeneraciji masnog tkiva prolazeći kroz proliferaciju, samoobnavljanje i diferencijaciju. Starenje je povezano s gubitkom ovih svojstava stabljike u ASC [13,14]. Vjeruje se da je smanjenje veličine potkožnog masnog depoa povezano sa starenjem uzrokovano izmijenjenom replikacijom i diferencijacijom ASC[15-17]. Findeisen et al. ukazuju na akumulaciju oksidativnog stresa u masnom tkivu tokom starenja, što negativno utječe na kapacitet diferencijacije;[15] međutim, tačan mehanizam(i) koji leži u osnovi gubitka stabljike kod ASC nije shvaćen. Nedavne studije su pokazale da su smanjena autofagija, viši mehanički cilj aktivnosti puta rapamicina (mTOR) i akumulacija reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) povezani sa gubitkom stabljike u ASC i indukcijom preranog starenja u ASC [18-20].

Cistanche može protiv starenja

Metformin je antidijabetički lijek koji se obično koristi za snižavanje šećera u krvi i poboljšanje osjetljivosti na inzulin. Može se koristiti za liječenje raznih metaboličkih poremećaja povezanih sa starenjem, kao što su kardiovaskularne bolesti, rak i kognitivni pad [21,22]. Efekti metformina koji povećavaju dugovječnost dokazani su kod crva, miševa i pacova putem ograničenja u ishrani, što oponaša efekat stimulacije aktivnosti protein kinaze aktivirane adenozin monofosfatom (AMPK)[23]. Razne studije su pokazale da metformin inhibira cilj rapamicina (mTOR) kod sisara[24,25]. AMPK-mTOR signalni putevi specifično reguliraju karakteristike ćelijskih homeostaza, kao što su autofagija, proliferacija, energetski metabolizam i sinteza proteina [26]. Pokazalo se da metformin inhibira proliferaciju, diferencijaciju i upalu, smanjujući oksidativni stres i mitohondrijski potencijal i poboljšavajući ukupnu stabljiku u različitim tipovima odraslih matičnih ćelija [27,28]. Učinak metformina na metabolizam i stabljiku ASC in vitro i in vivo nije jasan.

U ovoj studiji koristili smo 2D kulturu ljudskih ASC-a i čitave tehnike kulture ljudskog masnog tkiva kako bismo simulirali in vivo ćelijsku organizaciju i mikrookruženje tkiva. Koristeći ove eksperimentalne modele, proučavali smo učinak liječenja metforminom na diferencijaciju, proliferaciju i stabljiku ASC i istraživali molekularne mehanizme uključene u ove ćelijske procese.

2. Materijali i metode

2.1. Specifikacije donatora

Masno tkivo je sakupljeno od pet donora bez dijabetesa u starosnoj dobi 39±13 i BMI rasponu od 27±4 koji su bili podvrgnuti elektivnim procedurama plastične hirurgije u Medicinskom centru Univerziteta u Pitsburgu (UPMC). Proceduru prikupljanja tkiva odobrio je Institucionalni odbor za reviziju Univerziteta u Pitsburgu (IRB br. 0511186).

2.2. Izolacija i kultivacija ljudskih ASC

Prekursorske ćelije adipoze izolovane su na sledeći način[19,29]. Biopsije masnog tkiva nakon hirurških procedura prebačene su u laboratoriju u sterilnom zatvorenom kontejneru. Tkivo je isprano Dulbecco-ovom fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) nakon čega je uslijedilo uklanjanje vlaknastog materijala i krvnih sudova disekcijom. Tkivo je izrezano na komade (1-2 mg) i digestirano u puferu za varenje (HBSS koji sadrži 200 U/mL kolagenaze (CLS Type II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI , SAD) i 2 procenta bez BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD)) uz mešanje 60 minuta na 37 stepeni; 1 mg masnog tkiva/3 mL pufera za varenje. Raspršeno tkivo je centrifugirano 10 minuta na 200×g na sobnoj temperaturi. Plutajući adipociti su aspirirani, a peletirane ćelije stromalne vaskularne frakcije (SVF) suspendovane su u puferu za lizu eritrocita (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) i inkubirane na sobnoj temperaturi 10. Da bi se uklonili ostaci tkiva, suspenzija ćelija je filtrirana kroz najlonsku mrežicu (veličina pora 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Nakon drugog koraka centrifugiranja (10 min na 200×g) peletirani SVF je suspendiran u ASC mediju (Dulbecco-ov modificirani Eagleov medij (DMEM)/F-12 medij (1:1) sa HEPES-om i L-glutaminom (Thermo Fisher). Scientific, Waltham, MA, USA）, dopunjen sa 33 μM biotina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 17 μM pantotenata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 10 ng/mL EGF,1 ng/mL bFGF, 500 ng/mL inzulina, 2,5 posto fetalnog goveđeg seruma i 12,5 μM/mL gentamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i zasijano u gustini od 50,000 ćelija /cm2 u tikvicama T175.

