Melatonin iz mikroorganizama, algi i biljaka kao moguća alternativa sintetičkom melatoninu 1. dio

sažetak: Melatonin dijetetski suplementi se široko konzumiraju širom svijeta, a razvijene zemlje su najveći potrošači, s procijenjenom godišnjom stopom rasta od približno 10 posto do 2027. godine, uglavnom u zemljama u razvoju. Široka upotreba melatonina protiv poremećaja spavanja i posebnih problema, kao što je jet lag, dodata je drugim primjenama, kao što su anti-aging, anti-stres, aktivacija imunološkog sistema, antikancer i druge, koje su pokrenule njegovu upotrebu, općenito bez recepta. Hemijska industrija trenutno pokriva 100 posto potreba tržišta melatonina. Motivisana sektorima sa prirodnijim potrošačkim navikama, prije nekoliko godina pojavila se mogućnost dobivanja melatonina iz biljaka, nazvanog fitomelatonin. Nedavno je farmaceutska industrija razvila genetski modificirane mikroorganizme čija je sposobnost proizvodnje prirodnog melatonina u bioreaktorima poboljšana. Ovaj rad razmatra aspekte hemijske i biološke sinteze melatonina za ljudsku prehranu, uglavnom kao dodatak prehrani. Analiziraju se prednosti i nedostaci dobivanja melatonina iz mikroorganizama i fitomelatonina iz biljaka i algi, kao i prednosti prirodnog melatonina, izbjegavanje neželjenih kemijskih nusproizvoda iz kemijske sinteze melatonina. Na kraju, analizirani su ekonomski i kvalitetni aspekti ovih novih proizvoda, od kojih su neki već plasirani na tržište.

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju spermatozoida. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i može ukloniti reaktivne vrste kisika, spriječiti degradaciju kolagena izazvanu slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Cistanche Side Effects Reddit

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne riječi: dodaci prehrani; GMO; melatonin; mikroorganizmi; fitomelatonin; biljne sirovine

1. Uvod

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is widely used around the world as a  dietary supplement. In general, melatonin is used as a sleep aid supplement, a mild tranquilizer, a generalist antioxidant, and an anticancer and anti-aging component, among others [1]. According to the American Psychiatric Association (APA), approximately one-third of adults suffer from insomnia during their lifetime [2]. It manifests itself in ongoing problems falling asleep and staying asleep. Therefore, it is very likely that the use of synthetic melatonin will spread. In 2019, the global production of synthetic melatonin,  which was around 4000 tons, accounted for around 1.3 billion USD. This vast market is fully assisted by the chemical melatonin, whose synthesis process is very cheap, effective, and,  therefore, lucrative. The melatonin market is expected to grow at a CAGR (compound annual growth rate) of >10 posto u narednih 5 godina. Uz ovaj značajan porast potražnje, problemi s nesanicom uzrokovani pandemijom COVID-19 bili su od velike važnosti [3]. Sjeverna Amerika ima najveću potrošnju daleko, a slijedi je Evropa. Globalno tržište melatonina uglavnom kontroliše nekoliko velikih kompanija, kao što su BASF, Aspen Pharmacare Australia, Nature's Bounty, Pfizer Inc., Natrol LLC, Aurobindo Pharma i Biotics Research Co. Imajte na umu da potrošnja melatonina u medicinske svrhe uključuje oko 50 posto proizvedenog sintetičkog melatonina; ostatak ima hemijsku i industrijsku primjenu [2,4].

