Meta-analize identifikuju metilaciju DNK povezana sa funkcijom i oštećenjem bubrega

edmund.chen@wecistanche.com

Hroničnibolest bubregapredstavlja veliki teret za javno zdravlje. Povišen omjer albumina i kreatinina u urinu je mjeraoštećenje bubrega,i koristi se za dijagnozu i stadijum kroničnogbolest bubrega. Proširiti znanje o regulatornim mehanizmima koji se odnose nafunkciju bubregai bolesti, proveli smo studiju povezanosti epigenoma u cijelom epigenomu za procijenjenu brzinu glomerularne filtracije (n=33,605) i omjer albumina i kreatinina u urinu (n=15},068) i otkrili 69 i sedam CpG mjesta gdje je metilacija DNK bila povezana sa odgovarajućim svojstvom. Većina ovih nalaza pokazala je usmjerenu konzistentnu povezanost s odgovarajućim kliničkim ishodima kronične bolestibolest bubregai umjereno povećana albuminurija. Asocijacije metilacije DNK safunkciju bubrega, kao što su CpG na JAZF1, PELI1 i CHD2 potvrđeni su ububrežnog tkiva. Metilacija na PHRF1, LDB2, CSRNP1 i IRF5 ukazuje na uzročne efekte nafunkciju bubrega. Analize obogaćivanja otkrile su puteve povezane s hemostazom i migracijom krvnih stanica za procijenjenu brzinu glomerularne filtracije, i aktivaciju imunih stanica i odgovor na CpG-ove povezane s omjerom albumina i kreatinina u urinu.

Ključne riječi:bolest bubrega; oštećenje bubrega; funkcija bubrega; bubrežno tkivo; struktura bubrega

hroničnobolest bubrega(CKD) predstavlja veliki teret za javno zdravlje. Pogađa više od 10 posto odraslih širom svijeta i više od 40 posto osoba starijih od 70 godina1,2. HBB je vodeći uzrok smrti u svijetu3 i glavni je doprinos kardiovaskularnom morbiditetu i mortalitetu2,4,5. CKD se definiše kao trajno prisustvo abnormalnostibubregstrukturu ili funkciju. Thefunkciju bubregamjere koje se najčešće koriste su brzina glomerularne filtracije, koja se obično procjenjuje na osnovu koncentracije kreatinina u serumu (eGFR), i omjer albumina i kreatinina u urinu (UACR)6. Povišeni UACR je mjera zaoštećenje bubrega, koji se koristi za dijagnozu i stadijum CKD7, a povezan je sa dijabetičarima i hipertoničarimabolest bubrega8. Čak i umjereno povišen UACR je faktor rizika za kardiovaskularne bolesti, neovisno o drugimfunkciju bubrega markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 genetskih lokusa koji su povezani safunkciju bubrega10,12,13. Varijante indeksa na poznatim lokusima povezanim s eGFR objašnjavaju procijenjenih 8,9 posto varijanse eGFR12.Nedavna GWAS meta-analiza eGFR integrisala je otvorene regije hromatina sa malim skupovima polimorfizama jednog nukleotida (SNP)10. Rezultati ove studije potvrđuju važnost izmijenjene regulacije transkripcije kao mehanizma koji doprinosi CKD. Istražiti metilaciju DNK, s obzirom nafunkciju bubrega, sprovedene su studije povezanosti epigenoma (EWAS) eGFR i CKD. Kao ključni regulator transkripcije koji se može procijeniti na isplativ i visokopropusni način, metilacija DNK je proučavana na CpG mjestima (CpG) sa rezolucijom na jednoj bazi. Prethodno smo sproveli EWAS uključujući 4859 odraslih osoba iz dvije populacijske studije i identificirali 18 validiranih, različito metiliranih mjesta u punoj krvi povezanih s eGFR14. Iako je ova studija otkrila uvid u mehanizme regulacije genabubregfunkcija, povezani CpG-ovi objašnjavaju samo 1,2 posto varijanse eGFR. Druge prethodne studije bile su fokusirane na pacijente sa CKD i/ili pacijente sa dijabetesom ili pacijente sa infekcijom virusom humane imunodeficijencije, ili su bile ograničene malom veličinom uzorka, nedostatkom replikacije, nedostatkom prilagođavanja za potencijalne zbunjujuće ili njihovom kombinacijom14-19. Druge studije su se fokusirale na obrasce metilacije DNK dijabetičarabolest bubrega(DKD) pacijenti20–22.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA

Ovdje smo sproveli EWAS odfunkciju bubregaosobine za identifikaciju dodatnih CpG-ova povezanih sa regulatornim mehanizmima gena od potencijalnog značaja za CKD. Proširili smo prethodni EWAS za eGFR i CKD tako što smo značajno povećali veličinu uzorka na 33.605 osoba. Osim toga, uključili smo UACR i umjereno povećanu albuminuriju (mikroalbuminuriju) kao dodatne osobine. EWAS je proveden u pretežno populacijskim studijama koje su prilagođavale spol, dob, dijabetes, hipertenziju, indeks tjelesne mase (BMI), pušački status i najzastupljenije proporcije bijelih krvnih zrnaca. Replicirali smo naše EWAS rezultate u odvojenim uzorcima, povezali CpG mjesta sa nivoima ekspresije gena u različitim tkivima, primijenili nalaze na kliničke ishode i procijenili uzročnost između metilacije DNK ifunkciju bubrega(Dopunska slika 1).

Rezultati

Proučite karakteristike uzorka. U ovom istraživanju, 36 studija sa ukupno 33.605 učesnika doprinijelo je EWAS-u eGFR-a i 15.068 EWAS-u UACR-a. Njihove objedinjene karakteristike prikazane su u Tabeli 1, a opisi pojedinačnih studija dati su u Dodatnim podacima 1 i 2.

EWAS eGFR i UACR.Istražili smo povezanostbubregosobine sa metilacijom DNK u krvi do 441.870 CpG, preklapanjem CpG-ova pokrivenih Illumina MethylationnEPIC BeadChip i Illumina HumanMethylation450 BeadChip nizom, koji su korišteni za mjerenje u svim studijama osim u jednoj (Dopunski podaci 3). Sve studije su izvršile čišćenje nizova podataka i primijenile centralno razvijene skripte za pripremububregvrijednosti osobina, koje su naknadno povezane sa metilacijom DNK korištenjem modela linearne regresije prilagođenih kovarijacijama sa vrijednostima metilacije kao zavisnom varijablom slijedeći unaprijed specificirane protokole istraživanja (vidi Metode). Uočili smo nikakvu ili malu inflaciju u EWAS specifičnoj za studiju (srednja inflacija eGFR=1.00, srednja inflacija UACR=1.00, dodatni podaci 1 i 2). U multivarijabilnom prilagođenom transetničkom EWAS-u, 69 CpG je značajno povezano sa eGFR i replicirano (Slika 1A, Dodatni podaci 4, vidi Metode), uključujući one koje su prethodno prijavljene14. Replicirana mjesta su pokazala jasan obrazac niže metilacije (60 CpG, Pbinom=2.2E-10; slika 1A).

Slika 1 EWAS rezultati eGFR i UACR. Chicago dijagrami epigenomske asocijacijske studije (EWAS) rezultati za procijenjenu brzinu glomerularne filtracije (eGFR) (A) i omjer albumina i kreatinina u urinu (UACR) (B) koristeći kombinovani uzorak otkrića i replikacije. Lokacije su poređane prema njihovom hromozomskom položaju na x-osi, sa njihovom –log10 P-vrijednošću asocijacijskog Wald-testa na y-osi. CpG pozitivno korelirani sa osobinom su ucrtani u gornjem dijelu, a mjesta sa negativnom korelacijom u donjem dijelu. Isprekidane horizontalne linije predstavljaju nivo značajnosti (P-vrijednost < 1,1e−7).="" nove="" replike="" lokacije="" su="" obojene="" u="" narandžasto,="" poznate="" replicirane="" lokacije="" su="" obojene="" u="" tirkizno,="" a="" mjesta="" koja="" su="" dodatno="" povezana="" s="" odgovarajućim="" binarnim="" svojstvom="">bolest bubrega[CKD]/ mikroalbuminurija [MA]) označeni su križićem.