Nakon postizanja 70 posto konfluencije, ćelije su isprane PBS-om i tripsinizirane korištenjem 0,05 posto tripsin-EDTA 1x otopine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Tripsin je inaktiviran dodatkom ASC medijuma plus 10 procenata FBS i uklonjen centrifugiranjem na 300×g tokom 5 minuta pre nego što su ćelije zasejane pri gustini od 5000 ćelija/cm². ASC-ovi su ponovo porasli do 70 posto ušća prije razdvajanja. ASC-ovi u odlomcima 3-4 su korišteni u ovoj studiji. Ćelije su tretirane različitim koncentracijama metformina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), rapamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ili inhibitora U0126 prema eksperimentalnoj shemi.

2.3. Adipogena diferencijacija

Za indukciju adipogeneze, ASC su zasijani u gustini od 50,000 ćelija/cm² u 6-pločama za kulturu ćelija. Adipogeneza je inducirana korištenjem medija za diferencijaciju, sastavljenog od 0.2 uM insulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD),0.5 mM 1-metil{{9 }}izobutilksantin (IBMX) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), 0,25 µM deksametazon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i 10 ug/mL transferin (St. Louis, St. Louis) (-Aldrich transferin) Louis, MO, SAD) u ASCmedium. Nakon 3 dana diferencijacije, podloga je promijenjena, a ćelije su kultivirane u mediju za diferencijaciju bez IBMX-a 14 dana.

2.4. Kultura masnog tkiva

Kultura masnog tkiva izvedena je u 6-pločama za ćelijsku kulturu, uz određene modifikacije, kako su objavili Harms et al. [30]. Cijelo masno tkivo je isječeno na manje komade veličine 3-5 mm i uzgajano u podlozi za ćelijsku kulturu od 5 mL. Ćelijska cjedila s veličinom pora od 70 μM držana su preko fragmenata tkiva kako bi se tkivo održalo potopljeno u mediju. Fragmenti tkiva su digestirani kolagenazom, kao što je gore objašnjeno za proceduru izolacije ASC, a SVF je analiziran na ekspresiju gena matičnjaka povezanih sa ASC.

2.5. Oil Red O bojenje

Za vizualizaciju lipidnih kapljica, ćelije su fiksirane sa 4 procenta paraformaldehida u PBS u trajanju od 1 h i obojene sa 0.3 procenta uljno crveno O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u izopropanolu/vodi ( 60:40) za 1 h. Završno pranje je obavljeno dva puta destilovanom vodom. Za kvantifikaciju apsorbovanog Oil Red O, mrlja je eluirana izopropanolom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), a optička gustina je izmjerena na 518 nm.

2.6. Bodipy Bojenje

Dana 14. nakon indukcije adipogeneze, ćelije su obojene Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, USA) i Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 30 minuta na 37 stepeni. Slike su dobijene pomoću fluorescentnog mikroskopa i analizirane pomoću softvera ImageJ.

2.7. FlouCytometry

ASC u trećem pasusu korišteni su za protočnu citometrijsku analizu površinske ekspresije CD29 (Biolegend, San Diego, Kalifornija, SAD), CD90 (Biolegend, San Diego, Kalifornija, SAD), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, SAD) , CD24 (Biolegend, San Diego, Kalifornija, SAD) i CD31 (BD, NJ, SAD). Ćelije su tripsinizirane, isprane PBS-om i obojene antitijelima u FACS puferu za bojenje (1 posto BSA u PBS-u). Neobojni ASC su korišteni kao kontrola. Fluorescentni signal je mjeren pomoću protočnog citometra (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, SAD), a podaci su analizirani korištenjem softvera FlowJo (BD, Franklin Lakes, NJ, SAD).

2.8. Osteogena diferencijacija

ASC su uzgojeni do konfluencije u {{0}} pločama, a osteogena diferencijacija je inducirana korištenjem osteogenog medija (DMEM 10 posto FBS, 0,1 uM deksametazona, 10 mM -glicerol fosfata i 50 μM askorbinske kiseline). Na dan 21 nakon diferencijacije, ćelije su fiksirane u 4 posto paraformaldehida (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i obojene sa Alizarin crvenom bojom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). obavljeno je pomoću softvera Image J.

