Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

LP Arantes1, ML Machado1, DC Zamberlan1, TL da Silveira1, TC da Silva1, IBM da Cruz1, EE Ribeiro2, M. Aschner3 i FAA Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brazil

3Odsjek za molekularnu farmakologiju, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, SAD

Cistanche ima efekat protiv starenja

Abstract

Guaranu (Paullinia cupana) ljudi u amazonskoj regiji obično jedu i ključni je sastojak raznih energetskih napitaka koji se konzumiraju širom svijeta. Produženje dugovječnosti i niska prevalencija kroničnih bolesti povezanih sa starenjem povezani su s uobičajenim unosom guarane.Anti-agingpotencijal guarane je također pokazan kod Caenorhabditis elegans; međutim, mehanizmi uključeni u njegove efekte nisu jasni. Ovdje smo istražili navodne puteve koji regulišu efekte etanolnog ekstrakta guarane (GEE) na životni vijek koristeći C. elegans. Glavni poznati putevi dugovječnosti analizirani su kroz mutantne crve i RT-qPCR test (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF{{6 }}). Ispitivana je i moguća uključenost purinergičke signalizacije. Ova studija je pokazala da GEE djeluje krozantioksidansaktivnost, DAF-16, HSF-1 i SKN-1 putevi i ortolog humanog adenozinskog receptora (ADOR-1) za produženje životnog vijeka. GEE je također smanjio skn-1, daf-16, sir-2.1 i hsp-16.2 kod 9-dnevnih C. elegans, što bi moglo odraziti manje potrebe za aktiviranjem ovih zaštitnih gena zbog direktnogantioksidansefekti. Naši rezultati doprinose razumijevanju efekata guarane in vivo, što bi moglo biti od pomoći u prevenciji ili liječenju poremećaja povezanih sa starenjem, a također sugeriraju purinergičku signalizaciju kao vjerojatan terapeutski cilj za studije dugovječnosti.

Ključne riječi: starenje; Antioksidans; Guarana; Životni vijek; Prirodni proizvodi; Xanthines

Uvod

Paullinia cupana, poznata i kao guarana, izvorna je biljka u basenu Amazone i posebno je česta u Brazilu. Prašak njegovih sjemenki obično jedu ljudi svih uzrasta u regiji Amazone uglavnom zbog svojih tonik i stimulativnih svojstava (1). Štaviše, guarana je ključni sastojak raznih energetskih napitaka koji se konzumiraju u mnogim zemljama (2). Ostali prijavljeni farmakološki efekti guarane uključuju gubitak težine, smanjenje sinteze trombocita tromboksana, zaštitu od želučanih lezija, antioksidativno djelovanje i antiinflamatorne efekte [za pregled vidjeti: (1)]. Međutim, kada se konzumira u prekomjernoj količini, guarana također može negativno utjecati na ljudsko zdravlje, uzrokujući anksioznost, poremećaj sna i tahikardiju, na primjer, zbog visokog sadržaja kofeina (2,3).

Produženje dugovječnosti kod ljudi koji žive u Mauésu, regiji Amazone u Brazilu, povezano je s amazonskom prehranom, uključujući uobičajeni unos guarane (4). Nadalje, epidemiološka studija povezala je gutanje guarane s niskom prevalencijom kroničnih bolesti povezanih sa starenjem u populaciji Amazonije (5). Nedavno je studija takođe pokazalaprotiv starenjapotencijal ekstrakta sjemena guarane u Caenorhabditis elegans (6). Međutim, mehanizmi koji leže u osnovi efekta guarane na starenje nisu identificirani.

C. elegans je bio prikladan model za razumijevanje odgovora organizma na različite sintetičke i prirodne spojeve i njihov utjecaj na starenje i životni vijek. Vitalni biološki putevi i brojni aspekti starenja analogni su kod nematoda i sisara, uključujući ljude (7).

Budući da postotak starijih ljudi širom svijeta raste uz povećanu učestalost bolesti povezanih sa starenjem, bitno je identificirati efikasne terapije i terapijske ciljeve koji bi mogli poboljšati kvalitetu života (8). Ovdje smo istraživali navodne puteve koji reguliraju efekte guarane na životni vijek koristeći C. elegans.