U meta-analizi uočene su najniže P-vrijednosti za poznate eGFR asocijacije uključujući cg17944885 (ZNF788,=-1.75E−04, P-vrijednost=8}.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, P-vrijednost=3.2E−24), i cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-vrijednost=8 .7E−20)14, nakon čega slijedi novi nalaz na cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, P vrijednost=1.1E−17). Samo 69 repliciranih CpG-ova povezanih s eGFR objasnilo je 15,7 posto varijacije eGFR u posebnom uzorku studije od 1888 učesnika (pogledajte Metode). Kada se dodaju sve kovarijacije (spol, dob, dijabetes, hipertenzija, BMI, pušenje i proporcije bijelih krvnih zrnaca) u model asocijacije, ukupan udio objašnjene varijanse u eGFR porastao je na 36,3 posto, s 2,4 posto varijacijama koje se pripisuju 69 CpGs nezavisno od ostalih kovarijata.

U transetničkoj analizi UACR-a, sedam CpG-a je značajno povezano i replicirano (Slika 1B, Dodatni podaci 5, vidi Metode). Od nalaza, cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-vrijednost=2.6E−13) i cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, P-vrijednost=9.9E−13) je imala najmanju P-vrijednost asocijacije meta-analize. Kod šest od sedam CpG, niža metilacija je bila povezana sa višim UACR. Zbog broja repliciranih lokacija, snaga binomnog testa je bila ograničena (6 CpG, pbinom=0.13; slika 1B). Replicirani CpG-ovi su objasnili 3,9 posto, a potpuni model 14,6 posto varijacije u nivoima UACR-a, sa 0,07 posto pripisanih CpG-ovima nezavisno od ostalih kovarijata.

Bilo je malo preklapanja između repliciranog EWAS i prethodno prijavljenih GWAS lokusa za oba eGFR (preklapanje=10 od 69; Dodatni podaci 4) i UACR (preklapanje=1 od 7; Dodatni podaci 5). Nije bilo preklapanja repliciranih CpG-ova između eGFR i UACR, što ukazuje na osobine specifične profile metilacije DNK u krvi. Čak i među 967 i 270 sugestivnih asocijacija (P-vrijednost < 1e-05)="" kombinovane="" meta-analize="" uzoraka="" otkrića="" i="" replikacije="" za="" egfr="" i="" uacr,="" respektivno,="" samo="" 10="" mjesta="" se="" preklapalo="" između="" oba="" svojstva.="" detaljni="" rezultati="" ovih="" meta-analiza="" za="" sve="" sugestivne="" asocijacije="" dati="" su="" u="" dodatnim="" podacima="" 6="" (egfr)="" i="" 7="">Heterogenost predaka i robusnost nalaza. Da bismo procijenili da li rezultati asocijacije na eGFR i UACR mogu biti vođeni specifičnim porijeklom, izvršili smo EWAS meta-analizu uzoraka europskog porijekla (EA) i afroameričkog porijekla (AA) s rezultatima višestrukih studija koje su doprinijele ova dva etničke pripadnosti. Poređenje rezultata asocijacije repliciranih CpG u uzorcima EA (Negar=23,671; nUACR=9806) sa AA uzorcima (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) u ili unutar 50 bp od 69 repliciranih CpG-ova procijenjeno je da bi se procijenilo da li prisustvo SNP-a može uticati na vezivanje sonde. Četiri sonde su locirane u blizini zajedničkog SNP-a (Dopunski podaci 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg{11}}rs112223111), koji, međutim, nisu bili povezani ni sa jednom GWAS svojstvom prema PhenoScanner V2 resursu (pristupljeno 02/12/2021, pGWAS < 5e−8,="" uključujući="" proxy="" snp-ove="" sa="" eur="" r²=""> 0,8)23. Ovo ukazuje da je malo vjerovatno da će rezultati EWAS-a biti pomešani sa zajedničkom osobinom za koju se zna da se odnosi nafunkciju bubregavarijacijom obližnje DNK sekvence. Utvrđeno je da interni SNP-ovi sonde koji su bili više od pet baza od 3′-kraja sonde imaju zanemarljive posljedice24.

Veza sa CKD i mikroalbuminurijom.Od 69 CpG povezanih s eGFR, 53 su također bila povezana s preovlađujućom CKD u meta-analizi od 25,609 osoba uključujući 2376 slučajeva sa dosljednim smjerom efekta (P-vrijednost < 0.="" 05/69;="" dodatni="" podaci="" 4,="" dodatna="" slika="" 3a).="" korelacija="" između="" efekata="" egfr="" i="" ckd="" bila="" je="" visoka="" (r="-0,93;" slika="" 3a).="" u="" nezavisnoj="" kohorti="" od="" 551="" bolesnika="" s="" ckd,="" 65="" cpg-ova="" je="" bilo="" usmjereno="" konzistentno="" sa="" egfr="" meta-analizom="" i="" pet="" je="" replicirano="" (p-vrijednost="">< 0,05/69,="" r="0.77;" dodatna="" slika="" 4,="" dodatni="" podaci="" 4,="" vidi="" metode).="" u="" istoj="" kohorti,="" egfr="" povezani="" cpg-ovi="" cg18194850="" (p-vrijednost="1.6E−5)" i="" cg07242931="" (p-vrijednost="2}.3E−5)" su="" takođe="" povezani="" sa="" vremenom="">otkazivanja bubregaili akutnapovreda bubrega(Dopunski podaci 8, vidi Metode). Svih sedam CpG povezanih sa UACR je također značajno povezano s mikroalbuminurijom na uzorku od 7279 osoba uključujući 1186 slučajeva sa istim smjerom djelovanja kao i za UACR (P-vrijednost < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98;="" slika="" 3b,="" dodatni="" podaci="" 5,="" dodatna="" slika="">

Korelacija sa ekspresijom gena. Da bismo stekli uvid u moguće funkcionalne mehanizme CpG-ova povezanih s eGFR i UACR, testirali smo korelaciju njihovih nivoa metilacije DNK sa nivoima mRNA gena kodiranih u cis u punoj krvi, kao iu krvnim monocitima (vidi Metode, Dodatni podaci 9 ). Poznati cg17944885 povezan sa eGFR na hromozomu 19 u blizini ZNF788 bio je povezan sa transkriptom kodiranim 240 kb udaljenim proteinom cinkovog prsta 439 (ZNF439, tabela 2). Osim toga, metilacija cg04864179 na regulatornom faktoru interferona 5 (IRF5) bila je povezana s oba transkripta mRNA kodirane IRF5 i obližnjim transportinom 3 (TNPO3) (dodatna slika 5A). Od UACR asocijacija, dva replicirana CpG cg02711608 i cg22304262 u porodici nosača otopljenih tvari 1 član 5 (SLC1A5) otkrila su značajne povezanosti s nivoima mRNA SLC1A5 i cg23570810 na interferonom induciranog proteina1 sa transmembranskim1 IFNM transkriptom (Interferon-induced protein transmembrane1T transcript) 2). Svi rezultati analize genske ekspresije dati su u Dodatnim podacima 9.