2.9. Detekcija apoptoze bojenjem Aneksinom V-APC/PI

Apoptotična ćelijska smrt je mjerena korištenjem Annexin V-APC/PI kompleta (Biolegend, San Diego, CA, SAD). Ukupno 10,000(ćelija/bažirić) ASC-a je zasijano na 6-ploče i inkubirano na 37 stepeni sa 5 posto CO2. Ćelije su tretirane metforminom (0.25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM i 5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Nakon 72 sata tretmana, ćelije su sakupljeno tripsinizacijom i obojeno sa 2,5 μL AnnexinV-APC i 2,5 μL PIin veznog pufera, inkubirano u mraku na sobnoj temperaturi 15 do 20 minuta i analizirano protočnom citometrijom (Fortessa, BD, NJ, SAD).

2.10. Detekcija vrsta reakcionog kiseonika

Nivoi ROS su određivani upotrebom fluorescentne boje 2',7'-dihlorofluorescein diacetat (DCFH2-DA) sonde (Invitrogen, Waltham, MA, USA). ASC (10,000 ćelija/bunarić) su kultivisane u 6-pločici i inkubirane sa metforminom (5 mM) na 37 stepeni, 5 procenata CO, tokom 72 sata. Nakon inkubacije, ASC su tripsinizirani i obojeni sa 50 μM DCFH2-DA bojom 30 minuta na 37 stepeni i analizirani pomoću fluorescentnog mikroskopa.

2.11. TMRM bojenje

ASC (10,000 ćelija/jažicu) su uzgajane u 6-jažici, tretirane različitim dozama metformina (5 mM) tokom 72 h i inkubirane na 37 stepeni sa 100 nM TMRM (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, SAD) 30 min na 37C. Nakon inkubacije, ćelije su posmatrane pod fluorescentnim mikroskopom. Image] je korišten za kvantifikaciju fluorescencije mikroskopskih slika.

2.12. Kvantitativna RT-PCR genska ekspresija

Ukupna RNK je izolovana pomoću RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka), a sinteza cDNK je izvedena sa RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Gene-specifični prajmeri su kupljeni od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD. Kvantitativna analiza ekspresije izvršena je korišćenjem Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kvantifikacija mRNA je izvršena korištenjem -aktina za normalizaciju. Podaci za svaki transkript gena su normalizovani izračunavanjem razlike (ACt) između Ct-housekeeping i Ct-Target gena. Relativno povećanje ili smanjenje ekspresije izračunato je poređenjem referentnog gena sa ciljnim genom (AACT) koristeći formulu za relativnu ekspresiju (=24ACt).

2.13. Western Blot

Western blot analiza je izvedena u suštini kako je opisano [19]. Metoda korišćena za normalizaciju nivoa proteina je "Pierce BCA Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ćelijski lizati (15 ug ukupnog proteina po traci) pripremljeni su u puferu za uzorke natrijum dodecil sulfata (SDS), razdvojeni pomoću SDS-PAGE i blotirani na poliviniliden difluoridnim membranama. Korištena su sljedeća antitijela: mišji anti-humani -aktin (Proteintech, IL, USA), perilipin (Cell Signaling, MA, USA), fosfor-P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), ukupni P70S6K (Cell Signaling, MA, SAD), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, SAD), ukupni ERK1/2 (Cell Signaling, MA, SAD), anti-mišji IgG HRP konjugat (Proteintech, IL, SAD) i zečji anti-pacov IgG HRP( Proteintech, IL, SAD). Za denzitometrijske analize korišten je softver Image J. 2.14.Statistička analiza

Statističke analize su obavljene u GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornija, SAD). Za FACS analizu je korišten FlowJo. Značajnost razlike između srednjih vrednosti procenjena je Studentovim t-testom ili analizom varijanse. Gola greška je predstavljena kao srednja vrijednost ± SEM. Vrijednosti su bile značajne pri p vrijednostima od<><0.01 and=""><>

3. Rezultati

Metformin je dobro uspostavljen antidijabetički lijek za koji se pokazalo da igra važnu ulogu u produženju dugovječnosti [31]. Da bismo proučili učinak liječenja metforminom na stabljiku matičnih stanica dobivenih iz masnoće, izolovali smo ASC iz masnog tkiva humanih donora digestijom kolagenazom. Izolovani ASC su bili plastični adherentni i pokazali su fibroblastičnu ili vretenastu morfologiju. Analiza protočne citometrije pokazala je da su ASC pozitivni na markere mezenhimalnih matičnih stanica, kao što su CD29, CD90 i CD24, ali negativni na marker hematopoetske loze CD45 i marker endotelne loze CD31 (Slika 1A). Pored prikaza tipičnog ASC fenotipa, ASC su pokazali snažan potencijal adipogene i osteogene diferencijacije, identifikovan Bodipy i Alizarin Red S bojenjem, respektivno (Slika 1B).cistanche แอ ม เว ย์Karakterizirani ASC su korišteni za daljnje eksperimente u našem istraživanju.