Biološki, melatonin je molekul koji je široko rasprostranjen u svim carstvima živih organizama [5]. Otkriven 1958. godine u epifizi krave [6], a kasnije i kod ljudi [7], jedan je od najistraženijih biomolekula, a poznate su njegove višestruke funkcije, uglavnom kod sisara [8,9], ali i kod riba. [10–12], perad [13,14] i beskičmenjaci [15]. U životinjskim i ljudskim stanicama melatonin djeluje kao antioksidans – relevantna uloga koja mu se pripisuje 1993. [16–18]. Melatonin djeluje kao interesantan zaštitnik stanica u stresnim situacijama, u različitim fiziološkim aspektima kod ljudi, a prema brojnim studijama pogoduje poboljšanju kod različitih bolesti i disfunkcija. Slika 1 prikazuje neka od zaštitnih i regulatornih djelovanja melatonina kod ljudi i predstavlja melatonin kao zanimljivu pleiotropnu molekulu, koja se ističe po svojoj važnosti, ulozi melatonina u regulaciji metabolizma lipida i glukoze, izazivanju noćne inzulinske rezistencije i dnevne inzulinske rezistencije. osjetljivost. Čini se da je ovaj efekat povezan sa noćnim postom i dnevnim hranjenjem, sprečavajući prekomerno povećanje telesne težine [19]. Također ističemo njegovu ulogu kao antionkogenog agensa, koji inhibira rast, proliferaciju i metastaze nekoliko tumora. Liječenje tumora melatoninom poboljšalo je osjetljivost na kemoterapiju i radioterapiju, djelujući kao sinergistički molekul u kontroli stanica raka. Osim toga, melatonin ublažava akutno oštećenje normalnih stanica, štiteći ih od toksičnosti lijekova, vjerovatno jačanjem imunoloških odgovora [20-22]. Među disfunkcijama i bolestima kod kojih su proučavani korisni efekti melatonina su neurološke, kao što su Alchajmerova, Parkinsonova, fibromijalgija, depresija, poremećaj pažnje i hiperaktivnost, autizam i migrene; kardiovaskularni zdravstveni problemi, uključujući hiperholesterolemiju, hipertenziju, metabolički sindrom i glikemijski disbalans; gastrointestinalni zdravstveni problemi, kao što su gastroezofagealni refluks, čirevi i sindrom iritabilnog crijeva; imunološki zdravstveni problemi, kao što su multipla skleroza, autoimune reakcije (atletski stres, toksični stres, psorijaza, itd.), sepsa, COVID-19, itd. [3,23–26]; kao i osteopenija [27], sarkopenija [28], preeklampsija, plodnost, sindrom policističnih jajnika i menopauza, između ostalih [29–32]. Međutim, iako je melatonin molekul koji je široko proučavan od 1950-ih, provedene studije zahtijevaju više kliničkih i opsežnijih dvostruko slijepih ispitivanja kako bi se razjasnilo njegovo ponekad zbunjujuće pleiotropno djelovanje [33,34].

Međutim, melatonin je dobro poznat po tome što je hormon koji reguliše san. Njegov oscilirajući nivo u krvotoku prema periodima svjetla i tame (cirkadijalni ritmovi) zbog oslobađanja melatonina od strane epifize jedan je od najproučavanijih i najpoznatijih aspekata ove molekule. Povećanje nivoa melatonina u krvi tokom prvog perioda sna na oko 150-220 polova/mL deluje na inicijaciju spavanja, smanjuje latenciju i fragmentaciju sna i povećava trajanje i kvalitet sna [1,35,36]. Melatonin djeluje kao unutrašnji sinhronizator cirkadijalnog ciklusa spavanja i buđenja i sezonskog ritma. U tom smislu, melatoninom su liječeni mnogi poremećaji spavanja, uključujući sindrom odgođene faze spavanja, poremećaj spavanja u noćnoj smjeni, sezonski afektivni poremećaj, poremećaj spavanja kod slijepih i starenja te patofiziološke poremećaje djece, sa značajnim poboljšanjima u kvaliteti sna [ 37–41]. Najrasprostranjeniji poremećaj koji se liječi melatoninom je jet lag – defaziranje ritma spavanja i buđenja nakon prekookeanskih letova [42–45]. Moguće je da je naglasak u studijama na njegovu ulogu regulatora sna uzrokovao nedostatak studija o njegovoj mogućoj ulozi u mnogim drugim fiziološkim i kliničkim aspektima.

Melatonin u biljkama, takozvani fitomelatonin, otkriven je istovremeno od strane tri istraživačke grupe u različitom biljnom materijalu 1995. godine [46–48]. Termin fitomelatonin, koji se odnosi na melatonin biljnog porijekla (biljke i alge), koristi se da ga razlikuje od životinjskog i/ili sintetičkog melatonina. Ovaj termin je veoma rasprostranjen i kontinuirano se koristi u studijama fitohemije, fiziologije biljaka, botanike, hemije hrane itd., o biljnom melatoninu. U biljkama, fitomelatonin je također pleiotropni molekul, koji ima višestruke uloge u različitim fiziološkim odgovorima (slika 1). Regulacija melatoninom aspekata kao što su fotosinteza, uključujući unos CO2 u stomatu i ekonomičnost vode, metabolizam ugljikohidrata, lipida, dušika i sumpora, te jednostavni metabolizam fenola, flavonoida i terpenoida, pokazala je ključno interesovanje za osnovne i tehničke procese vegetativne (klijanje, rast biljaka, ukorjenjivanje, grananje, itd.) i reproduktivni razvoj, uključujući plodnost, partenokarpiju, razvoj sjemena i plodova, sazrijevanje, starenje i očuvanje plodova i rezanog cvijeća [49–53]. Općenito, melatonin reguliše ove procese djelovanjem biljne hormonske mreže, regulišući gore/dole nekoliko faktora biosinteze, kataboličkih i transkripcijskih faktora koji su povezani s biljnim hormonima [54–56]. Jedan od aspekata najvećeg agronomskog i biotehnološkog interesa je uloga fitomelatonina kao promotora tolerancije na biotičke i abiotske stresove [57–68] (Slika 1). Trenutno se fitomelatonin predstavlja kao zanimljivo ekološki prihvatljivo sredstvo za kontrolu bioloških bolesti i za olakšavanje otpornosti/prilagođavanja biljaka/protiv klimatskih promjena.

2. Biosinteza melatonina

Melatonin je acetilirano jedinjenje izvedeno iz serotonina. Oba indolna amina sintetiziraju se iz aminokiseline triptofana biosintetskim putem koji je opsežno proučavan i kod životinja i kod biljaka [69,70]. U biljkama se triptofan pretvara u triptamin pomoću enzima triptofan dekarboksilaze (TDC) (slika 2). Triptamin se zatim pretvara u 5-hidroksitriptamin (serotonin) pomoću triptamin 5-hidroksilaze (T5H), enzima koji je opširno proučavan u riži i koji može djelovati s mnogim supstratima, iako to nije proučavano u dubinu. Serotonin je N-acetiliran serotonin N-acetiltransferazom (SNAT). N-acetilserotonin se zatim metilira acetilserotonin metil transferazom (ASMT) – hidroksi indol-O-metiltransferazom – koja stvara melatonin. U biljkama, metilacija N-acetilserotonina se također može izvesti pomoću O-metiltransferaze kafeinske kiseline (COMT), klase enzima koji mogu djelovati na različite supstrate, uključujući kafeinsku kiselinu i kvercetin [71]. Serotonin se također može transformirati u 5-metoksi triptamin pomoću ASMT/COMT-a kako bi se stvorio melatonin nakon djelovanja SNAT-a. Ovaj put bi se pojavio u situacijama starenja i/ili stresa [70,72]. Nadalje, melatonin se može generirati stvaranjem N-acetil triptamina pomoću SNAT-a, koji bi bio pretvoren u N-acetilserotonin pomoću T5H [73], iako ovaj put nije dokazan, vjerovatno zato što je T5H najmanje proučavan enzim u tom putu. (Slika 2). Zanimljivo je da su do četiri gena koji kodiraju histon deacetilaze (DAC) identificirana u biljkama riže koji mogu preokrenuti korake od serotonina do N-acetilserotonina i od 5-metoksi triptamina do melatonina. DAC, izražen u hloroplastu, pokazao je enzimsku aktivnost prema N-acetilserotoninu, N-acetil triptaminu i melatoninu, s najvećom aktivnošću deacetilaze za N-acetil tiramin [74].

U životinjskim ćelijama serotonin se formira iz 5-hidroksitriptofana nakon sekvencijalnog djelovanja triptofan hidroksilaze (TPH) i TDC. Iako TPH nije otkriven u biljkama, prisustvo 5-hidroksitriptofana sugerira da neke enzimske aktivnosti, poput one TPH, djeluju u manjoj mjeri u biljnim stanicama. Štaviše, melatonin se može generirati kroz formiranje 5-metoksi triptamina, uglavnom u uslovima stresa kako je predložilo nekoliko autora, što sugerira da put biosinteze melatonina može slijediti različite alternativne puteve u poređenju sa životinjskim stanicama, s većom sposobnošću prilagođavanja na metaboličke promjene u biljkama [72,75]. Svi navedeni enzimi su otkriveni i karakterizirani u riži i Arabidopsisu, osim TPH, koji je dobro poznat kod životinja, ali ne i u biljkama. Ipak, neki autori su predložili da T5H može djelovati kao hidroksilaza sa niskom specifičnošću supstrata i da je sposoban djelovati u svim opisanim koracima hidroksilacije [70,76–79]. Ova ista široka specifičnost supstrata se takođe može pripisati enzimima SNAT, ASMT i COMT. Intermedijeri melatonina proizvode se u različitim subćelijskim odjeljcima, kao što su citoplazma, endoplazmatski retikulum, mitohondrije i hloroplasti, koji određuju sljedeće enzimske korake [80,81].

U mikroorganizmima, postoji nekoliko studija o putu biosinteze melatonina [82]. Saccharomyces i bakterije (Geobacillus, Bacillus i Pseudomonas) proizvode i serotonin i melatonin u različitim koncentracijama [83-89]. Štaviše, proizvodnju melatonina su dokazali i drugi autori u kulturama kvasaca Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae i S. uvarum i bakterija (Agrobacterium, Pseudomonas, Variovorax, Bacillus i Oenococcus) [85,90,91] i ranije u fotosintetskim bakterijama Rhodospirillum rubrum [92] i Erythrobacter longus [93] i Escherichia coli [94].

U kvascu Saccharomyces cerevisiae, za razliku od biljaka i životinja, čini se da ne dolazi do biosinteze 5-hidroksitriptofana iz triptofana. Zanimljivo je da se čini da je nekoliko opisanih faza reverzibilno kod S. cerevisiae, kao što je između 5-hidroksitriptofana i serotonina, N-acetilserotonina i melatonina, i 5-metoksi triptamina i melatonina [90,95], kao što je detaljno prikazano na slici 2. U Bacillus amyloliquefaciens SB-9 i Pseudomonas fluorescens RG11, 5- hidroksitriptofan, serotonin i N-acetilserotonin, ali nije otkriven triptamin [85,86]. Dakle, nekoliko gena bakterijskog porijekla korišteno je za izgradnju soja Escherichia coli koji proizvodi melatonin. Na primjer, ispitani su gen DDC, koji kodira aromatsku L-aminokiselinsku dekarboksilazu iz Candidatus Koribacter versatile Ellin 345 i Draconibacterium orientale, i gen AANAT, koji kodira alkilamin N-acetiltransferazu iz Streptomyces griseofuscus [96]. Bez sumnje, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnili kompletni biosintetski putevi melatonina u različitim prokariotskim i eukariotskim mikrobima [82].

3. Biološki melatonin u odnosu na sintetički melatonin

U početku je melatonin za eksperimentalne i kliničke studije dobijan iz životinjskih izvora (uglavnom iz epifize i urina), sa posljedičnim rizikom od virusnog prijenosa [98,99]. Ove tehnike su povučene kada se melatonin mogao dobiti hemijskom sintezom [100]. Trenutno se sav melatonin koji se koristi u industrijske i medicinske svrhe dobiva primjenom metoda kemijske sinteze. Ove metode, koje su predstavljale ozbiljne probleme 1980-ih, uključujući smrt zbog prisustva nusproizvoda sinteze iz triptofana [101], danas su mnogo sigurnije i efikasnije. Međutim, preparati melatonina opisali su prisustvo čitavog niza nepoželjnih nusproizvoda zbog njihove toksične prirode. Slika 3 prikazuje tri najčešće korišćena puta hemijske sinteze melatonina i nusproizvoda koji nastaju u njegovoj sintezi [102]. Sinteza melatonina iz derivata triptofana (slika 3, shema A) stvara toksične nusproizvode koji su ponekad uzrokovali značajne bolesti, kao što je sindrom eozinofilije-mijalgije [101,103,104], dok su najsavremenije metode (slika 3, shema B) za sinteza melatonina iz ftalimida [105] izaziva značajnu sumnju u toksičnost nekoliko nusproizvoda koji nastaju [106]. Osim toga, Fischerove indolske reakcije iz alilamina (slika 3, shema C) predstavljaju opasne i toksične reaktante [107].

S druge strane, dobijanje melatonina iz neživotinjskih bioloških izvora predstavlja se kao snažna posvećenost budućnosti, ne da zamijeni sintetički melatonin, već da bude prirodniji komplementarni i alternativni izvor [108].

4. Strategije za dobijanje biološkog melatonina

Melatonin je prisutan u svim poznatim biološkim vrstama, od prokariota do eukariota, uključujući kvasce, alge, gljive i biljke, kao i životinje [80,109–111]. U nastavku su predstavljene metodologije razvijene u mikroorganizmima i biljkama kao mogućim izvorima prirodnog melatonina.

4.1. Melatonin iz mikroorganizama

a. Saccharomyces

Prvi pristup proizvodnji biološkog melatonina nedavno je napravila grupa danske farmaceutske kompanije Novo Nordisk koristeći genetski modificirani Saccharomyces cerevisiae (Tabela 1, proizvod #1). Germann i saradnici su konstruirali rekombinantni put melatonina u soju kvasca koji je sadržavao heterologne gene koji kodiraju nekoliko enzima biosinteze melatonina i puteve koji podržavaju kofaktore [112]. Transgeni kvasac je kodificirao različite gene Rattus norvegicus, Lactobacillus ruminis, Pseudomonas aeruginosa, Homo sapiens, Schistosoma mansoni, Bos Taurus i Salmonella enterica. Hranjenjem kvasaca samo glukozom i acetil Co-A, proizvodnja melatonina je dostigla 14,5 mg·L −1 za 76 h. Ipak, prema drugim autorima, neki problemi, kao što je visoka akumulacija N-acetilserotonina u stanicama kvasca, neuravnotežena ekspresija gena i identifikacija nekih potencijalno toksičnih intermedijera, moraju se riješiti [113].

b. Escherichia coli

U drugom pristupu, ovaj put koristeći transgenski modificiranu kulturu Escherichia coli (Tabela 1, proizvod #2), Novo Nordisk je izvijestio o biološkoj proizvodnji melatonina iz heterolognog soja konstruiranog od rekombinantne E. coli, uključujući nekoliko gena kao što je TDC gen iz Candidatus Koribacter versatile, SNAT gena iz Streptomyces griseofuscus i humanog ASMT gena. Dodatno, neki geni povezani s triptofanom su blokirani ili izbrisani kako bi se spriječila nepoželjna represija, degradacija i izvozni transport [96,97]. Nakon nekoliko poboljšanja soja i hranjenja mineralnim solima, vitaminima i antibioticima, kultivisane ćelije su proizvele melatonin od ~1 g·L −1 koristeći glukozu kao jedini izvor ugljika i do 2 g·L −1 u ćelijama hranjenim triptofanom, sa zanemarljivim nivoom nusproizvoda. Stoga, prema autorima, ovi GMO sojevi E. coli mogu biti osnova za buduću biološki komercijalnu proizvodnju melatonina korištenjem tvornica mikrobnih ćelija. Ipak, upotreba transgenih organizama za proizvodnju supstanci za ljudsku ishranu može biti problematična kada je cilj da se prirodni proizvod dovede do senzibiliziranog potrošača ili potrošača protiv GMO-a.

c. Bakterije mliječne kiseline

Melatonin se također industrijski proizvodi mikrobnom fermentacijom, kao što je objavljeno u [114]. Biosintezu melatonina upravljali su multi-soj bakterija mliječne kiseline, kao što je Lactobacillus sp. (L. brevis, acidophilus, bulgaricus, casei podvrsta. sake, fermentum, helveticus subspec. jogorti, plantarum); Bifidobacterium sp. (B. breve spp. breve, longum spp. infantis); Enterococcus sp. (E. faecalis TH10); i Streptococcus thermophilus. Quantum Nutrition Labs (Teksas, SAD) prodaje proizvode proizvedene prema ovoj tehnologiji kao Melatonin Drops, Qultured™, koji sadrže 8 mg melatonina kvasca (Tabela 1, proizvod #3).

d. Chlorella

Proizvod napravljen od algi je Herbatonin® (Tabela 1, proizvod #4), formuliran u tabletama koje sadrže 0.3 ili 3 mg fitomelatonina, iako se u Evropi prodaje u dozama od 0.3 i 1,9 mg, prema zakonima EU. Ova formulacija sadrži nekoliko biljnih vrsta kao što su pirinač (Oryza sativa L.) i lucerka (Medicago sativa L.), zajedno sa zelenom algom Chlorella pyrenoidosa i C. vulgaris. Naši podaci pokazuju da ove mikroalge nisu sadržavale više od 2–15 ng·g DW−1 [115], a prateće biljne vrste sadrže vrlo niske nivoe fitomelatonina, 1–5 ng·g−1 u pirinču i 16 ng·g −1 u lucerni [116]. Prisustvo Chlorella sugerira da se fitomelatonin uglavnom dobiva uzgojem zelenih algi u bioreaktorima, možda hranjenim prekursorima kao što je triptofan, na sličan način kao u Achillea millefolium [117], iako nema objavljenih podataka o metodi dobijanje ovih ekstrakata bogatih fitomelatoninom, samo njihova biohemijska karakterizacija [118]. Također nema podataka o kontroli prisustva cijanotoksina u ovim ekstraktima zbog moguće kontaminacije cijanobakterijama (plavo-zelenim algama). Ovi cijanotoksini imaju nekoliko neželjenih efekata vezanih za kancerogenost, hepatotoksičnost i neurotoksičnost, između ostalog. Dakle, otkrivanje cijanotoksina u nekim dodacima ishrani algi pojačava potrebu za boljom kontrolom kvaliteta [119,120].

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】