Efekti na bubrežno tkivo.Procijeniti da li se uočeni efekti metilacije u krvi prevode nabubrežno tkivo,primijenili smo regresijski model da testiramo povezanost repliciranih CpG-ova na značajnu (stopa lažnog otkrivanja (FDR) < 0.05) i konzistentnu povezanost sa eGFR ibubregfibroza, respektivno, u 506 mikrodisekovanabubrežnog tkivauzorci. U ovim uzorcima,bubreg- metilacija DNK zasnovana na tkivu repliciranih eGFR povezanih CpG-ova cg23597162 na JAZF1, cg26099045 blizu PELI1 i cg12644285 kod CHD2 su značajno povezane sa eGFR sa istim smjerom efekta kao u krvi (dodatni podaci, tabela 2, Dodatni podaci, 10. . Nadalje, isti CpG na PELI1 i šest dodatnih

lokacije (cg20146909 na LRRC8D, cg25767870 blizu FAM46C, cg16618493 na ZBTB7B, cg10632966 u blizini RPEL1, cg01068906 na NOD2 i cg03297PD331) bile su povezane sabubreguzorci tkiva sa konzistentnim (tj. inverznim) pravcima efekta (dopunska slika 6B, tabela 2). Od repliciranih UACR mjesta, nivoi metilacije DNK ububregtkivo cg00008629 kod PTBP3 i cg24859433 blizu IER3 bilo je povezano s fibrozom i pokazalo je isti smjer djelovanja (dopunska slika 6D, tabela 2). U skladu sa nalazima EWAS-a, nije pronađena značajna povezanost CpG povezanih sa UACR sa eGFR u donorima uzorka bubrega (dodatna slika 6C, dodatni podaci 10).

Uzročne posljedice između metilacije DNK ifunkciju bubregaosobine. Da bi se procenilo da li jefunkciju bubregaosobine uzročno utiču na metilaciju DNK ili obrnuto, sproveli smo dvosmjernu analizu Mendelove randomizacije (MR) u dva uzorka značajno povezanih CpG-ova. MR analiza u smjeru naprijed sugerira da CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) i cg04864179 (IRF5) uzročno utiču na nivoe eGFR (Tabela 3). Procjene heritabilnosti ova četiri CpG-a varirale su između tri skupa podataka iz populacija evropskog porijekla, ali su bile konzistentno veće od srednje heritabilnosti za sve CpG procijenjene u svakoj od tri studije: 0,34 (uzročni eGFR CpG) naspram 0,16 (niz HM450K) na osnovu Hannon et al.25, 0,55 naspram 0,19 za Dongen et al.26, i 0,51 naspram 0,19 za McRae et al.27. Nisu identifikovane značajne uzročne veze za bilo koje CpG povezane sa UACR-om. Za reverzni MR, jedini značajan efekat bio je efekat eGFR na cg23597162 (JAZF1) kada se koristi metoda primarne inverzne varijanse. Međutim, nikakvi značajni efekti nisu identifikovani/uočeni u višestrukim reverznim MR analizama osetljivosti. Izostavljene analize nisu pokazale nikakve indikacije da bi rezultati MR mogli biti vođeni jednim SNP-om. Nadalje, isključujući SNP-ove koji su povezani sa dijabetesom mellitusom tipa 2 koji je glavni faktor rizika zabolest bubreganije rezultiralo drugačijim nalazima. Rezultati za sve primarne i MR analize osjetljivosti prikazani su u Dodatnim podacima 11 i 12 i Dodatnoj slici 7. Analize osjetljivosti podržavaju primarne nalaze značajnih prednjih MR rezultata (FDR < 0.05,="" vidi="" metode)="" sa="" procjene="" konzistentnog="" efekta="" u="" smjeru,="" ukazujući="" na="" potencijalno="" uzročne="" veze="" od="" metilacije="" dnk="" do="" egfr,="" ali="" ne="" i="">

Vezivanje faktora transkripcije, histonske marke i analize obogaćivanja puteva. Izvršili smo analizu mesta vezivanja faktora transkripcije, marke histona i obogaćivanja puta na osnovu 967 CpG-ova koji su pokazali sugestivnu povezanost sa eGFR (Pvalue < 1e-05;="" dodatni="" podaci="" 6)="" i="" 270="" cpg-ova="" koji="" su="" pokazali="" sugestivnu="" povezanost="" sa="" uacr-om="" (p-vrednost="">< 1e−5;="" dodatni="" podaci="" 7)="" u="" meta-analizi="" kako="" bi="" se="" maksimizirala="" statistička="" moć="" analiza="" obogaćivanja="" (vidi="" metode)="" 14="" prvo="" smo="" procijenili="" da="" li="" se="" cpg-ovi="" povezani="" s="" egfr="" preferencijalno="" mapiraju="" na="" mjesta="" vezivanja="" 169="" faktora="" transkripcije="" (tf)="" na="" osnovu="" kromatina="" imunoprecipitation="" dnk-sekvencioniranje="" (chip-seq)="" podaci="" iz="" encode="" projekta="" koji="" su="" agregirani="" konsenzusnim="" pozivima="" za="" 91="" tip="" ljudske="" ćelije="" (161="" tf="" staza)="" i="" dopunjeni="" sa="">bubregtragovi na bazi tkiva (vidi Metode). Nakon višestruke korekcije testiranja za 169 TF-ova, osam TF-ova pokazalo je značajno obogaćivanje za CpG-ove povezane s eGFR-om (FDR < 0.05;="" slika="" 4a,="" dodatni="" podaci="" 13),="" uključujući="" cebpb="" (p-vrijednost="1." 75e−06,="" unakrsna="" traka)="" i="" ep300="" (p-vrijednost="7.49E−09," trag="" unakrsnog="" tkiva).="" ovo="" je="" u="" skladu="" sa="" nalazom="" chua="" et="" al.14="" u="" manjoj="" podskupini="" od="" 4859="" učesnika="" od="" 33,605="" učesnika="" analiziranih="" ovde.="" cpg-ovi="" povezani="" sa="" uacr-om="" obogaćeni="" su="" veznim="" mjestima="" 56="" tf-ova="" (slika="" 4b,="" dodatni="" podaci="" 14)="" s="" najjačom="" asocijacijom="" za="" polr2a="" (p-vrijednost="6.93E−19)," fos="" (p-vrijednost="" {{32="" }}.28e−12)="" i="" ep300="" (p-vrijednost="">

BubregCpG-ovi povezani sa funkcijom su široko obogaćeni za nekoliko histonskih oznaka, sa 82 od 195 kombinacija tipova ćelija histona značajnih (FDR q < 0.05)="" za="" egfr="" (slika="" 4c,="" dodatni="" podaci="" 15)="" i="" 79="" od="" 195="" za="" uacr="" (slika="" 4d,="" dodatni="" podaci="" 16).="" histonska="" modifikacija="" h3k4me1,="" oznaka="" koncentrisana="" na="" aktivne="" i="" pripremljene="" pojačivače,="" obogaćena="" je="" za="" sve="" tipove="" ćelija="" za="" cpg-ove="" povezane="" sa="" uacr-om,="" i="" skoro="" sve="" tipove="" ćelija="" za="" cpg-ove="" povezane="" sa="" egfr.="" dok="" su="" cpg-ovi="" povezani="" sa="" uacr-om="" pokazali="" obogaćivanje="" za="" promotorsku="" oznaku="" h3k4me3="" u="" 34="" tipa="" ćelija,="" samo="" četiri="">

tipovi su pokazali obogaćivanje za eGFR-povezane lokacije. Suprotno tome, gen H3K36me3 povezan sa tijelom pokazao je mnogo šire obogaćivanje za CpG povezane s eGFR (30 tipova ćelija) od CpG povezanih sa UACR (pet tipova ćelija). Za razliku od H3K3me1/3 i H3K36me3, koji su svi povezani s aktivnim genima (pojačivači, aktivni promotori, aktivna transkripcija), H3K9me3 i H3K27me3, koji su općenito povezani s konstitutivnim i fakultativnim heterohromatinom28–31, nisu značajno obogaćeni za UACR. povezani CpG-ovi u bilo kojoj testiranoj vrsti ćelije (Slika 4D, Dodatni podaci 16). Obogaćivanje gena impliciranofunkcija bubrega-povezani CpG-ovi procijenjeni su u Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) i Reactome bazama podataka (vidi Metode)32–35. Zapaženo je značajno obogaćivanje za 27 termina (25 GO, jedan KEGG, jedan Reactome; Dodatni podaci 17, Slika 5A) za eGFR i 91 termin (87 GO, četiri Reactoma; Dodatni podaci 18, Slika 5B) za UACR (Sl. 5B). Putevi povezani sa migracijom specifičnim za tip bijelih krvnih stanica, translacijom mRNA, hemostazom i koagulacijom, kao i inzulinskim odgovorom, pokazali su značajno obogaćivanje CpG povezanih s eGFR (FDR < 0.05;="" slika="" 5a).="" putevima="" sa="" najnižim="" p-vrednostima="" obogaćivanja="" za="" mesta="" povezana="" sa="" uacr-om="" dominirala="" je="" aktivacija="" i="" odgovor="" imunih="" ćelija,="" i="" putevi="" povezani="" sa="" interferonom="" (slika="" 5b).="" dodatni="" putevi="" koji="" su="" obogaćeni="" uključivali="" su="" migraciju="" bijelih="" krvnih="" zrnaca,="" što="" se="" tiče="" rezultata="" egfr="" (dodatni="" podaci="">