U literaturi je objavljeno da metformin smanjuje adipogenu diferencijaciju matičnih stanica. Cilj nam je istražiti regulaciju diferencijacije adipocita ASC nakon liječenja metforminom. ASC su liječeni 1,2,5 i 5 metforminom počevši 2 dana prije adipogene indukcije i tokom procesa diferencijacije. Bodipy i Oil Red Ostains korišteni su za vizualizaciju kapljica ulja 14. dana nakon indukcije diferencijacije. Rezultati Oil Red O (Slika 1C) i Bodipy bojenja (Slika 1D) otkrivaju da liječenje metforminom značajno inhibira adipogenu diferencijaciju na način ovisan o dozi u poređenju s kontrolnim stanicama. Inhibicija adipogene diferencijacije dalje je potvrđena korišćenjem Western blot analize proteina perilipina markera diferencijacije adipocita. Za to su 14. dana adipogene diferencijacije prikupljeni ćelijski lizati iz diferenciranih ćelija i analizirana je ekspresija perilipina. Naši Western blot rezultati pokazuju značajno smanjenje ekspresije perilipina nakon tretmana metforminom tokom adipogene diferencijacije (Slika 1E), što je koreliralo sa smanjenjem Bodipy i Oil Red O mrlja. Zaključujemo da liječenje metforminom inhibira adipogenu diferencijaciju humanih ASC, pri čemu je veličina inhibicije u pozitivnoj korelaciji s dozom liječenja metforminom.

Veće stope diferencijacije i proliferacije rezultiraju gubitkom stabljike. Budući da smo primijetili da metformin smanjuje adipogenu diferencijaciju, zanimalo nas je da istražimo učinak liječenja metforminom na proliferaciju ASC in vitro. ASC su tretirani metforminom, a ćelije su brojane 4. dana nakon kulture u prisustvu ili odsustvu metformina. Iz naših rezultata, uočili smo da metformin značajno smanjuje stopu proliferacije ćelija u poređenju sa kontrolnim ASC (Slika 2A). Matične ćelije igraju važnu ulogu u regeneraciji i održavanju tkiva.koliko cistanche uzetiDa bi efikasno obavljale svoju regenerativnu ulogu, matične ćelije moraju da zadrže svoje karakteristike matične ćelije. Analizirali smo učinak liječenja metforminom na ekspresiju gena stemnessa u ASC. U tu svrhu, koristili smo kvantitativni PCR u realnom vremenu za analizu gena koji se odnose na održavanje stabljike u ASC. Uočili smo da metformin značajno povećava ekspresiju markera masnih matičnih ćelija, kao što su BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 i DLK1, u poređenju sa kontrolnim ASC (Slika 2B). Naši rezultati pokazuju da tretman metforminom efikasno usporava proliferaciju ASC-a, čime se sprečava iscrpljivanje ćelija od proliferacije povećavajući ekspresiju gena za potpis matičnjaka.