Materijal i metode

Hemikalije

Agar, etanol (96 posto), hloroform, holesterol, FUDR (5-fluoro-20-deoksiuridin), inhibitor proteaze, kokteli inhibitora fosfataze, prajmeri lančane reakcije polimeraze (PCR) i albumin goveđeg seruma (BSA) kupljeni su od Sigme (SAD). TaqMans prajmeri koji se koriste za qRT-PCR analizu i Trizol su kupljeni od Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (SAD). Svi ostali reagensi su kupljeni od Synth-a (Brazil).

Naprezanja i održavanje

Sojevi korišteni u ovoj studiji su Bristol N2 (divlji tip); CB1370, daf{3}} (e1370) III; CF1038, daf-16 (mu86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); i VC199, sir-2.1(ok434), dobijen od Caenorhabditis Genetics Centra (CGC), Univerziteta Minnesota, SAD, kao i Escherichia coli OP50. EG6890 soj, ador-1 (ox489), ljubazno je isporučen iz laboratorije dr. Erik Jorgensen (Univerzitet Utah, SAD). Ovaj soj ima deleciju od 1 kb uzvodno i prva tri egzona ador-1 gena, i ukrštan je 6 puta; ador-1 gen kodira ortolog humanog adenozinskog receptora (9).

Nematode su održavane i analizirane na 20 stepeni na agar pločama sa podlogom za rast nematoda (NGM) koje su nosile travnjak E. coli OP50 (10). Sinhronizacija kultura nematoda postignuta je tretmanom izbjeljivanja gravidnih hermafrodita, a jaja su ostavljena da se izlegu preko noći u M9 puferu (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl i 1 mM MgSO4) (10).

Priprema biljnog materijala i ekstrakta

Prašak prženih sjemenki Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), guarana, izolirana je i isporučena od strane EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) koja se nalazi u zapadnom Amazonu u Mauésu, Amazonas, Brazil. Vodoalkoholni ekstrakt je dobijen kako je opisano na drugom mjestu (11). Ukratko, ekstrakt je proizveden korištenjem 70 posto etanola. Nakon 24 h, dobijena otopina je filtrirana, etanol je uklonjen, a ekstrakt je liofiliziran. Preovlađujući ksantini i katehini prisutni u ekstraktu guarane analizirani su pomoću HPLC, pokazujući sljedeće koncentracije: kofein=12.240 mg/g, teobromin=6.733 mg/g i ukupni katehini{{ 9}}.336 mg/g (11).

Liječenje crva

NGM ploče koje nose travnjak E. coli OP50 (kao izvor hrane) su prethodno inkubirane na 37 stepeni preko noći. Liofilizirani etanolni ekstrakt guarane (GEE) otopljen je u hladnoj destilovanoj autoklaviranoj vodi (121 stepen, 30 min) i raširen po pločama u konačnim koncentracijama od 100, 500 i 1,{8}} mg/mL agara. Sinhronizovane L1 larve (10) prenete su pipetom na površinu ploča za tretman i kultivisane do odrasle dobi na 20 stepeni.

Životni vijek

Analize životnog vijeka počele su na L4 larvi u NGM pločama zasijanim sa E. coli OP50 u odsustvu ili prisustvu GEE (dan 0). Životinje su prebačene u svježe tanjire sa ili bez GEE svaki drugi dan kako bi se izbjeglo miješanje generacija, i bodovane u isto vrijeme do smrti. Odsustvo odgovora na mehanički stimulus je ocijenjeno kao smrt. Crvi su bili cenzurirani ako su puzali sa ploče, pokazivali ekstrudirane unutrašnje organe ili umirali zbog izleganja potomstva unutar materice. Testovi životnog veka su ponovljeni tri puta sa 60-120 crva po testu. Putem mutantnih sojeva, analizirani su glavni poznati putevi dugovječnosti (12,13): i) daf-2 i daf-16, insulinu/inzulinu sličan faktor rasta (IGF){{11} } signalizacija (IIS), koju DAF-2 receptor signalizira kroz očuvani put PI3-kinaze/ AKT i naniže reguliše DAF-16/FOXO, odgovornu za promociju ekspresije gena koji daju produženi vijek trajanja i povećanu otpornost na stres; ii) skn-1, koji je povezan sa proteinima porodice Nrf kičmenjaka i potiče ekspresiju enzima za detoksikaciju kao odgovor na oksidativni stres, poput glutation-S-transferaze; iii) sir-2.1, koji kodira protein sličan histon deacetilazi, koji integriše metabolički status sa životnim vekom, a povezan je sa ograničenjem kalorija; i iv) hsf-1, koji kodira faktor transkripcije toplotnog šoka-1 (HSF-1) i inducira aktivaciju različitih gena ili pratilaca toplotnog šoka koji su uključeni u održavanje konformacijske homeostaze proteini između ostalih važnih funkcija. Moguća veza između dugovječnosti i purinergičke signalizacije je također istražena putem ador{31}} mutantnog soja.