Odnos prema poznatim EWAS asocijacijama s drugim osobinama. S obzirom na uočeno obogaćivanje puteva povezanih s imunološkim odgovorom, rezultate metilacije DNK uključujući CpG u blizini gena interferonskog puta i činjenicu da je status metilacije DNK pretežno procijenjen u leukocitima, procijenili smo da li naši nalazi mogu biti vođeni zbunjujućim efektima imunološki odgovor ili status upale. Stoga smo izvršili pretragu repliciranih CpG-ova u velikom EWAS-u na visoko osjetljivom serumskom C-reaktivnom proteinu (CRP)36. Samo dva CpG-a, koji su također bili povezani s metilacijom DNK i eGFR ububrežno tkivo,cg09610644 na BDH1 i cg12644285 na CHD2, bili su među mjestima povezanim s CRP-om. Stoga, generalno zbunjivanje naših rezultata kroz upalni status prema procjeni CRP-a izgleda malo vjerojatnim.

Neki odfunkcija bubrega-povezani CpG-ovi identificirani u ovoj studiji povezani su s nekoliko drugih osobina na osnovu objavljenog EWAS-a. Dvadeset i jedna eGFR lokacija bila je povezana s krvnim tlakom, konzumacijom alkohola, BMI, spolom, receptorom 2 faktora nekroze tumora i/ili pušačkim statusom, a pet UACR lokacija je prethodno bilo povezano s konzumacijom alkohola, statusom pušenja, BMI, obrazovnim postignućem, -glutamil transferaza, rastvorljivi receptor faktora nekroze tumora 2, dijabetes melitus tipa 2 i/ili nekoliko serumskih metabolita (Tabela 2, Dodatni podaci 19). Tri od ovih CpG-a (sve UACR lokacije) bile su povezane s više od dvije osobine, naime cg02711608 u SLC1A5 (sa -glutamil transferazom, -glutamiltreoninom, BMI, konzumacijom alkohola), cg18181703 u SOCS3 (sa dijabetesom melitusom tipa 2, pušačkim statusom B , rastvorljivi receptor faktora nekroze tumora 2), i cg24859433 blizu IER3 (sa pušačkim statusom, obrazovnim postignućem, 4-vinilfenol_sulfat). Dodatna slika 5B prikazuje CpG, cg26099045, koji je bio u korelaciji sa eGFR i fibrozom ububrežnog tkivau našoj analizi, i dodatno povezan sa seksom i pušenjem u prethodnom EWAS-u. Konačno, cg17944885 kod ZNF788 je takođe bio povezan sa eGFR u uzorku pacijenata sa DKD22.

Diskusija

U ovom EWAS-u odfunkciju bubrega, identifikovali smo i replicirali nivoe metilacije DNK u krvi od 69 CpG povezanih sa eGFR. Od toga, 60 lokacija ranije nije prijavljeno, kao i svih sedam CpG-ova identifikovanih u vezi sa UACR-om. Većina CpG-ova povezanih s eGFR-om i UACR-om također je bila značajno povezana sa njihovim kliničkim ishodima, tj. CKD-om i mikroalbuminurijom, te stoga mogu imati potencijal za stratifikaciju pojedinaca pod rizikom. Varijanca eGFR-a pripisana ovim 69 CpG-ova bila je 2,4 posto — dvostruko veća od ranijeg EWAS14, i uporediva je s varijansom objašnjenom sa 29 SNP-ova otkrivenih od strane GWAS-a koji su uključivali tri puta veću veličinu uzorka za otkrivanje lokusa37,38. Ovo sugerira da diferencijalna metilacija DNK na pojedinačnim CpG-ovima kvantificiranim iz krvi objašnjava više varijanse eGFR-a nego pojedinačni uobičajeni SNP-ovi pri datoj veličini uzorka. Za UACR, čini se da su veće veličine uzorka u poređenju sa eGFR potrebne da bi se otkrio sličan broj CpG-ova povezanih sa osobinama. S obzirom da se albumin i kreatinin za izračunavanje UACR mjere u urinu za razliku od kvantifikacije kreatinina iz seruma za procjenu GFR, ova razlika nije neočekivana, iu skladu je sa zapažanjima iz GWAS-a ovih osobina10,13. Nadalje, čini se da genetske varijacije utiču nafunkciju bubregaosobine različitim putevima od promjena u metilaciji DNK. Ovo je podržano malim preklapanjem između repliciranih EWAS i GWAS lokacija za eGFR i UACR.

Ova EWAS meta-analiza uključivala je uzorke različitih populacija i etničkih grupa. Uočili smo visoku korelaciju procena efekata dobijenih iz velikog poduzorka EA pojedinaca sa efektima procenjenim kod AA pojedinaca (slika 2). Uprkos uključivanju podataka od značajnog broja pojedinaca ne-EA porijekla, ukupni rezultati trans-etničkog EWAS-a mogli bi biti vođeni podacima pojedinaca porijeklom iz EA, koji su predstavljali 70 posto (eGFR) / 65 posto (UACR) naše studije (Dopunski podaci 3 i 4). Da bi se riješilo ovo ograničenje, potrebne su buduće analize sa povećanim udjelom uzoraka koji nisu EA za pouzdanu i detaljnu procjenu heterogenosti između predaka. Potencijal za prevođenje uvida iz EWAS-a o kvantitativnim osobinama u studijama uglavnom zasnovanim na populaciji na osobe sa bolešću ilustruje se činjenicom da su procjene efekta na 65 od 69 CpG povezanih s eGFR opažene u istom smjeru u skupini od 551 bolesnika s CKD, ukazujući na mehanizme koji se mogu primijeniti na širok raspon nivoa eGFR (Slika 3). Štaviše,

cg07242931 u MAN1C1 i cg18194850 u SUCLG2 nije bio samo povezan s eGFR, već je i predviđeno vrijeme dootkazivanja bubregaili akutnapovreda bubrega(Dopunski podaci 8). GWAS na dijabetičarima predložio je dodatne dokaze za uključenost SUCLG2, koji kodira -podjedinicu sukcinil-CoA sintetaze, u bolesti bubrega.bolest bubregakod američkih Indijanaca (SNP=rs4453858, P-vrijednost=2E−6)39. Genetska varijacija ovog gena je takođe povezana sa nivoima sukcinil-karnitina u urinu (C4DC, SNP=rs115560420, P-vrijednost=7E−15)40. C4DC je metabolički proizvod iz ciklusa trikarboksilne kiseline, koji se katalizira pod utjecajem sukcinil-CoA sintetaze, a viši nivoi C4DC u krvi su povezani sa nižim eGFR41. Međutim, pretraga u rezultatima lokusa kvantitativnih svojstava metilacije (meQTL) GoDMC-a (http://www.godmc.org.uk)42 nije otkrila značajnu povezanost ova dva SNP-a sa cg18194850, što ukazuje na direktnu vezu između ovih SNP-a. i CpG sajt.