Slika 1. Tretman metforminom inhibira adipogenu diferencijaciju ASC na način ovisan o dozi. (A) ASC su testirani na ekspresiju CD29, CD90, CD24, CD31 i CD45 protočnom citometrijom. Prikazani su i procenti pozitivnosti prikazani na histogramima i srednji intenzitet fluorescencije (MFI) prikazan u tabeli kontrolne (neobojene ASC) i obojene (ASC tretirane odgovarajućim antitelima). (B)ASC su podvrgnuti adipogenoj ili osteogenoj diferencijaciji koristeći koktele diferencijacije specifične za lozu. Diferencijacija na liniju adipocita je potvrđena Bodipy bojenjem, a osteogeneza je potvrđena bojanjem Alizarin Red. Procenat površine obojene Alizarin crvenom bojom izračunat je korišćenjem slike J. (C) ASC su tretirani koktelom za diferencijaciju adipocita u prisustvu ili odsustvu različitih doza metformina tokom 14 dana. Razvoj adipocita 14. dana nakon indukcije procijenjen je bojenjem lipidnih kapljica korištenjem Oil Red O boje. Izvučena je apsorbirana Oil Red O mrlja i izmjerena je optička gustina. Optička gustina iz kontrolnih ASC je uzeta kao 100 posto, a relativna promjena nakon tretmana metforminom je ucrtana (n =3). (D) Sadržaj lipida 14. dana određen je Bodipy bojom (zelena). Hoechst (plava) je korištena za bojenje jezgara.šta je cistanche(E) Western blot analiza ekspresije proteina perilipina. -Aktin je korišćen kao kontrola opterećenja. Kvantifikacija gustoće traka proteina perilipina normalizirane na -Actin korištene Slika J. Slike i grafikoni predstavljaju tri nezavisne replike (n=3). *str<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Kako bismo isključili da smanjenje diferencijacije i proliferacije nije posljedica citotoksičnih efekata metformina na ASC, analizirali smo održivost stanica tretiranih metforminom. Analize AnnexinV/PI bojenja protočnom citometrijom nisu pokazale značajno povećanje apoptotičkih ili nekrotičnih ćelija nakon tretmana sa povećanjem koncentracija metformina do 5 u poređenju sa kontrolom medijuma ćelijske kulture (Slika 3A). Mitohondrijska aktivnost i stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) su važni za diferencijaciju ćelija, a povećani nivoi metabolizma mitohondrija i generisanje ROS primećeni su tokom adipogene diferencijacije [32]. Iz naših rezultata, uočili smo da liječenje metforminom smanjuje adipogenu diferencijaciju ASC. Zatim smo istražili efekte na mitohondrijalnu aktivnost i proizvodnju ROS. ASC su tretirani metforminom i obojeni TMRM za procjenu aktivnosti mitohondrijalne membrane i DCF2DA za procjenu koncentracije ROS. Slike fluorescentnog mikroskopa i kvantifikacija fluorescentnog signala otkrili su da liječenje metforminom značajno smanjuje aktivnost mitohondrija (Slika 3B, C) i proizvodnju ROS (Slika 3D, E). Zaključujemo da metforminom posredovano smanjenje mitohondrijalne aktivnosti i produkcije ROS doprinosi povećanju stabljike ASC.

Da bismo razumjeli moguću signalnu kaskadu odgovornu za smanjenu diferencijaciju adipocita, proliferaciju i regulaciju gena matičnjaka u ASC nakon liječenja metforminom, fokusirali smo se na mTOR, autofagiju i signalne kaskade kinaze regulirane ekstracelularnim signalom (ERK). Prethodne studije su pokazale važnu ulogu ovih puteva u održavanju stabljike kod ASC[19,33]. I ERK i mTOR signalizacija igraju važnu ulogu u promoviranju ćelijske proliferacije i diferencijacije. Nakon što su ASC tretirani različitim dozama metformina, sakupljeni su ćelijski lizati i Western blot na LC3, fosforilisanu-p70S6 kinazu, ukupnu p70S6 kinazu, fosforilisana-ERK42/44 i ukupna ERKp42/44 antitijela. Beta-aktin je korišten kao gen za održavanje kućanstva. Western blot analiza je pokazala da je u poređenju sa kontrolnim ASC, tretman metforminom smanjio ekspresiju fosforilisane p70S6K i fosforilirane-ERK42/44 kinaze (Slika 4A, B, D). I ERK i mTOR signalizacija igraju važnu ulogu u regulaciji puta autofagije.bioflavonoidiWestern blot rezultati su otkrili da liječenje metforminom pojačava aktivnost autofagije u ASC (Slika 4A, C). Dalje smo analizirali ekspresiju gena puta autofagije nakon tretmana metforminom na nivou mRNA primjenom kvantitativne PCR u realnom vremenu. Sa qPCR analizom, uočili smo značajno povećanje gena autofagijskog puta VMP1, P62, ATG5 i ATG7 nakon liječenja metforminom (slika 4E), što je u skladu s povećanjem aktivnosti autofagije prikazanim u našim Western blot rezultatima. U našim analizama uočeno je i neznatno povećanje ekspresije ATG 9. Zaključujemo da liječenje metforminom smanjuje aktivnost ERK i mTOR i pojačava autofagiju u ASC kao mogući osnovni mehanizam za smanjenu proliferaciju i diferencijaciju i povećanu stabljiku.