Kako bakterije igraju ulogu u smrtnosti od C. elegans, rast E.coli OP50 je procijenjen u prisustvu ili odsustvu GEE kako bi se istražilo da li bi korisni efekti mogli biti odgovor na antimikrobna svojstva. Apsorbancija bakterija je mjerena tokom 12-h perioda u tečnom mediju (14).

Zdravstveni raspon

Procijenjeni su parametri ponašanja koji se odnose na zdravstveni raspon (15). Faringealno pumpanje je procijenjeno mikroskopom Nikon E200 posmatranjem broja faringealnih kontrakcija tokom intervala 60- kod mladih odraslih osoba divljeg tipa.

Thrash frekvencija je odabrana za analizu lokomo- cije. Mlade odrasle osobe divljeg tipa iz kontrolnih ili GEE tretmana su pojedinačno odabrane i stavljene u kap M9. Crvima je ostavljeno da se prilagode 1 min, a zatim je broj udaranja kvantificiran mikroskopom Nikon E200 tokom intervala 20- s. Thrash je definiran kao promjena smjera savijanja na sredini tijela.

Analize su obavljene u tri nezavisna ispitivanja. Ispitivano je 30 nematoda po grupi.

Izolacija RNK i lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (RT-qPCR)

Crvi divljeg tipa kod 9-dan odraslih crva analizirani su na ekspresiju gena koja se odnosi na dugovječnost i reakcije na oksidativni stres. Nakon odraslog doba, crvi su prenosili svaki drugi dan na ploče koje su sadržavale 150 mM FUDR (5-fluoro-20-deoksiuridin) kako bi se inhibirala reprodukcija, u prisustvu ili odsustvu GEE. RNK od 20,000 crva po stanju je izolovana korišćenjem Trizola praćena ekstrakcijom hloroformom, kao što je prethodno opisano (16) i 1 mg ulazne RNK je reverzno transkribovan u cDNK pomoću kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta Applied Biosystems (Applied Biosystems , SAD). Analiza ekspresije je izvršena Custom TaqMans Array analizom korištenjem odgovarajućih testova ekspresije TaqMans gena za mitohondrijalnu superoksid dismutazu sod-3 (Ce02404515_g1), glutation-S-transferazu gst-4 (Ce{ {16}}g1), gama glutamilcistein sintetaza gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), sir-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), protein toplotnog šoka hsp-16.2 (Ce02506738_s1) i skn{ {35}} (Ce02407445_g1) (primijenjeni biosistemi). Ekspresija ciljnog gena je normalizovana na vrednosti ekspresije aktina afd-1 (Ce02414 573_m1). Relativna ekspresija svakog gena određena je 2 DDCt metodom (17) i podaci su prikazani kao kratka promjena nivoa mRNA u odnosu na afd-1. Ovaj eksperiment je izveden u tri nezavisna preparata crva, svaki u tri primerka.

Statistička analiza

Statističke analize su obavljene korišćenjem GraphPad Prism verzije 5 za Windows (GraphPad Software, SAD). Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ±SD za najmanje tri pojedinačna eksperimenta. Studentov t-test je korišten za poređenje parova grupa, dok je jednosmjerna ili dvosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim post hoc testom korištena za poređenje tri ili više grupa. Sve krive preživljavanja analizirane su log-rank (Mantel-Cox) testom. Statistička značajnost je određena kao Po0.05.

Rezultati

U našem istraživanju, kontrolna divlja vrsta C. elegans imala je prosječni životni vijek od 11 dana i maksimalan životni vijek od 14 dana. U medijima koji sadrže GEE, srednji životni vijek divljeg tipa crva je produžen na 13 dana pri 100 mg/mL (18 posto) i na 15 dana pri 500 i 1,000 mg/mL (36 posto). Maksimalni životni vijek produžen je u prosjeku za 28 posto pri tri testirane koncentracije (tabela 1). Nije bilo razlike u rastu E. coli u prisustvu ili odsustvu 1,000 mg/mL GEE (podaci nisu prikazani).