Kako je metilacija DNK glavni regulator ekspresije gena, procijenili smo korelaciju mjesta metilacije DNK povezanih s osobinama sa nivoima mRNA gena u cis-u. Geni čiji su nivoi mRNA u značajnoj korelacijifunkciju bubregapovezana mjesta metilacije DNK bila su povezana s interferonskim putevima (i za eGFR i za UACR). Iako se ovi nalazi slažu s rezultatima obogaćivanja puteva za UACR (Slika 5B, Dodatni podaci 18), broj značajnih korelacija između CpG povezanih s UACR i nivoa transkripta je prilično nizak. Ovo nije iznenađujuće s obzirom na relativno malu veličinu uzorka od 1915 osoba dostupnih za ovu analizu i ograničenu pokrivenost transkriptomskih resursa. Zanimljivo je da su među značajnim nalazima za UACR, dva CpG-a u porodici nosača otopljene tvari 1 član 5 (SLC1A5) bila povezana s diferencijalnom ekspresijom gena i također sa krvnim tlakom. Metilacija DNK na SLC1A5, koji kodira transporter neutralnih aminokiselina ovisan o natrijumu, stoga može biti dodatni element koji doprinosi poznatoj korelaciji između UACR i krvnog tlaka.

Značajni različito eksprimirani transkripti nisu uvijek bili kodirani najbližim genom (cg17944885 blizu ZNF788), ili je CpG mjesto u korelaciji sa više gena u cis (cg04864179 na IRF5). Konkretno, primetna je korelacija metilacije DNK na cg04864179 sa nivoima IRF5 transkripta. Uzimajući u obzir značajan MR rezultat ovog CpG-a sa eGFR, metilacija DNK na IRF5 može uzročno uticati na eGFR posredovan njegovom ekspresijom gena. Uzimajući u obzir transformaciju osobina osnovnih genetskih asocijacija (vidi Metode), primijetili smo da je povećanje metilacije DNK od deset standardnih devijacija rezultiralo 3,2 posto većim eGFR. Iako je ovaj procijenjeni učinak vrlo mali, uzročni utjecaj obrazaca metilacije u krvnim stanicama na CKD također je podržan MR-om sa različitim meQTL skupom podataka u nedavnoj studiji, gdje je uzročni efekat bio usmjeren u skladu s našim rezultatima22. Primjenom kolokalizacije s više osobina, također su pokazali da su genetski efekti ovog lokusa na eGFR posredovani IRF5 metilacijom i ekspresijom gena u krvi. Nadalje, prikazana je kolokalizacija ekspresije gena IRF5 sa eGFR u tubularnom i glomerularnom kompartmentububregtkivo43. Prilikom tumačenja uzročnog efekta uočenog u našoj studiji, međutim, treba imati na umu da su MR analize za CpG cg04864179 pokazale značajnu heterogenost (p < 0,05)="" među="" instrumentima="" (dodatni="" podaci="" 11="" i="" dopunska="" slika="" 7="">

IRF5 kodira člana porodice regulatornog faktora interferona (IRF). Grupa članova porodice IRF sadrži faktore transkripcije sa različitim ulogama, kao što su modulacija aktivnosti imunog sistema, rast i diferencijacija, kao i kontrola ekspresije gena za odgovor interferona na virusne infekcije. IRF5 može uticati na odgovor imunoloških ćelija. Više studija potvrđuje da promjene u metilaciji IRF5 mogu utjecatifunkciju bubregaputem imunoloških puteva: SNP-ovi u IRF5 su povezani sa SLE preko promjena u ekspresiji IRF5 u krvnim monocitima44-46. SLE je autoimuna bolest koju karakterizira aktivacija IFN puta koji može utjecati nabubrezikao lupus nefritis47. Inhibicija hiperaktivacije IRF5 u mišjem modelu SLE zaštićenog od početka i težine lupus nefritisa i poboljšanafunkciju bubregai patologija48,49. Iako se naš EWAS nije fokusirao na proučavanje pacijenata sa SLE, mali efekti metilacije IRF5 na ishode povezane s bubrezima, posredovani barem djelimično njegovom ekspresijom i kasnijim putevima IFN, mogli bi se otkriti kao efekti na eGFR u općoj populaciji.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOL BUBREGA/BUBREGA

Nekoliko CpG-ova povezanih s eGFR-om za koje je metilacija DNK kvantificirana iz krvnih stanica također je povezano s eGFR ibubregfibroze kada je kvantifikovana metilacija DNKbubregtkiva, iako je veličina uzorka bila znatno manja u poređenju sa skupom podataka EWAS. Ovo sugerira da se barem neki od nalaza dobivenih iz krvi mogu prevesti na dodatno ciljno tkivo specifično za osobinu. Evo, krv ibubregsu dva glavna ciljana tkiva specifična za osobine, budući dafunkcijaof thebubregje filtriranje krvi za uklanjanje otpada. Analize obogaćivanjafunkciju bubregapovezani CpG-ovi ukazali su na centralnu ulogu u regulaciji transkripcije. Otkrili smo široko rasprostranjeno obogaćivanje H3K4me1/3 i H3K36me3. H3K4me1/ 3 je povezan sa primarnim i aktivnim pojačivačima, kao i aktivnim promotorima, a H3K36me3 je usko povezan sa transkribovanim regionima genoma50. Uloga regulacije transkripcije je dodatno podržana najjačim signalom obogaćivanja faktora transkripcije CpG-ova povezanih sa UACR, a to je POLR2A, najveća podjedinica glavne mRNA koja sintetiše enzim u eukariotima.

Potencijalna ograničenja vezana za MR analize uključuju to što važeći instrumenti nisu bili dostupni za sve CpG-ove za naprijed MR. S obzirom da su svi instrumenti CpG izabrani iz cis regiona, odnosno istog genetskog regiona, verovatno je da su svi instrumenti CpG ili validni ili nevažeći, čime se ograničava broj različitih MR metoda koje se mogu primeniti za testiranje robusnost rezultata51. Obrnuti MR je bio ograničen u snazi ​​zbog male veličine uzorka dostupnog za procjenu asocijacija metilacije SNP-DNK. Veće meQTL studije, kao što je GoDMC, nisu mogle pohraniti rezultate asocijacije za sve SNP-ove (tj. iznad određene granice P-vrijednosti asocijacije) iz tehničkih razloga, pa stoga nisu bile upotrebljive za obrnuti MR sa dva uzorka. Stoga se nevažni nalazi moraju pažljivo tumačiti. Osim toga, teško je tumačiti veličinu uzročnog efekta, budući da se osnovne genetske asocijacije izračunavaju na skali standardne devijacije nivoa metilacije DNK. Još jedno potencijalno ograničenje studije je da su eGFR, CKD i UACR fenotipovi procijenjeni na osnovu različitih osnovnih parametara i imaju multifaktorske utjecaje. Stoga smo izvršili nekoliko analiza kako bismo osigurali da naši rezultati EWAS nisu vođeni poznatim zbunjujućim faktorima, uključujući dijabetes tipa 2, potencijalni zbunjujući odnos između DNK ifunkciju bubrega. Prvo, EWAS asocijacije u svakoj kohorti su prilagođene zbunjujućim faktorima kako bi se uklonili njihovi efekti unutar kohorte. Drugo, EWAS je urađen u svakoj kohorti posebno, a zatim meta-analiziran, što odgovara prilagođavanju npr. za prevalenciju dijabetesa među kohortama. Konačno, provjerili smo povezanost naših repliciranih CpG u objavljenim EWAS studijama o dijabetesu. Od svih naših repliciranih CpG asocijacija, samo je UACR povezan CpG cg18181703 na SOCS3 pokazao povezanost s dijabetesom tipa 2. Ovaj CpG je također bio povezan sa pušačkim statusom, BMI i nivoima rastvorljivog receptora faktora nekroze tumora 2 u krvi. Uzimajući u obzir da je naš EWAS također prilagođen za pušački status i BMI, pretpostavljamo da su efekti cg18181703 na UACR na najmanje djelomično neovisno o dijabetesu tipa 2, BMI i pušačkom stanju. Dok smo kontrolisali nekoliko od ovih poznatih faktora, drugi faktori kao što su neizmerene kovarijate nisu mogli biti eksplicitno prilagođeni u analizama i mogu uticati na nalaze.

