sažetak:Fitokemijsko ispitivanje sjemena egipatske mandarine (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) dalo je trinaest poznatih jedinjenja, 1–13. Strukture izolovanih jedinjenja su dodeljene korišćenjem 1D i 2D NMR i HRESIMS analiza. Da bi se okarakterisala farmakološka aktivnost ovih jedinjenja, primenjeno je nekoliko integrisanih eksperimenata zasnovanih na virtuelnom skriningu i simulaciji molekularne dinamike. Kao rezultat toga, spojevi 2, 3 i 5 su navodno identificirani kao inhibitori hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze. Naknadno in vitro testiranje je urađeno kako bi se potvrdili eksperimenti bazirani na silikonu kako bi se istaknuo potencijal ovih flavonoida kao obećavajućih inhibitora hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze sa vrijednostima IC50 u rasponu od 6,39 ± 0,36 do 73,7 ±3 ±2. . Ova studija bacila je svjetlo na potencijal otpadnih proizvoda egipatske mandarine (tj. njenih sjemenki) kao prirodnog agensa za promicanje zdravlja kože. Pored toga, otkrio je primenljivost integrisanog virtuelnog skrininga zasnovanog na inverznom pristajanju i eksperimenata zasnovanih na MDS-u u efikasnom predviđanju biološkog potencijala prirodnih proizvoda.

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju spermatozoida. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i sposobnost uklanjanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Prednosti tableta Cistanche

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Uvod

Mandarine, C. reticulata, su neke od najistaknutijih citrusnih kultura za svježu upotrebu [1]. Često se predstavljaju kao 'mandarine;' međutim, 'Mandarin' je popularnije ime. U prirodi je rasprostranjeno nekoliko hibrida i sorti mandarina [1]. Najpoznatije, sofisticirane vrste čine C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore i C. reticulata Blanco [1,2]. Mandarine su među glavnim agrumima koji se beru u mnogim zemljama. Iako se usevi uglavnom koriste za desert, oni imaju značajan komercijalni značaj zbog svojih eteričnih ulja [3]. Arome citrusa primjenjuju se u pićima, konditorskim proizvodima, kolačićima i desertima [4]. Također, kora C. reticulata se koristi i za arome likera [4].

Inverzno spajanje je vrsta virtuelne metode skrininga kojom se može manipulisati da bi se predvideli potencijalni molekularni ciljevi za datu strukturu jedinjenja. Prethodno smo koristili ovu efikasnu virtuelnu metodu skrininga da odredimo najbolje proteinske ciljeve za nekoliko izolovanih prirodnih proizvoda [5]. Međutim, rezultati pristajanja koji su rezultat ovog preliminarnog koraka skrininga pružaju samo neke informacije o strukturnoj komplementarnosti između ciljeva proteina i strukture spoja upita [6]. Shodno tome, eksperimenti simulacije molekularne dinamike (MDS), uključujući apsolutnu slobodnu energiju vezivanja (∆Gbinding) daju rigoroznije i pouzdanije rezultate koji se mogu odabrati za in vitro testiranje. Ovdje smo podvrgli sjemenke C. reticulata postupnoj hromatografskoj izolaciji kako bismo dobili neku ideju o glavnoj fitokemikalici u ovom otpadnom proizvodu. Nakon toga, istražili smo da li te fitokemikalije imaju određene farmakološke učinke podvrgavajući ih postupnoj analizi na bazi silikona koja je započeta sveobuhvatnim inverznim spajanjem i završila s nekoliko MDS eksperimenata. Potencijal bioaktivnih fitokemikalija dobijenih iz sjemena C. reticulata baca svjetlo na visok kapacitet otpadnih proizvoda jestivog voća kao ogromnog rezervoara za agense koji promovišu zdravlje.

2. Materijali i metode

2.1. Biljni materijal

Plodovi C. reticulata sakupljeni su u januaru 2021. iz lokalne regije u Beni-Suef, Egipat, a autentičnost ih je potvrdio viši botaničar, prof. dr. Abd El-Halim A. Mohammed Odsjek za istraživanje flore i fitotaksonomije; Institut za istraživanje hortikulture; Dokki; Cairo; Egipat). Uzorak plodova čuvan je pod brojem vaučera 2021-BuPD 80 na odjelu farmakognozije; Farmaceutski fakultet; Univerzitet Beni-Suef; Egipat).