Da bismo naglasili direktnu ulogu ERK i mTOR signalizacije u inhibiciji diferencijacije i povećanja stabljike kod ASC posredovane liječenjem metforminom, odvojeno smo inhibirali ERK signalizaciju i mTOR put koristeći ERK inhibitor U0126 i rapamicin, i analizirali efekte na ASC. diferencijacija i matičnost [19,33]. Dodavanje ERK inhibitora U0126 tokom diferencijacije adipocita ASC-a rezultiralo je značajno smanjenom diferencijacijom, kao što je otkriveno Bodipy slikama i kvantifikacijom fluorescencije (Slika 5A, B). Kvantitativni rezultati PCR-a u realnom vremenu pokazuju pojačanu regulaciju gena matičnosti nakon specifične inhibicije posredovane inhibitorom ERK signalizacije (Slika 5C) dodatno je podržao naš nalaz da smanjenje regulacije ERK puta liječenjem metforminom doprinosi povećanju stabljike.

Zatim smo koristili rapamicin, dobro poznati inhibitor mTOR puta koji može aktivirati autofagiju, i procijenili efekte na adipogenezu i ekspresiju gena stemness [19]. Ćelijski lizati ASC tretiranih rapamicinom su sakupljeni i ispitani fosforiliranom-p70S6 kinazom, totalnom p70S6 kinazom i -aktinskim antitijelima. Uočili smo da rapamicin smanjuje ekspresiju fosforilirane-p70S6 kinaze (slika 6A). Da bi se odredila funkcionalna uloga u adipogenoj diferencijaciji, ASC su tretirani rapamicinom i inducirani adipogenom podlogom. Nakon 14 dana, ćelije su obojene Bodipy bojom za procjenu adipogeneze. Uočili smo da liječenje rapamicinom značajno smanjuje adipogenu diferencijaciju (Slika 6B, C). Zatim smo analizirali efekat blokiranja transdukcije mTOR signala na stabljiku ASC-a. U tu svrhu, ASC su tretirani rapamicinom, a PCR u realnom vremenu je korišten za mjerenje ekspresije transkripata povezanih sa stemnessom. Uočili smo da rapamicin značajno pojačava ekspresiju markera povezanih sa stablom (Slika 6D). Zaključujemo da inhibicija ERK i mTOR puteva doprinosi smanjenju diferencijacije adipocita i povećanju stabljike kod humanih ASC.

Zatim smo testirali možemo li reproducirati efekte liječenja metforminom koji poboljšavaju stabljiku na 2D kultivisanim ASC u složenijem i in vivo modelu kulture cijelog masnog tkiva koji se može prevesti. Za ovo smo izmijenili protokol kulture masnog tkiva koji su objavili Harms et al.30], koristeći ćelijske cjedila umjesto transwell inserata kako bi fragmente masnog tkiva zadržali uronjeni u mediju (Slika 7A). Nakon kultiviranja 3-5 mm fragmenata ljudskog masnog tkiva sa ili bez metformina tokom 5 dana, izolovali smo stromalne vaskularne frakcije (SVF) kolagenazom digestijom fragmenata masnog tkiva i analizirali ekspresiju gena povezanih sa stabljikom. PCR podaci u realnom vremenu pokazali su da je SVF iz masnog tkiva tretiranog metforminom pokazao značajno povećanje u ekspresiji markera stabljike kao što su BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR i Wnt2 (slika 7B ).

4. Diskusija

Masne matične ćelije (ASC) regenerišu masno tkivo kroz samoobnavljanje i diferencijaciju, održavajući na taj način fond matičnih ćelija tkiva. Međutim, starenje i gojaznost su povezani sa gubitkom svojstava stabljike kod ASC. Metformin je antidijabetički lijek i pokazao je obećavajuće rezultate kao sredstvo protiv starenja. Fokusirali smo se na analizu efekta metformina na stemness ASCs i razumijevanje osnovnog mehanizma, s ciljem da se metformin ustanovi kao potencijalni agens za održavanje stemnessa u ASC s godinama. Za lakše prevođenje naših rezultata na ljude, koristili smo 2D model ćelijske kulture ljudskih ASC i koristili metodu kulture ljudskog masnog tkiva da simuliramo složenije okruženje tkiva. Koristili smo potkožno masno tkivo kao izvor tkiva za naše studije. Koristeći ove različite metode ćelija i kulture tkiva, proučavali smo učinak liječenja metforminom na stabljiku ASC.