Potrebne su daljnje EWAS studije s povećanom veličinom uzoraka i metilacijom DNK kvantificiranom iz dodatnih tkiva, kao i funkcionalne analize kako bismo proširili naše znanje o regulatornim mehanizmimafunkciju bubrega, i na kraju poboljšati predviđanje i liječenjebubregbolest. Ovo vrijedi posebno za UACR, s obzirom na manji broj uočenih značajnih CpG asocijacija. Ukratko, ova velika EWAS meta-analiza značajno je proširila broj CpG-a koji su reproduktivno povezani sa eGFR i CKD i otkrila sedam asocijacija za UACR i mikroalbuminuriju. Metilacija DNK na ovim mjestima objasnila je veliki dio varijanse eGFR-a, a diferencijalna metilacija na četiri CpG-a pokazala je dokaze o potencijalnoj uzročnoj vezi sa eGFR-om. Sveobuhvatna karakterizacija repliciranih CpG kod pacijenata sa CKD, inbubrežno tkivo,za diferencijalnu ekspresiju gena, i za obogaćene puteve i epigenetske oznake daju uvid ufunkciju bubrega-povezana regulacija transkripcije.

Metode

Pregled.Postavili smo kolaborativnu meta-analizu zasnovanu na distributivnom modelu podataka i procedurama kontrole kvaliteta. Da bi se maksimizirala standardizacija fenotipa u svim studijama, kreirani su plan analize i skripta komandne linije (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) i dostavljeni svim studijama koje učestvuju ( pretežno populacijske studije; Dodatni podaci 1 i 2). Automatski generirane datoteke sažetka su provjerene centralno. Nakon odobrenja fenotipa, studije su pokrenule svoj EWAS i učitale rezultate i agregirane informacije o metilaciji DNK na centralni server. EWAS kontrola kvaliteta je izvršena sa prilagođenim skriptama za procjenu inflacije, pozitivne kontrole, distribuciju CpG sondi i poređenje ukupnih distribucija veličina efekata, standardnih grešaka i P-vrijednosti kroz studije. Svi protokoli istraživanja su odobreni od strane odgovarajućih lokalnih etičkih komiteta. Svi učesnici u svim studijama dali su pismeni informirani pristanak.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREZNU DIJALIZU

Definicija fenotipa.Vrijednosti kreatinina dobijene Jafféom prije 2009 kalibrirane su množenjem sa 0,9552. Studije su procijenile GFR kod kroničnogBolest bubregaEpidemiology Collaboration (CKD-EPI) jednadžba53. eGFR je winsorized na 15 i 200 ml min−1 po 1,73 m2. CKD je definisan kao eGFR ispod 60 ml min−1 na 1,73 m2. Vrijednosti UACR izmjerene u mg/g su prirodno log-transformirane prije svih analiza. Mikroalbuminurija je definirana kao 1 za UACR > 30 mg/g i kao 0 za vrijednosti UACR < 10="">

Kvantifikacija metilacije DNK i kontrola kvaliteta.Za kvantifikaciju metilacije DNK, genomska DNK je ekstrahirana iz periferne krvi. Nivoi metilacije DNK kvantificirani su korištenjem Infinium MethylationEPIC BeadChip niza (EPIC), Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip niza (HM450K) ili Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip niza (HM27K). Prethodna obrada podataka o metilaciji DNK izvršena je prema individualnim protokolima studije uključujući korekciju pozadine, kvantilnu normalizaciju, filtriranje sonde, filtriranje uzoraka, usklađivanje SNP-a sa lokacijama kontrolne sonde SNP, filtriranje izvana i korekciju tipa testa (dodatni podaci 3). Nivo metilacije na svakom mjestu je predstavljen i analiziran kao -vrijednost. CpG sonde koje se preklapaju sa SNP-ovima su označene. Svaka studija je izračunala srednju vrijednost i standardnu ​​devijaciju za svaku CpG lokaciju i ova sumarna statistika je upoređena između studija za sistematske razlike među CpG-ovima i praćena sa pojedinačnim analitičarima studije

Kovarijatna procjena.Metilacija DNK i kovarijati su izmjereni u istoj posjeti/vremenskoj tački. Preovlađujući dijabetes je definiran kao glukoza u plazmi natašte veća ili jednaka 126 mg/dl, glukoza u plazmi koja nije natašte veća ili jednaka 200 mg/dl, liječenje dijabetesa ili samoprijavljivanje dijagnoze dijabetesa. Preovlađujuća hipertenzija je definirana kao sistolni krvni tlak veći ili jednak 140 mm Hg, dijastolni krvni tlak veći ili jednak 90 mm Hg ili liječenje hipertenzije. Ako izmjereni krvni tlak nije bio dostupan, hipertenzija je definirana samoprijavom. Trenutni status pušenja definiran je korištenjem informacija koje su sami prijavili. BMI (kg/m2) je izračunat korišćenjem merenja težine i visine kako je procenjeno u svakoj studiji. Starost je uključena kao kontinuirana vrijednost u modele asocijacija. Populaciona struktura u neporodičnim studijama je prilagođena genetskim glavnim komponentama (PC). Proporcije tipova bijelih krvnih zrnaca procijenjene su na osnovu metilacije DNK54. Dodatne tehničke kovarijate uključivale su PC-ove kontrolne sonde55, centar za proučavanje, paket za obradu, ID senzora niza i poziciju stražara.