Zdravstveni vijek crva je također produžen nakon GEE tretmana. Ekstrakt je odgodio opadanje faringealnog pumpanja (100, 500 i 1,000 mg/mL) i trzanja (1,000 mg/mL) zbog starosti, počevši od 9. dana odraslog doba ( Slika 1 A i B). Shodno tome, za dalju analizu odabrana je koncentracija od 1,000 mg/mL GEE i uzorci 9-dan odraslih crva.

Ekstrakt GEE (1,000 mg/mL) produžava srednji životni vijek mev-1 mutanata za 44 posto i maksimalni životni vijek za 77,8 posto (tabela 1), pokazujući vezu izmeđuantioksidans

Testovi životnog vijeka su izvedeni na 20 stepenu. Maksimalni životni vek je predstavljen kao srednji životni vek 10 posto populacije crva sa najdužim životom. Svaki eksperiment je ponovljen tri puta počevši od najmanje 60 nematoda po grupi. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost±SD. *Po0,05 u poređenju sa netretiranom grupom (Mantel-Cox log-rank test).

Slika 1. Učinci etanolnog ekstrakta guarane (GEE) na parametre ponašanja koji se odnose na zdravlje. Brzina faringealnog pumpanja (A) i

učestalost udaranja (B) tokom starenja kod divljih crva. Podaci se izvještavaju kao srednja vrijednost ±SD (n=30 crva po grupi). *P o0.05 u poređenju sa kontrolom (jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom višestrukog poređenja.

iprotiv starenjaaktivnosti. Ekstrakt je također produžio srednji životni vijek mutanata daf-2 i sir 2.1, čime je utvrđeno da ekstrakt nije djelovao kroz ove puteve kako bi promovirao produženje životnog vijeka. Nasuprot tome, tretman nije produžio životni vijek mutanata daf-16, skn-1, hsf-1 i ador-1 (Tabela 1).

PCR analize su procijenile modulaciju gena pomoću GEE (Tabela 2). GEE na 1,000 mg/mL dolje regulirani skn-1, daf-16, sir-2.1 i hsp-16.2 u {{9 }}dnevne odrasle osobe. Nije uočen nikakav efekat na izraze hsf-1, gst-4, gcs-1 i sod-3.

Diskusija

Kao što je prethodno pokazano (1), u našoj studiji, ekstrakt guarane je također produžio životni vijek i zdravstveni vijek divljeg tipa C. elegans. Dakle, pretpostavljeni putevi koji bi mogli biti upleteni u toprotiv starenjaistraženi su efekti. ovdje,protiv starenjaefekti su se pokazali pri višoj koncentraciji ekstrakta (1,000 naspram 300 mg/mL kao što je prethodno pokazano). Ovo neslaganje može biti posljedica razlika u pripremi ekstrakta (hidroalkoholni naspram vodenog ekstrakta)

Tabela 2. Ekspresija mRNK gena s naglom promjenom koja se odnosi na dugovječnost i oksidativni stres kod divljeg tipa 9-dnevnih odraslih crva tretiranih etanolnim ekstraktom guarane (GEE)

Ovaj eksperiment je procijenjen RT-qPCR i izveden u tri nezavisna preparata crva, svaki u tri primjerka. Podaci se izvještavaju kao sredstva za promjenu nivoa mRNA u odnosu na afd-1 (aktin) ±SD. *Po0.05 u poređenju sa neliječenim (dvosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom višestrukog poređenja).

i način isporuke (agar naspram tečnog medijuma) i može biti rezultat prirodnog odstupanja u genetskim varijacijama u populaciji crva (18,19).

Čini se da je oksidativni stres glavni faktor koji ograničava životni vijek i C. elegans i ljudi i povezan je s mnogim bolestima povezanim sa starenjem (20,21), što usmjerava pažnju naantioksidansjedinjenja sa efektima in vivo. Da dalje istražimo može li GEE produžiti životni vijekantioksidansaktivnost, procijenjen je njegov uticaj na mev{0}} crve. Ovaj soj karakterizira hiperprodukcija superoksida i ima kraći životni vijek u poređenju sa sojem divljeg tipa (22). U skladu sa prethodno opisanimantioksidansefekti ekstrakta guarane (6), GEE tretman je značajno produžio srednji i maksimalni životni vijek mev{1}} crva.

Osim toga, DAF-16, HSF-1 i SKN-1 putevi, uključeni u inzulinsku/IGF signalizaciju (IIS), činili su se neophodnim za produženje životnog vijeka posredovano GEE. Smanjeni IIS je povezan sa dugovječnošću i adaptacijom na nepovoljne uslove okoline kod C. elegans, Drosophila, sisara, a možda i ljudi (13). HSF-1 funkcioniše u saradnji sa DAF-16 kako bi aktivirao ekspresiju uobičajenih ciljnih gena, uključujući porodicu sHsp (mali geni proteina toplotnog šoka) (23). SKN-1/Nrf integriše IIS i reguliše odgovor na oksidativni stres i ekspresiju gena za detoksikaciju (24).

DAF-16, HSF-1 i SKN-1 također mogu posredovati u produženju zdravstvenog vijeka i homeostazi proteina (25). DAF-16 je uključen u formiranje manje toksičnih proteinskih agregata visoke molekularne težine (26), i iako HSF-1 reguliše aktivnost dezagregacije proteina oslobađajući male toksične agregate, može imati povoljan efekat doprinoseći klirens proteina putem enzimskog metabolizma (27,28). SKN-1 je najpoznatiji kao regulatorantioksidansi ksenobiotičku odbranu, ali je također uključen u dodatne funkcije koje uključuju proteostazu i metaboličku regulaciju (24).

Metilksantini, kao kofein, su glavne komponente guarane i dobro je poznato da ova jedinjenja mogu djelovati preko adenozinskih receptora kod sisara (29). Kofein je povezan sa korisnim efektima, uključujući efekte vezane za starenje (30,31) i poboljšanje fenotipova kognitivnih oštećenja antagoniziranjem adenozinskih receptora A1 i A2A kod glodara (32). Stoga smo testirali da li GEE-indukovano produženje životnog vijeka može zavisiti i od ADOR-1, homologa adenozinskog receptora (33). Naši rezultati su pokazali da ador-1(ox489) crvi nisu pokazali produženi životni vijek, pokazujući, po prvi put, moguću ulogu purinergičkog sistema u produženju životnog vijeka. Shodno tome, purinergička signalizacija bi se mogla isplativo proučavati u budućnosti kao potencijalna meta za modulaciju dugovječnosti.

Iako GEE ima visok nivo kofeina, a prethodne studije su opisale efekte kofeina na crve (34-36),protiv starenjaefekti GEE mogu biti povezani sa sinergijskim efektima različitih jedinjenja. Koncentracija kofeina u ekstraktu je mnogo niža od efektivne koncentracije koja je prethodno demonstrirana i pokazalo se da alkaloidni ekstrakt iz guarane nije imao iste korisne efekte (6). Osim toga, podaci iz literature pokazuju da ekstrakti mogu imati veće farmakološke aktivnosti od izoliranih spojeva (37,38).

Smanjenje regulacije skn-1, daf-16, sir-2.1 i hsp-16.2 kod 9-dnevnih C. elegans tretiranih GEE može odražavaju manju potrebu za aktiviranjem ovih gena za popravku oštećenja ćelija tokom starenja u poređenju sa neliječenim crvima, što je moguće zbog direktnogantioksidansefekti ekstrakta (39,40).

Dakle, ova studija je pokazala daprotiv starenjaefekti guarane su posredovaniantioksidansaktivnost i DAF-16, HSF-1 i SKN-1 putevi. Osim toga, ADOR-1 je također bio neophodan za GEE efekte na životni vijek, što ukazuje na moguću uključenost purinergičkog sistema u dugovječnost. Naši rezultati doprinose razumijevanju efekata guarane in vivo, što bi moglo biti od pomoći u prevenciji ili liječenju poremećaja povezanih sa starenjem, i sugeriraju purinergičku signalizaciju kao vjerojatan terapijski cilj za studije dugovječnosti.

Priznanja

Autori su zahvalni Caenorhabditis Genetics

Centar (CGC) na Univerzitetu Minnesota, SAD za obezbjeđivanje sojeva crva i laboratoriji dr. Erika Jorgensena (Univerzitet Utah, SAD) za ljubazno snabdijevanje soja EG6890. Ovu studiju je podržao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil (CNPq), Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de Pessoal a Nível Superior, Brazil (CAPES), PRONEM/FAPERGS/ CNPq i #{472C66NPq i MCTI{C6NPq 3}} i #475896/ 2012-2. Michael Aschner je djelimično podržan od strane NIH grant R01 ES10563. Izvori finansiranja nisu bili uključeni

u dizajnu studije ili interpretaciji podataka.