Gojaznost uzrokuje promjenu kinetike diferencijacije ASC, što smanjuje zbir matičnih stanica. Naši rezultati sugeriraju da, u poređenju s neliječenim ASC, liječenje metforminom smanjuje stopu adipogeneze na način ovisan o dozi. Ovo zapažanje je u skladu s ranijim izvještajima koji su pokazali da metformin inhibira adipogenezu u adipoznim matičnim stanicama, stromalnim stanicama koštane srži, matičnim stanicama parodontalnog ligamenta i 3T3 ćelijskim linijama [34-37]. Brzina proliferacije matičnih ćelija igra važnu ulogu u održavanju fonda matičnih ćelija, matičnosti i sposobnosti samoobnavljanja. Uočili smo da metformin inhibira proliferaciju ASC bez izazivanja bilo kakvog citotoksičnog efekta na ASC, što se slaže s drugim studijama objavljenim na matičnim stanicama miševa dobivenim iz masnoće [28], stromalnim stanicama i fibroblastima [38,39].buy cistancheNedavna studija koja je koristila matične ćelije dobijene od adipoze sa konja pokazala je proliferativni efekat metformina [27]. Najvjerovatnije objašnjenje za ova kontradiktorna zapažanja je razlika u vrsti donora i anatomskom mjestu sakupljanja ćelija, jer su ASC konja sakupljeni iz repa. Agnieszka Smieszek i dr. primijetili su da metformin inhibira ćelijsku proliferaciju i promoviše ćelijsku smrt s povećanjem doza (5 i 10 mM) u stromalnim stanicama iz koštane srži miša i ćelijskoj liniji Balb/3T3 embrionalnih fibroblasta [40]. Osim toga, metformin inhibira proliferaciju satelitskih stanica izoliranih iz mišića miša |41. Podržavajući naše zapažanje, Min-lung Park et al. izvijestili su da metformin poboljšava protuupalno svojstvo humanih ASC smanjujući nivoe ekspresije IL-1, IL-6 i TGF-; metformin također povećava preživljavanje transplantiranih ASC i štiti od apoptotske ćelijske smrti [42]. Ovi rezultati ukazuju na različite efekte tretmana metforminom na održivost ćelija izvedenih iz različitih vrsta i da su humani ASC otporni na potencijalne citotoksične efekte lečenja metforminom.

Diferencijacija ASC u adipocite povezana je sa većim energetskim potrebama i metaboličkim stopama, što rezultira većom mitohondrijalnom aktivnošću i proizvodnjom ROS. ROS igra kritičnu ulogu u održavanju mirovanja i matične ćelije u odraslim matičnim ćelijama, budući da viši nivoi ROS-a potiču ćelije ka diferencijaciji i konačno starenju matičnih ćelija i smrti ćelije [43]. Uočili smo da metformin značajno smanjuje potencijal mitohondrijalne membrane i stvaranje reaktivnih vrsta kisika. U skladu s našim podacima, ranije studije su također objavile da metformin smanjuje oksidativni stres i poboljšava ekspresiju antioksidansa u mišjim embrionalnim fibroblastima [44], mišjim ASC [38] i endotelnim stanicama ljudske aorte [45]. Štaviše, u skladu s našom studijom, Chien-Hung Lin i saradnici, izvijestili su da metformin djeluje kao neuroprotektivno sredstvo smanjenjem oksidativnog stresa u ljudskim neuralnim matičnim stanicama [46]. Nekoliko drugih studija potvrđuje da metformin djeluje kao antioksidans smanjujući oksidativni stres i povećavajući ekspresiju enzima antioksidansa, kao što je superoksid dismutaza u mišjim ASC, mišjim C2C12 mioblastima i cirkulirajućim ljudskim endotelnim progenitorskim stanicama [38,47,48]. Štaviše, studija Alejandra Martin-Montalvoa et al. podržava naše zapažanje, pokazujući da metformin značajno inhibira mitohondrijski kompleks, inhibirajući mitohondrijalno disanje kod miševa [49] Učinci metformina na smanjeno stvaranje reaktivnih vrsta kisika su vjerovatno posredovani povećanjem reduciranog glutationa [50] u mehanizmu koji uključuje redoks- osjetljivi transkripcijski faktor Nrf2 [51].