Statističke metode i metaanaliza. Kako bi se osigurala uporediva snaga među analiziranim mjestima, samo su autosomni CpG-ovi mjereni oba, EPIC i HM450K, uključeni u analize. Svaka studija je radila linearne regresijske analize razdvojene po grupama predaka. Za procjenu robusnosti rezultata EWAS-a, analize su bile ograničene na studije i poduzorke pojedinaca evropskog porijekla. Vrijednosti metilacije DNK modelirane su kao zavisne varijable s osobinama koje su ili kontinuirane vrijednosti eGFR ili UACR ili binarne varijable CKD ili mikroalbuminurije: DNK metilacija ~ osobina plus spol plus starost plus genetski PC plus proporcije bijelih krvnih zrnaca plus tehničke kovarijate plus dijabetes plus hipertenzija plus BMI plus trenutno pušenje Učesnicima su bile potrebne potpune informacije za sve varijable i zbirne statistike studije i bili su uključeni samo ako je bilo dostupno najmanje 50 učesnika za eGFR/UACR i 50 slučajeva/kontrola za CKD/mikroalbuminuriju. Svaki EWAS specifičan za studiju je prilagođen za inflaciju prije meta-analize prema BACON pristupu ako je procjena inflacije veća ili jednaka jedan (dodatna slika 8)56. Studije su podijeljene na otkrivanje i replikaciju hronološkim redoslijedom doprinosa meta-analizi konzorcijuma CKDGen (dodatni podaci 1 i 2). Meta-analiza fiksnog efekta ponderisana inverznom varijansom koja je implementirana u R paketu 'metafor' (verzija 2.1-0) izvedena je za studije otkrića, studije replikacije i za rezultirajuće procjene efekta otkrića i replikacije. CpG-ovi su isključeni ako je manje od polovine odgovarajuće veličine uzorka bilo dostupno u okviru otkrića ili replikacije ili ako je procjena heterogenosti I2 bila veća od 95 posto. Uspješna replikacija pridruženog CpG-a je definirana kao dosljedan smjer procjene efekta između otkrića (neGFR disk=22,347, nUACR disk=11,458) i replikacije (neGFR repl=11,258 , nUACR repl=3610) meta-analiza, Bonferronijeva prilagođena važnost P-vrijednosti otkrića (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Analize ekspresije gena.Efektifunkciju bubregaCpG-ovi povezani sa osobinama testirani su na povezanost s ekspresijom gena u krvi koristeći dva skupa podataka: (1) nivoi mRNA monocita od 1202 učesnika MESA studije i (2) mRNA u cijeloj krvi 713 osoba KORA F4 studija 57,58. Kao početni korak, izvršeno je traženje nivoa CpG metilacije sa nivoima mRNA dostupnih u rezultatima asocijacije iz MESA studije. Za ovo traženje, bili su dostupni rezultati asocijacije sa P-vrijednošću < 1e{{10}}.="" analiza="" je="" detaljno="" opisana="" u="" kennedy="" et="" al.59.="" ukratko,="" ekspresija="" gena="" je="" procijenjena="" korištenjem="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" i="" v4.0="" expression="" beadchips-a="" i="" dnk="" metilacije="" pomoću="" illumina="" hm450k="" niza.="" vrijednosti="" ekspresije="" su="" normalizirane="" pomoću="" transformacije="" koja="" stabilizira="" varijansu.="" 13.933="" transkripta="" iz="" v3.0="" i="" v4.0="" nizova,="" koji="" su="" bili="" značajno="" izraženi="" iznad="" nivoa="" pozadine="" (p-vrijednost="" detekcije="">< 0,01)="" kod="" najmanje="" 5="" posto="" ispitanika.="" analize="" asocijacija="" u="" mesa="" su="" izvedene="" kao="" linearni="" mješoviti="" model="" koristeći="" log-transformirane="" vrijednosti="" ekspresije="" gena="" kao="" zavisnu="" varijablu,="" vrijednosti="" beta="" metilacije="" dnk="" kao="" nezavisnu="" varijablu="" s="" godinama,="" spolom,="" etničkom="" pripadnošću="" i="" studijskim="" centrom="" koji="" su="" dodani="" kao="" kovarijate="" u="" model.="" drugi="" test="" asocijacije="" izveden="" je="" u="" skupu="" podataka="" kora="" f4.="" povezanost="" nivoa="" metilacije="" kod="" repliciranih="" cpg-ova="" sa="" nivoima="" genske="" ekspresije="" gena="" u="" blizini="" ±500="" kb="" izračunata="" je="" korišćenjem="" log2-transformisanih="" nivoa="" mrna="" dobijenih="" iz="" illumina="" human="" ht-12v3="" genske="" ekspresije="" niza.="" vrijednosti="" ekspresije="" gena="" su="" regresirane="" na="" vrijednosti="" beta="" metilacije="" dnk="" prilagođene="" spolu="" i="" starosti.="" prije="" analize="" tehnički="" faktori,="" kao="" i="" proporcije="" tipova="" krvnih="" stanica,="" regresirani="" su="" iz="" nivoa="" mrna="" i="" dnk="" metilacije,="" a="" njeni="" ostaci="" su="" uključeni="" u="" konačni="" model="" asocijacije.="" napomene="" i="" kontrole="" kvaliteta="" sondi="" za="" ekspresiju="" gena="" zasnovane="" su="" na="" tabeli="" datoj="" u="" schurmann="" et="" al.60.="" asocijacije="" ekspresije="" cpg-gena="" u="" krvi="" koje="" su="" bile="" dostupne="" u="" mesa="" rezultatima="" i="" imale="" su="" povezanost=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metilacija DNK u tkivu bubrega.Analize koje koriste DNK metilaciju ububrežnog tkivasa eGFR i fibrozom urađeni su pomoću podataka iz 506 mikrodisekovanihbubrežnog tkivauzorke koristeći Illumina EPIC BeadChip. Uzorci tkiva bubrega prikupljeni su odvojeno i razlikuju se od uzoraka krvi koji su analizirani u EWAS meta-analizi. Ovi uzorci su sakupljeni iz netaknutih dijelova tumorskih nefrektomija i pripremljeni kako je opisano prije 61. Ukratko, softver SeSAMe62 je korišten za izvođenje predobrade i kontrole kvaliteta uključujući detekciju na bazi niskog intenziteta, korekciju prolaska kroz oduzimanje pozadine, nelinearnu korekciju pristranosti boje, kontrola konverzije bisulfita, izračunavanje beta vrijednosti i procjena frakcije leukocita. Beta vrijednosti CpG povezanih sa eGFR i UACR i kliničke informacije su ekstrahovane za analizu asocijacije. Regresijski model je primijenjen za testiranje povezanosti beta metilacije DNK konačnih CpG-ova kao zavisnih varijabli sa nivoima eGFR i fibroze, respektivno, kao nezavisnih varijabli prilagođenih za spol, dob, genetski PC (1-5), status dijabetesa, status hipertenzije , BMI, ID niza sentrixa, pozicija sentriksa i kontrola konverzije bisulfita i procijenjena frakcija leukocita.

Ciljana istraživanja eGFR sondi kod pacijenata sa CKD. Povezanost 69 eGFR povezanih i validiranih CpG iz opće populacije s eGFR u njemačkoj hroničnojBolest bubrega (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Praćenje pacijenata za kliničke krajnje tačke još je u toku. Krajnje tačke studije se kontinuirano bilježe na standardizirani način na osnovu otpusnih pisama iz bolnice i potvrda o smrti i uključuju događaje povezane s bubrezima, kao i smrt. Dizajn studije i regrutovana studijska populacija su detaljnije opisani u prethodnim publikacijama63,64. GCKD studiju su odobrili lokalni etički komiteti i upisali je u nacionalni registar za kliničke studije (DRKS 00003971). Podskup od 559 pacijenata sa CKD-om koji se pripisuje sistemskom eritematoznom lupusu, membranskoj nefropatiji, fokalnoj segmentnoj glomerulosklerozi ili autosomno dominantnoj policističnojbolest bubregaje odabran za kvantifikaciju metilacije DNK i izmjeren korištenjem Infinium MethylationEPIC BeadChip niza (EPIC). Povezanost sa eGFR procijenjena je analogno glavnoj analizi (vidi Statističke metode i metaanaliza), osim prilagođavanja za pušenje koje je kodirano 0/1/2 za nikad/bivše/trenutne pušače. Procijeniti povezanost metilacije DNK s vremenomotkazivanja bubregaod ulaska u studiju, Coxovi regresijski modeli su ugrađeni za svaki CpG, a analogno i za kombinovanu krajnju tačkuotkazivanja bubregai akutnapovreda bubrega.Pored prediktora metilacije DNK, modeli su prilagođeni za dob, spol i podtip CKD. Cox-ov regresijski model daje procjene omjera opasnosti specifičnog za uzrok (HR) u prisustvu konkurentnih događaja, tj. bilo koje druge smrti osim smrti uzrokovane bubrezima. Dodatno su rađene analize opasnosti poddistribucije kako bi se procijenili potencijalni indirektni efekti preko konkurentskog događaja. Pretpostavka o proporcionalnim opasnostima procijenjena je na osnovu skaliranih Schoenfeldovih reziduala. Grafička procjena za dva povezana CpG-a nije otkrila nikakve dokaze o većim kršenjima (dopunska slika 9).

Regionalne asocijacijske parcele i napomene. Grafike za dodatnu sliku 5 kreirane su pomoću paketa 'Gviz' 65 i 'rtracklayer' 66 R. Maksimalno 40 lokacija unutar 50,000 bp uzvodno ili nizvodno od CpG stranice od interesa je uključeno u dijagram. Ako je interval sadržavao više od 40 lokacija, ucrtana regija je smanjena na udaljenost najudaljenije lokacije plus 10,000 bp. Sekcija RefSeq Genes je zasnovana na UCSC NCBI RefSeq stazi sa simbolima gena iz paketa 'org.Hs.eg.db' R, odeljak CpG Islands je zasnovan na UCSC CpG Islands stazi, odeljak Putokaza chromHMM zasnovan je na Mape puta 15- navode chromHMM model fetusabubregepigenom (Mapa Epigenoma ID: E086)67 i odjeljak Common SNPs je zasnovan na UCSC Common SNPs(151) stazi68. Konačno, dijagram korelacije CpG na dnu slike zasnovan je na podacima uzoraka metilacije DNK studije KORA F4 koristeći Illumina HumanMethylation450 BeadChip niz, sa nedostajućim mjestima obojenim svijetlo sivom bojom.

Varijanca se objašnjava metilacijom DNK.Procenat fenotipske varijanse objašnjen sa 69 repliciranih CpG povezanih sa eGFR procijenjen je korištenjem podataka od 1.888 učesnika iz KORA FF4 studije, sedmogodišnjeg praćenja KORA F4 studije57,58. KORA FF4 nije bio dio EWAS meta-analize. Međutim, 988 pojedinaca uključenih u analizu objašnjene varijanse preklapalo se sa KORA F4 učesnicima EWAS-a. U ovom skupu podataka, varijansa objašnjena svim CpG-ovima neovisno o kovarijatima procijenjena je kao razlika u R2 osnovnog modela uključujući CpG-ove i onog bez njega. Osnovni model je definisan kaobubregosobina ~spol plus dob plus proporcije bijelih krvnih zrnaca plus dijabetes plus hipertenzija plus BMI plus trenutno pušenje sabubregosobina koja predstavlja eGFR i UACR. Za dva CpG-a povezana s eGFR (cg06008406, cg20004659), podaci nisu bili dostupni u KORA FF4 skupu podataka.

Dvosmjerna Mendelova analiza randomizacije.U naprednom MR-u, koristeći 'TwoSampleMR' R paket69, istražili smo potencijalne uzročne efekte metilacije DNK na repliciranim CpG-ovima na eGFR i UACR. MR koristi genetske instrumente kako bi minimizirao pristrasnost zbog zbunjujuće i obrnute uzročnosti70. Genetski instrumenti za metilaciju DNK (meQTL) bili su dostupni za 47 i pet CpG za eGFR i UACR, respektivno, kako je prethodno identifikovao GoDMC kod do 27,750 pojedinaca42. Sažetak evropskog porijekla GWAS podaci o eGFR10 i UACR13 korišteni su kao odgovarajući podaci o ishodu. Filteri su primijenjeni za meQTL inkluziju (pSNP < 1e−5="" sa="" metilacijom="" dnk="" u="" ±="" 500kb="" cis="" regiji,="" neravnoteža="" veza="" r2="">< 0,2="" unutar="" 1mb="" regije,="" steigerovo="" filtriranje,="" maf=""> 0,05). Izvršili smo MR ponderisanu inverznom varijansom, kao i MR analize osjetljivosti (jednostavni način, ponderirani mod, ponderirani medijan i MR Egger), ili triangulaciju procjenom Waldovog omjera u slučaju da je bio dostupan samo jedan instrument po CpG mjestu71–73. Procjene efekata dobivene iz MR-a zavise od jedinica osnovnih skupova podataka i u ovom slučaju odgovaraju promjeni po jedinici u jednoj standardnoj devijaciji nivoa metilacije na prirodnom log-transformiranom eGFR-u i standardnoj devijaciji prirodnog log-transformiranog UACR-a, respektivno. U obrnutom MR, ispitali smo potencijalne uzročne efektefunkciju bubregaosobine na metilaciju DNK, koristeći značajne SNP-ove za cijeli genom iz transetničkih GWAS na eGFR10 i UACR13 kao genetske instrumente za eGFR i UACR, respektivno. Da bismo maksimizirali snagu podataka o ishodima, izvršili smo meta-analizu z-skora SNP-CpG asocijacija iz KORA F4 (n=1662) ​​i FHS (n=3868) studija. Procjene kombinovanog efekta i njihove standardne greške meQTL uključenog u MR procijenjene su iz veličine uzorka, učestalosti alela i z-skora74. Filteri su primijenjeni za uključivanje SNP-a (P-vrijednost < 5e−8="">bubregosobina, jednostrana P-vrijednost < 0.05="" sa="" azotom="" ureje="" u="" krvi="" za="" egfr="" instrumente,="" heterogenost="" predaka="" p-vrijednost="" veća="" ili="" jednaka="" 0.0="" 1,="" steigerovo="" filtriranje,="" maf=""> 0.05). Izvršili smo MR ponderiranu inverznom varijansom s multiplikativnim slučajnim efektima (jer je po osobini bio dostupan dovoljno veliki broj instrumenata iz različitih lokusa)51 i analize osjetljivosti MR (jednostavni način, ponderirani mod, ponderirani medijan i MR Egger)71–73. Kao dodatna analiza osjetljivosti koja se bavi pleiotropnim varijantama, isključili smo ukupno 35 instrumenata koji su bili povezani s dijabetesom mellitusom tipa 2 u nedavnom GWAS75 uključujući 898.130 pojedinaca: jedanaest SNP-ova koji su imali povezanost P-vrijednosti < 5e-8="" sa="" dijabetesom="" i="" 24="" dodatna="" instrumenti="" koji="" su="" bili="" u="" neravnoteži="" veze="" (r2=""> 0,2 unutar 1 Mb, 1000 G EUR referentni panel) sa takvim SNP-om povezanim sa dijabetesom. Neravnoteža veze je procijenjena putem LDlink76. Za obrnuti MR, procjene efekata daju promjenu po jedinici prirodnog log transformiranog eGFR-a, odnosno standardnu ​​devijaciju prirodnog log transformiranog UACR-a, na standardnoj devijaciji nivoa metilacije DNK. Prilagođavanje višestrukog testiranja P-vrijednosti prema Benjamini–Hochberg FDR < 0,05="" primijenjeno="" je="" po="" osobini="" bubrega,="" a="" za="" naprijed="" i="" nazad="" mr="" odvojeno77.="" heterogenost="" p-vrijednosti="" su="" dobijene="" iz="">

Analize obogaćivanja.Da bismo informisali o potencijalnim funkcionalnim efektima pridruženih CpG-ova, procijenili smo obogaćivanje ovih CpG-ova na mjestima DNaze I ili histonske modifikacije (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), genskih skupova zasnovanih na GO terminima i putevima u bazama podataka KEGG i Reactome32 –35. Analize obogaćivanja TFBS-a izvedene su kako je prethodno detaljno opisano14. Ukratko, testiranje obogaćivanja je procijenjeno korištenjem eForge78 korištenjem permutacije sa podudaranjem za lokalizaciju gena i CpG regije otoka prilikom uzorkovanja. Podaci su dobijeni iz projekata ENCODE (125 uzoraka) ili Roadmap Epigenomics (299 uzoraka) generiranih metodom Hotspot67,79,80. CpG-ovi koji su bili povezani sa eGFR i UACR, pri P-vrijednosti < 1e−05="" u="" meta-analizi,="" korišteni="" su="" kao="" ulaz="" (dodatni="" podaci="" 6="" i="" 7),="" a="" 10,000="" ponavljanja="" uzorkovanja,="" aktivni="" filter="" blizine="" i="" smatra="" se="" da="" je="" fdr="">< 0,05="" značajan="" (dodatni="" podaci="" 13="" i="" 14).="" analogno="" su="" izvedene="" analize="" obogaćivanja="" histonskih="" oznaka="" (dodatni="" podaci="" 15="" i="" 16).="" obogaćivanje="" genskim="" skupovima="" ili="" putevima="" je="" procijenjeno="" korištenjem="" methylgsa="" paketa="" i="" r="" verzije="" 3.6.181.="" metoda="" testa="" obogaćivanja="" bila="" je="" metilglm="" implementirajući="" logističku="" regresiju="" koja="" prilagođava="" broj="" sondi="" po="" genu="" i="" autozomnu="" pozadinu="" koja="" se="" preklapa="" sa="" 450k="" i="" epic="" nizovima.="" testirani="" su="" genski="" skupovi="" ili="" putevi="" sa="" 100-500="" gena="" (podrazumevana="" postavka).="" smatrali="" smo="" da="" je="" skup="" gena="" ili="" put="" značajno="" obogaćen="" pri="" fdr="">< 0,05="" ispravljajući="" za="" višestruko="" testiranje="" unutar="" svake="" baze="" podataka="" koristeći="" benjamini="" i="" hochbergov="" metod="" (dodatni="" podaci="" 17="" i="">