2.2. Hemikalije i reagensi

Etil acetat (EtOAc), metanol (MeOH), n-heksan (n-Hex), etanol (EtOH), dihlorometan (DCM) i n-butanol (n-BuOH) nabavljeni su od kompanije El-Nasr, Egipat. Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, SAD, obezbijedila je deuterirane rastvarače za NMR analizu, kao i rastvarače visoke čistoće za HPLC, spektroskopske i hromatografske analize (npr. metanol-d4 (CD3OD), dimetil sulfoksid-d6 (DMSO), hloroform -d (CDCl3), metanol za HPLC, voda za HPLC i acetonitril za HPLC). Za hromatografsku izolaciju, Sephadex LH20 (0.25–0,1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; Kalifornija, SAD) i silika gel (E-Merck, Sigma-Aldrich, Kalifornija, SAD) su korišteni. Za vakuumsku tečnu hromatografiju korišćen je silika gel za TLC (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Kairo, Egipat) (VLC). Prethodno obloženi silika gel (E-Merck, Darmstadt, Njemačka) korišten je za TLC studije. Proizvedene mrlje su identificirane para anisaldehidom nakon zagrijavanja na 110 ◦C [7]. Svi materijali za biološka ispitivanja došli su od Sigma Chemical Company (SCC; CA, SAD).

2.3. Spektralne analize

NMR signali su dobijeni na 400 za 1H-NMR i 100 MHz za 13C-NMR. CDCl3-d, CD3OD-d4 i DMSO-d6 pikovi rastvarača korišteni su kao referentni signali. NMR signal je dobijen pomoću NMR mašine Bruker Advance-III 400 MHz (Bruker AG-Billerica, Kalifornija, MA, SAD).

Maseni podaci visoke rezolucije prikupljeni su korištenjem Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography-mašine povezane sa kvadrupolnim hibridnim masenim spektrometrom vremena leta (Waters, Milford, MA, SAD). Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC je korišten za postizanje HPLC hromatografskog razdvajanja.

2.4. Priprema ekstrakta sjemena C. reticulata

Sjeme C. reticulata (1 kilogram) kupljeno je svježe, a zatim osušeno na zraku u hladu. Nakon toga, sjeme je naribano na mašini za mljevenje (Henan, kontinentalna Kina). Praškasti proizvod je zatim temeljito ekstrahiran sa 70 posto EtOH (1 L × 5). Dobijeni tečni ekstrakt je koncentrisan korišćenjem rotacionog isparivača (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA) pod vakuumom na 45 ◦C da se dobije 100 g sirovog suhog ekstrakta, koji je zatim podijeljen korištenjem serije rastvarača sve većeg polariteta: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Frakcije I (24.0 g), II (5,0 g), III (3,0 g) i IV (6,0 g) su dobijene uparavanjem izdvojene organske faze pod sniženim pritiskom. Svi ekstrakti i frakcije su pohranjeni na 4 ◦C za naknadnu fitokemijsku i biohemijsku analizu.

2.5. Izolacija glavnih prirodnih proizvoda sjemena C. reticulata 

Kolona TLC-silika gela je korištena za izlaganje frakcije I (20 g) normalnom VLC. Korišteno je uzastopno eluiranje EtOAc i n-Hex (0–100 posto, povećanje od 5 posto). Tri podfrakcije (I1–I3) su dobivene sakupljanjem identičnih frakcija i njihovim isparavanjem pod sniženim tlakom. Na drugoj koloni silika gela, subfrakcija I1 (1,0 g) je ekstenzivno frakcionisana. Hromatografsko eluiranje je izvedeno pomoću n-Hex-a u EtOAc, gradijentne mješavine (0-10 posto, 1 posto rastuće, po 100 mL) da bi se dobilo jedinjenje 13. (10 mg).

Podfrakcija I2 (50 mg) je dalje hromatografisana na silika-gelu-60 (100 × 1 cm, 20 g). Kromatografska procedura je urađena korištenjem DCM:MeOH, izokratske smjese (0,5 posto, 500 mL) da bi se dobila jedinjenja 8 (20 mg) i 9 (15 mg). Podfrakcija I3 je donekle frakcionisana na silika gelu 60 (100 × 1 cm, 20 g). Eluacija je proizvedena upotrebom DCM: MeOH, izokratska smjesa (0,5 posto, 500 mL) da se dobije 10 (20 mg).

Za izlaganje frakcije II (2,5 g) korištena je TLC kolona silikagela. DCM: EtOAc (0–100 posto, porast za 5 posto) je korišten za eluiranje uzoraka. Proizvedeni efluenti su primljeni u dijelovima od 250 mL. Dobivene su identične frakcije i reducirane na dvije podfrakcije (II1–II2) pod sniženim tlakom. Na drugoj koloni silika gela, subfrakcija I1 (1,0 g) je ekstenzivno frakcionisana. Jedinjenje 5 je eluirano korištenjem DCM: EtOAc (0-10 posto, 1 posto u porastu, po 100 mL) (10 mg).

Podfrakcija I2 (50 mg) je dalje hromatografisana na silika gelu60 (100 × 1 cm, 20 g). Kromatografsko eluiranje je primijenjeno korištenjem DCM u MeOH (izokratsko eluiranje; 0,5 posto, 500 mL) da bi se dobila jedinjenja 11 (20 mg) i 12 (15 mg).

Na normalnom VLC, frakcija IV (60 g) je odvojena silika gelom. DCM: EtOAc (0–100 posto, 5 posto rastućih, po 250 mL) je korišten za eluiranje uzoraka. Kromatografski efluenti su primani u koracima od 250 mL.

Identične frakcije su grupisane i redukovane pod sniženim pritiskom da bi se dobilo pet podfrakcija (IV1–V5); podfrakcije IV1, IV2, IV3 i IV4 samo su blago kromatografirane na koloni Sephadex-LH20 eluirane sa MeOH da bi se dobilo 4 (30 mg), 6 (50 mg), 7 (70 mg) i 1 (15 mg, respektivno, dok je podfrakcija IV5 bila značajno čista (10 mg).

2.6. In Silico Study

2.6.1. Inverse Docking

Vjerovatne molekularne mete za razdvojene flavonoide zaključene su podvrgavanjem njihovih struktura virtuelnom skriningu u zavisnosti od inverznog spajanja sa skoro svim proteinima koji su predati u Protein-Data-Bank; PDB.

Za ovaj korak korištena je IdTarget online platforma. Ovaj program skrininga male virtuelne strukture koristi posebnu inverznu metodu spajanja, odnosno DivideConquer-Docking, koja konstruiše ograničene mreže koje se preklapaju, čineći istraživanje proteina ograničenijim. Kao rezultat toga, može izvršiti veliki broj pristajanja u kratkom vremenu [8]. Dobijeni rezultati su opisani kao lista ocjena u rasponu od najgorih do najboljih. Da bismo identificirali optimalne ciljeve proteina za svaku datu strukturu, koristili smo skor afiniteta od -10 kcal/mol kao graničnu vrijednost (Tabela 1).

Eksperimenti simulacije molekularne dinamike (MDS) izvedeni su kao što su ranije izvijestili Alhadrami et al. 2021. [6]. MDS mašina softvera Maestro (tj. Desmond v. 2.2; Hamburg, Njemačka) korištena je za rad MDS eksperimenata [9–11]. OPLS-Force-Field je korišten za simulacije.

Priprema proteinskih struktura izvedena je pomoću System-Builder algoritma, u kojem su spakovane u ortorombičnu kutiju za vodu (20 Å3) koristeći TIP3P model vode zajedno sa Na plus i Cl− jonima, {{ 16}}.15 M za svaku od njih. Zatim su optimizirane modelirane strukture podvrgnute preliminarnoj ekvilibraciji u trajanju od 10 ns. Strukture liganda su automatski parametrizovane tokom koraka pripreme strukture prema OPLSForce-Field. Proteini koji sadrže metal, kao što su MMP, koji uključuju kompleks histidin-Zn plus 2 na efektivnom mjestu, trebaju biti parametrizirani tokom koraka formiranja proteina. Da nastavimo, potrebno je postaviti hetero stanje za hetero atome kao što je Zn (generiraj hetero stanja). Ova funkcija je dio maestrovog čarobnjaka za formiranje proteina. Ovaj korak će olakšati razvoj odgovarajućeg hetero stanja ili koordinatnog kovalentnog stanja, za heteroatom (tj. Zn plus 2) u mreži sa proteinom, tako da polja sila poput OPLS-a mogu brzo posmatrati atom cinka. Za reprodukcije urađene softverom Nano-scale Molecular Dynamics (NAMD 3.0) [12], topologije i parametri modeliranih struktura određivani su putem online platforme Ligand Reader and Modeler. Harmonične Tcl sile su upotrijebljene da drže Zn plus 2 na mjestu.

Proračun slobodne energije vezivanja (∆Gbinding) izveden je kako su prethodno opisali Alhadrami et al. 2021. [6]. ∆Mljevenje je izvedeno postupkom perturbacije slobodne energije (FEP) [12], što je detaljno opisano u publikaciji Kim et al. Ukratko, ova tehnika izračunava potrebnu dostupnu energiju ∆Gvezivanje pomoću jednačine ∆Gvezivanje=∆GComplex − ∆GLigand. Vrijednost svakog ∆brušenja izračunava se pomoću programa NAMD u zasebnim eksperimentima.

Sve ulazne datoteke mogu se pripremiti putem web stranice CharmmGUI. Datoteke su zatim korištene za proizvodnju planiranih ∆Gbinding kalkulacija korištenjem FEP protokola u NAMD-u. Ravnoteža je kasnije postavljena u NPT (300 K, 1 atm, Langevin-klip-pritisak "kompleks"-"ligand") u postojanju TIP3P modela vode. Kasnije su napravljene 10 ns FEP simulacije za svaku strukturu, a posljednjih 5 ns raspoloživih količina energije izračunato je za gotove stope slobodne energije [12]. Konačno, poze za vezivanje su predviđene i procijenjene primjenom VMD programa [13].

2.7. In vitro analiza aktivnosti hijaluronidaze

Inhibicijska aktivnost hijaluronidaze formirana je prema ranije utvrđenoj proceduri odobrenoj Chaiyana et al. 2019. [14]. Inhibicijski efekat na aktivnost hijaluronidaze procijenjen je iz sljedeće jednačine: inhibicija hijaluronidaze ( posto )=(1 − A/B) × 100, gdje su A i B karakter hijaluronske kiseline nakon tretmana u postojanju ili nedostatku uzorak, posebno. Kao pozitivna kontrola primijenjena je 6-O-palmitoil-laskorbinska kiselina. Eksperiment je izveden u tri primjerka.

2.8. In vitro analiza aktivnosti ksantin oksidaze

Inhibicijski potencijal ksantin oksidaze (XO) izveden je prema prethodno opisanoj metodi [15]. Boja nastala usled oslobađanja vodonik peroksida tokom procesa oksidacije XO izmerena je na 570 nm pomoću čitača ploča EPOCH™ „MICROPLATE READER (BIOTEK)“. Četrdeset četiri mikrolitra pufera ksantin oksidaze pomešano je sa 2 µL rastvora supstrata ksantina i 2 µL XO. L-mimozin je primijenjen kao pozitivna kontrola. Ovaj eksperiment je izveden u tri primjerka.

2.9. In vitro analiza aktivnosti tirozinaze

Aktivnost inhibicije tirozinaze svakog flavonoida je uočena korištenjem DOPAhrom procesa u skladu sa shemom Momtaz et al. 2008 [16], koji je modificiran od Nerya et al. 2003. [17], i Curto et al. 1999. [18]. Inhibicijska aktivnost tirozinaze izmjerena je iz sljedeće jednačine: inhibitorna aktivnost ( posto )=(1 − A/B) × 100, (9) gdje su A i B apsorbancije smjese u prisustvu ili odsustvu testirati flavonoide, respektivno. Svaki eksperiment je izveden u tri primjerka.

3. Rezultati i diskusija

3.1. Fitokemijsko ispitivanje sjemena C. reticulata

Koristeći UV, 1H i DEPT-Q NMR, pored poređenja sa literaturom i korišćenjem nekih autentičnih uzoraka, poznata su jedinjenja kaempferol 1 [19], kaempferol-40 -O- -Dglukopiranozid 2 [19], kaempferol -7-O- -D-glukopiranozid 3 [19], 2-hidroksi genistein 4 [19], hesperetin 5 [19], 3000 (1000-O- - D-glukopiranozil)-saharoza 6 [20], 6(1000 -O- -Dfruktofuranozija)-30 (1"-O- -D-glukopiranozil)-saharoza 7 [20 ], 1-O-elaidoil-glicerol 8 [21], 1- O-oleoil-2-palmitoil-glicerol 9 [22], 1-O-oleoil-glicerol 10 [ 21], (E)-3-((4-metil heptil oksi) karbonil)akrilna kiselina 11 [23], (E)-3-((6-metil nonil oksi) karbonil)akrilna kiselina 12 [23] i -sitosterol 13 [24] (Slika 1) identifikovani su iz sirovog etanolnog ekstrakta semena C. reticulata Sva identifikovana jedinjenja 11 i 12 su ovde po prvi put izdvojena iz roda Citrus ( Slike 1 i S1–S28).Vrijedi napomenuti da, za razliku od široko rasprostranjenih flavanona i flavona u nadzemnim dijelovima C. reticulata, uključujući i plodove, čini se da su flavonoli dominantna vrsta flavonoida u sjemenkama.

3.2. In Silico Investigation

Da bismo okarakterisali biološko djelovanje izolovanih spojeva, podvrgli smo ih nizu analiza na bazi silikona. Prvo smo se fokusirali na izolovane flavonoide (1-5) za naš početni korak virtuelnog skrininga jer su flavonoidi dobro poznati bioaktivni sekundarni metaboliti biljaka. Dodatno, preostala izolirana jedinjenja (6-13) su uobičajeni primarni metaboliti koji vjerovatno nemaju terapijsku efikasnost.

Strukture flavonoida 1-5 su podvrgnute virtuelnom skriningu zasnovanom na pristajanju u odnosu na skoro sve proteine ​​koji se nalaze u PDB. Za ovaj preliminarni virtuelni skrining zadatak korištena je online platforma, odnosno idTarget [8]. Oporavljeni rezultati su preuzeti kao lista od najveće negativne vrijednosti do najmanje. Postavili smo konačan rezultat afiniteta od -10 kcal/mol kao graničnu vrijednost da bismo izdvojili dobre ciljeve za svaki izolirani flavonoid (1-5). Utvrđeno je da su nekoliko zanimljivih molekularnih meta vjerovatno dobre mete za ova srodna jedinjenja, uključujući protein kinaze i sintaze (Tabela 1).

Zanimljivo je da su tri zajedničke molekularne mete prijavljene između ovih enzima flavonoida, hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze. Ovi enzimi su povezani sa održavanjem zdrave kože [25–30], i stoga je preliminarni korak virtuelnog skrininga navodno identifikovao ove flavonoide kao verovatne agense za njegu kože.

3.3. Simulacija molekularne dinamike i izračunavanje slobodne energije apsolutnog vezivanja

Kako bismo dodatno podržali preliminarni korak skrininga zasnovanog na pristajanju, procijenili smo apsolutnu slobodnu energiju vezivanja (∆Gvezivanje) jedinjenja 1-5 sa enzimima hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze koristeći metodu zavisnu od MDS, odnosno metodu perturbacije slobodne energije ( FEP) [26,31].

Kao što je prikazano u Tabeli 2, samo jedinjenja 2, 3 i 5 su mogla postići najveći afinitet prema enzimima hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze sa vrijednostima ∆ mljevenja u rasponu od -8,1 do -9,9 kcal/mol. Preostala jedinjenja imaju ∆Gvezujuće vrijednosti veće od −6 kcal/mol.

Daljnji 50 ns MDS eksperimenti su izvedeni kako bi se istražile interakcije i stabilnost vezivanja spojeva 2, 3 i 5 sa enzimima hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze. Kao što je prikazano na slici 2, i jedinjenje 3 i kokristalizovani ligand postigli su sličnu stabilnost vezivanja unutar vezivnog mesta enzima u celom MDS-u sa RMSD od ~2,8 Å od inicijalnih pristajanja. RMSD jedinjenja 2 0 je takođe bio sličan onom jedinjenja 3 do 28,7 ns kada počinje da odstupa malo više od jedinjenja 3 i kokristalizovanog liganda da bi se postigao prosečan RMSD od 3,8 Å u celom MDS-u. Posljednji snimak izveden iz MDS-a jedinjenja 2, i 3 i kokristaliziranog liganda ukazuje da su TYR-75, ASP-129 i GLU-131 uobičajeni aminokiselinski ostaci u interakciji putem H- vezivanje.

Što se tiče ksantin oksidaze, jedinjenje 3 je postiglo stabilno vezivanje unutar svog aktivnog mesta kroz MDS, beležeći prosečni RMSD od 2,6 Å koji je bio konvergentan onom kokristalizovanog inhibitora (RMSD ~2,4 Å). Ovako stabilno vezivanje jedinjenja 3 očigledno je posledica mreže H-veza koju je uspostavio sa LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 i THR-1010 (slika 3).

Konačno, jedinjenje 5 je takođe bilo stabilno unutar aktivnog mesta tirozinaze tokom 50 ns MDS sa prosečnom RMSD vrednošću od 4,9 Å, što je više od one kod kokristalizovanog inhibitora (RMSD ~3,8 Å). Kao što je prikazano na posljednjem snimku izvedenom iz MDS-a, jedinjenje 5 moglo je da stupi u interakciju sa dva Zn2 plus jona slično kokristaliziranom inhibitoru. Osim toga, stabiliziran je s nekoliko H-veza sa LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 i THR-391 (Slika 4 ).

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】