Pokazalo se da metformin promoviše stanje mirovanja satelitskih ćelija snižavanjem metabolizma potrebnog za proliferaciju i diferencijaciju. Razne studije također potvrđuju da metformin snažno promiče stabljiku i podmlađivanje matičnih stanica [23,39,41,49,52,53]. Takođe je poznato da značajno poboljšava i reguliše nivoe ekspresije markera matičnih ćelija. Budući da smo primijetili da metformin inhibira proliferaciju i adipogenezu inhibicijom oksidativnog stresa i mitohondrijalne aktivnosti, pokušali smo potvrditi da li metformin poboljšava stabljiku kod ASC-a ili u in vitro modelu kulture masnog tkiva. U skladu s tim, primijetili smo da je metformin značajno poboljšao ekspresiju markera vezanu za stabljiku DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 i Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 i Mycl u 2D ASC kulturi i modelima kulture masnog tkiva. . Upotreba kulture cijelog masnog tkiva nudi jedinstvenu priliku za simulaciju in vivo mikrookruženja ljudskog tkiva, gdje su ćelije orijentirane kao u svojoj prirodnoj arhitekturi i imaju interaktivnu podršku od različitih tipova ćelija utkanih u tkivni matriks. Koliko nam je poznato, naša studija po prvi put pokazuje učinak liječenja metforminom na povećanje stabljike na ljudske ASC, kako u 2D tako iu kulturi cijelog masnog tkiva. Smatramo da naši rezultati pokazuju pojačanu regulaciju potpisa gena matičnjaka u ASC izolovanim iz fragmenata masnog tkiva tretiranih metforminom kao zagovaranje daljeg istraživanja upotrebe metformina kao terapije za usporavanje procesa starenja i pomlađivanje ostarjelog masnog tkiva.

Mehanistički cilj rapamicina (mTOR) igra ključnu ulogu u proliferaciji i diferencijaciji matičnih ćelija. Smanjenje modulacije mTOR aktivnosti genetskom manipulacijom, terapijskom intervencijom ili promjenama u vezi sa životnim stilom povećava stablo i dugovječnost [19,20]. Pošto smo uočili da metformin inhibira adipogenezu, testirali smo efekat metformina na mTOR signalizaciju. Zanimljivo, rezultati su pokazali da metformin značajno smanjuje nivoe fosforilacije PS70S6 kinaze, koja je ključni signalni molekul nizvodno od mTOR i reporter aktivnosti mTOR puta. Ranije studije također sugeriraju da metformin potiskuje adipogenezu inhibirajući mTOR signalni put u mišjim embrionalnim fibroblastima (MEF), C3H10T1/2 mišjim mezenhimalnim matičnim ćelijama i 3T3-L1 preadipocitima [34]. Mehanistički cilj rapamicina sastoji se od dva kompleksa, mTORCl i mTORC2, a signalizacija igra važnu ulogu u adipogenezi. Pokazalo se da inhibicija mTORC1 signalizacije sa rapamicinom narušava adipogenezu putem smanjenja fosforilacije PS6kinaze u 3T3-L1 preadipocitima. Ove studije su također pokazale da inhibicija mTOR signalizacije inhibira adipogenezu smanjujući nivoe ekspresije markera adipocitne loze kao što su PPARgamma, CEBPI, CEBP1 i adiponektin [54-56]. Štaviše, mTOR signalizacija je posredovana fosforilacijom S6 kinaze. Pokazalo se da je nokdaun S6 kinaze otporan na gojaznost i debljanje u uslovima ishrane sa visokim sadržajem masti zbog oštećenja adipogeneze [57]. Potvrdili smo naše zapažanje smanjenja aktivnosti mTOR posredovane metforminom kao mogućeg posrednika povećanja stabljike i smanjene diferencijacije ASC upotrebom rapamicina, koji specifično blokira aktivnost m TOR puta.

Uz mTOR, ERK signalni put igra ključnu ulogu u proliferaciji i adipogenezi. Xiaomin Ning et al., u svojoj publikaciji, tvrde da se adipogeneza aktivira ERK signalizacijom [58]. Budući da smo primijetili da metformin inhibira adipogenezu i proliferaciju, odlučili smo istražiti učinak metformina na ERK signalizaciju. U skladu s ranijim izvještajima, naši rezultati također sugeriraju da bi metformin mogao inhibirati adipogenezu supresijom ERK signalizacije uz povećanje ekspresije gena vezanih za stabljiku. mTOR signalizacija je potrebna za proliferaciju i diferencijaciju stanica i negativan je regulator autofagije [{{2 }}]. Međutim, gubitak autofagije je povezan s gubitkom matičnosti, iako je liječenje metforminom poboljšalo ekspresiju gena vezanu za stabljiku putem aktivacije ekspresije markera povezane s autofagijom, kao što je LC3Il. Stoga, naši rezultati sugeriraju da metformin narušava adipogenezu poboljšavajući stabljiku u ljudskim modelima ASC ili kulture ljudskog masnog tkiva putem aktiviranja autofagije i inhibiranja mTOR signalnih puteva. Buduće in vivo istraživačke studije na životinjama i ljudima usmjerene na procjenu efekata metformina na biologiju ASC će voditi prilagođavanje upotrebe metformina kao sredstva protiv starenja matičnih ćelija.

Ovaj članak je preuzet iz Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines