Niske koncentracije parakvata izazivaju ranu aktivaciju ekstracelularne signalno regulirane kinaze 1/2, protein kinaze B i C-Jun N-terminalne kinaze 1/2 putevi: Uloga C-Jun N-terminalne kinaze u ćelijskoj smrti izazvanoj parakvatom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ i Jose´ M. Fuentes

sažetak:

Paraquat je herbicid s potencijalnim rizikom da izazove parkinsonizam zbog svoje dokazane neurotoksičnosti i jake strukturne sličnosti sa 1-metil-4-fenilpiridinijem (MPP plus), dobro poznatim neurotoksinom koji uzrokuje sličan klinički sindrom toParkinsonova bolest(PD). Međutim, trenutno se vrlo malo zna o signalnim putevima koje parakvat aktivira u bilo kojem ćelijskom sistemu. U ovoj studiji smo istraživali učinak parakvata na aktivaciju kinaze 1 i 2 regulirane izvanćelijskim signalom (ERK1/2), c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) i protein kinaze B (PKB) u E18 ćelijama. Niske koncentracije parakvata stimulisale su vrlo rano povećanje fosforilacije ERK1/2, JNK1/2 i PKB. Inhibitori fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI-3K) wortmanin i LY 294002 (2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H{{ 19}}benzopiran{20}}one) inhibirao je rano povećanje fosforilacije PKB izazvano parakvatom. Nadalje, rano parakvatom posredovano povećanje aktivacije ERK1/2 bilo je osjetljivo na inhibitor protein kinaze kinaze 1 (MEK1) aktiviran mitogenom PD 98059 (2#-amino-3#-metoksiflavon), dok su odgovori JNK1/2 bili blokira JNK1/2 inhibitor SP 600125 (antra[1-9-cd]pirazol-6(2H)-on). Predtretman wortmaninom, LY 294002 ili PD 98059 nije uticao na smrt parakvat ćelija u E18 ćelijama. Nasuprot tome, SP 600125 značajno je smanjio smrt ćelija izazvanu parakvatom u E18 ćelijama. Zaključno, pokazali smo da niske koncentracije parakvata stimulišu snažno vrlo rano povećanje fosforilacije ERK1/2, JNK1/2 i PKB u E18 ćelijama. Nadalje, prikazani podaci sugeriraju da inhibicija JNK1/2 puta štiti ćelije E18 od ćelijske smrti izazvane parakvatom i podržava činjenicu da inhibicija rane aktivacije JNK1/2 može predstavljati potencijalnu strategiju u liječenju PD. Ključne riječi: parakvat; niske koncentracije; JNK; ćelijska smrt; Parkinson.

Biljka protiv Parkinsonove bolesti:cistanche

UVOD

Parkinsonova bolest (PD)je neurodegenerativni poremećaj karakteriziran smrću dopaminergičkih neurona u sub-Constantia nigra u kombinaciji s intracitoplazmatskim inkluzijama poznatim kao Lewyjeva tijela (Olanow i Tatton, 1999.). Samo 5-10 posto pacijenata sa PD ima porodični oblik ove bolesti sa autosomno dominantnim načinom nasljeđivanja (Gasser, 2001). Genetski faktori su važni kod mladih pacijenata, ali nije vjerovatno da će igrati glavnu ulogu u češćim sporadičnim PD. Nasuprot tome, epidemiološke studije ukazuju na nekoliko faktora okoline koji povećavaju rizik od razvoja PB (Parkinsonova bolest). To uključuje pesticide, herbicide, industrijske hemikalije, poljoprivredu i život u ruralnom okruženju (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner i BenShlomo, 1999). Najuvjerljiviji argument u prilog faktora okoline u PD odnosi se na otkriće bioloških efekata MPTP-a (1-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetrarhija-dropiridin). Ovaj toksin centralnog nervnog sistema proizvodi sindrom koji je i klinički i anatomski sličan PD (Kopin i Markey, 1988; Langston et al., 1983). U tom smislu, široko korišćeni herbicid parakvat (1,1#-dimetil-4,4#-bypiridinium) je predložen kao navodni faktor rizika na osnovu njegove strukturne homologije sa MPPþ, aktivnim metabolitom MPTP ( Tanner i Langston, 1990.), kao i na izvještaje o parkinsonizmu koji su povezani s izloženošću uzročniku (Hertzman et al., 1990.; Hubble et al., 1993.; Jimenez-Jimenezet al., 1992.; Liou et al., 1997.; Wang et al. al., 1992). Međutim, dok su signalni putevi uključeni u MPPþ ćelijsku smrt dobro poznati (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), vrlo malo se zna o aktiviranim signalnim putevima parakvatom (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) U svakom slučaju, ne postoje studije o ranim događajima uočenim nakon izlaganja niskim koncentracijama parakvata.

Nekoliko stimulansa, uključujući MPPþ i parakvat, može aktivirati niz intracelularnih signalnih kaskada koje su usko povezane i sa smrću ćelije i putevima preživljavanja ćelije. Na primjer, MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) aktivira članove porodice protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i protein kinaze B (PKB). Članovi TheMAPK porodice aktiviraju se MPPþ ili parakvatom uključuju kinaze 1 i 2 regulirane izvanćelijskim signalom (ERK1/2), c-Jun N-terminalne kinaze (JNK1 i JNK2) i p38 MAPK. Općenito je prihvaćeno da ERK1/2 i PKB aktivacija promoviše preživljavanje ćelija aktiviranjem anti-apoptotičkih signalnih puteva, dok je aktivacija JNK1/2 i p38 MAPK povezana sa smrću neuronskih ćelija (Harper i LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Aktivacija fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI-3K)/PKB puta je uključena u preživljavanje neurona (Shin et al., 2001). Konkretno, aktivacija JNK1/2 puta može igrati kritičnu ulogu u MPPþi toksičnosti parakvata (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) i posljedično u ćelijskim procesima koji su pogođeni u PD(Parkinsonova bolest).

Herb cistanche: Anti-Parkinsonova bolest

MATERIJALI I METODE

Ćelijska linija i kultura.

U ovoj studiji korišteni su spontano besmrtni neuroblasti mozga štakora, E18 ćelije. E18 ćelijska linija je dobijena spontanom imortalizacijom iz kultura 18-dnevnih fetalnih moždanih kortiksa pacova i ljubazno ju je obezbijedio dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Španija) . E18 ćelije predstavljaju primitivne neuroblaste koji eksprimiraju NF 68 i primitivni neuronski marker nestin, ali im nedostaje astrocitni marker, glijalni fibrilarni kiseli protein. Nakon djelomične indukcije diferencijacije sa dibutiril-cAMP, ćelije eksprimiraju dodatne neuronske markere kao što su NF 145, NF 220 i neuron-specifična enolaza (Mun˜oz, lična komunikacija). Ćelije su uzgajane u Hanksovom F-12 (Hyclone, Brevieres, Francuska) i dopunjene sa 10 posto FCS (Hyclone), streptomicinom (100 mg/ml) i penicilinom (100 U/ml). Ćelije su zasijane na 5 3 10 5 u 75-cm2 tikvicu za kulturu tkiva (TPP, Trasadingen, Švicarska) i inkubirane na 37 C u atmosferi 5 posto CO2/95 posto zraka. Kulture su pasirane jednom sedmično tripsinizacijom pomoću rastvora tripsin-EDTA (Hyclone).

Ćelijski tretmani.

Konfluentne ćelije (~ 80 procenata) u boci za kulturu tkiva 75-cm2 su tripsinizovane i zasijane u posude za kulturu tkiva u koncentraciji od 5 3104 ćelija/cm2. Dvadeset četiri sata kasnije, podloga je aspirirana i zamijenjena samo svježom podlogom ili podlogom koja sadrži naznačene koncentracije parakvata. U daljim eksperimentima različite koncentracije inhibitora kinaze (LY 294002, wortmannin, SP 600125 i PD(Parkinsonova bolest)98059, svi iz Tocris, Bristol, Ujedinjeno Kraljevstvo) dodani su 30 minuta prije izlaganja parakvatu. Kako su inhibitori kinaze rastvoreni u dimetil sulfoksidu, kontrole su napravljene sa najvećom korišćenom koncentracijom (0,2 procenta vol/vol). Dodatak dimetil sulfoksida nije utjecao na vrijednosti vitalnosti kontrolnih ploča.

Test vitalnosti ćelija.

Vijabilnost ćelija je određena kolorimetrijskim MTT testom (Mosmann, 1983). U živim ćelijama, mitohondrijski enzim sukcinat dehidrogenaza može metabolizirati MTT u formazansku boju koja apsorbira svjetlost na 570 nm. Za ove eksperimente korišćene su 24-ploče za ispitivanje bunara. Na kraju svakog tretmana, 100 ll MTT pripremljenog u koncentraciji od 5 mg/ml u PBS-u je dodato u svaku ploču. Nakon 3 h inkubacije, podloga je dekantirana, a precipitati formazana su solubilizirani kiselim izopropanolom (0,04–0,1 N HCl u apsolutnom izopropanolu). Apsorbancija konvertovane boje je merena na talasnoj dužini od 570 nm sa oduzimanjem pozadine na 630–690 nm. Apsorbancija netretiranih kultura je postavljena na 100 posto.

Da bi se potvrdili rezultati dobijeni MTT testom, smrt ćelije je takođe procenjena merenjem otpuštanja citosolnog enzima laktat dehidrogenaze (LDH) u medijum kulture pomoću kolorimetrijskog kompleta za LDH (Roche, Indianapolis, IN) prema uputstvima proizvođača . Curenje LDH je definisano kao omjer aktivnosti LDH u mediju kulture prema ukupnoj aktivnosti po jažici (3100). Uporedivi podaci dobiveni su korištenjem obje metode.

Priprema ćelijskih ekstrakata i Western blot analiza.

Nakon eksperimentalnih tretmana, ćelije (kultivisane u posudama od 60-mm) su dva puta isprane hladnim PBS-om i uklonjene ostatkom, a zatim centrifugirane na 900 3 g 5 minuta na 4 C. Ćelije su lizirane u puferu koji sadrži 50mM HEPES, pH 7,5, 300mMNaCl, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4, i koktel inhibitora proteaze (Sigma, St Louis, MO). Ćelije su centrifugirane na 13,000 3 g 5 min na 4°C. Supernatanti su čuvani na 80°C do analize Western blot-om. Koncentracija proteina je mjerena prema Bradfordu (1976) koristeći BSA kao standard.

Jednake količine proteina (10 LG po stanju) su razdvojene u 12% SDS gel elektroforezi i prebačene na PVDF membrane prema konvencionalnim djelomično modificiranim metodama (Fuentes et al., 2000). Ukratko, proteini su prebačeni (250 mA za 60 min) na PVDF membrane pomoću Mini Trans-Blot Cell aparata (Bio-Rad, Hercules, CA). Postupak imunodetekcije uključuje prijenos i blokiranje membrane (60 min na sobnoj temperaturi) sa TTBS (10mM Tris/HCl, pH 7,5, 150mM NaCl i 0,2% Tween-20) koji sadrži 10% nemasnog osušenog mlijeka. Membrane su zatim inkubirane 60 minuta na sobnoj temperaturi sa zečjim poliklonskim primarnim antitijelima (sva iz Cell Signalling, Beverly, MA, razrijeđena 1:1000) u TTBS þ 10 posto nemasnog suhog mlijeka ili 5 posto BSA. Nakon ispiranja (dva 5-minutna perioda sa TTBS), membrane su inkubirane (60 min na sobnoj temperaturi) sa sekundarnim anti-zečjim antitijelima konjugiranim s peroksidazom (1:5000 u TTBS sa 10 posto nemasnog osušenog mlijeka). Nakon ispiranja (dva 5-min. perioda i jedan 10-min period), detekcija vezanih antitijela je vizualizirana hemiluminiscencijom korištenjem ECL-plus reagensa (Amersham Biosciences, Orsay, Francuska) i analizirana pomoću Quantity Jedan softver (Bio-Rad). Sadržaj aktina je analiziran kao kontrola korišćenjem zečjeg poliklonskog antitela (iz Sigme) razblaženog 1:2500 u TTBS sa 10% nemasnog sušenog mleka).

Statistička analiza.

Svaki eksperiment je ponovljen najmanje tri puta uz zadovoljavajuću korelaciju između rezultata pojedinačnih eksperimenata. Prikazani su podaci reprezentativnog eksperimenta; svaka grupa je u prosjeku imala tri do četiri jela kulture. Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ±SEM. Rezultati su analizirani ANOVA. Vrijednosti p manje od 0.05 smatraju se značajnim.

Anti-Parkinsonova bolest:Cistanche Extract

REZULTATI

Citotoksični efekti parakvata u E18 ćelijama

Kao što je ranije objavljeno (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), nekoliko ćelijskih linija je osjetljivo na toksična svojstva parakvata. Izlaganje parakvatu izazvalo je smanjenje vitalnosti stanica ovisno o dozi. (Slika 1.) U ovoj studiji, ćelije E18 tretirane sa 25 lM parakvata tokom 24 h pokazale su gubitak vitalnosti ćelije od 50 procenata. Vijabilnost ćelije je procenjena merenjem transformacije u MTT u formazansku boju koja apsorbuje svetlost na 570 nm. Ovaj test se uveliko koristi za praćenje ćelijske smrti u nekoliko ćelijskih linija, uključujući ćelije E18 (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001) i različite uvrede, uključujući parakvat (Chun et al., 2001; Gonzalez -Polo et al., 2004).

Aktivacija ERK1/2 u E18 ćelijama izazvana parakvatom

Povećanje aktivacije ERK1/2 u E18 ćelijama tretiranim parakvatom praćeno je Western blotingom korišćenjem fosfospecifičnog ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antitela. Ekspozicija ćelija neuroblasta E18 sa 25 lM parakvata dovela je do značajnog povećanja fosforilacionog (Thr202/Tyr204) statusa ERK1/2 (44/42 kDa) (slika 2A). Maksimalni porast fosforilacije dogodio se nakon 5 minuta, nakon čega nivoi fosforilacije polako opadaju do skoro bazalnih nivoa. Nadalje, povećanje fosforilacije ERK1/2 izazvano parakvatom nije ovisilo o koncentraciji (slika 2B). Predtretman inhibitorom theMEK1, PD(Parkinsonova bolest)98059 (50 lM; Dudley et al., 1995) potpuno je inhibirao parakvatom indukovana povećanja fosforilacije ERK1/2 (slika 3).

Parakvatom izazvana aktivacija PKB u E18 ćelijama

Aktivacija PKB-a u E18 ćelijama je otkrivena Western blotingom korištenjem fosfo-specifičnog (Ser473) antitijela. Stimulacija E18 ćelija sa 25 lM parakvata je dovela do značajnog povećanja fosforilacije PKB (slika 4A). Ovo povećanje se dešava nakon 20 minuta, uporedivo sa onim kod ERK1/2 fosforilacije nakon što su nivoi fosforilacije polako opali do skoro bazalnih nivoa (slika 4A). Nadalje, parakvatom posredovana povećanja fosforilacije PKB bila su ovisna o koncentraciji sa maksimumom od 25 lM parakvata (slika 4A). Kako je PI{14}}K neophodan za aktivaciju PKB, uloga PI-3K u aktivaciji PKB induciranoj parakvatom u E18 ćelijama je stoga istražena korištenjem PI-3K inhibitora vortmanina i LY 294002.

Parakvatom posredovana povećanja fosforilacije PKB potpuno su blokirana nakon prethodnog tretmana (30 min) E18 ćelija sa 100 nM vortmanina i 30 lM LY 294002 (slika 5). Ova zapažanja pokazuju da PI-3K-zavisni put posreduje povećanje fosforilacije PKB u E18 ćelijama izazvano parakvatom.

Parakvatom izazvana aktivacija JNK1/2 u E18 ćelijama

Prethodne studije su pokazale da parakvat aktivira JNK1/2 u neuronima (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) i ne-neuronskim ćelijama (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). Međutim, korištene koncentracije su u velikoj mjeri veće od onih koje se koriste u ovom radu. Osim toga, vremena odabrana za vizualizaciju JNK1/2 aktivacije su također duža. Aktivacija JNK1/2 u E18 ćelijama otkrivena je Western blotingom korišćenjem fosfospecifičnog JNK (Thr183/Tyr185) antitela. Stimulacija E18 ćelija sa 25 lM parakvata dovela je do značajnog i ranog povećanja fosforilacije JNK (46/54 kDa) (slika 6A). Ova povećanja su bila maksimalna nakon 5 minuta nakon čega su se nivoi fosforilacije smanjili prema bazalnim nivoima (slika 6A). Međutim, parakvatposredovano povećanje fosforilacije JNK1/2 nije zavisilo od koncentracije (slika 6B). Parakvatom posredovana povećanja fosforilacije JNK1/2 bila su osjetljiva na inhibitor JNK1/2 SP 600125 (10 1M; Slika 7; Bennett et al., 2001). Konačno, parakvat (25 lM) nije stimulirao mjerljiva povećanja fosforilacije p38 MAPK u E18 ćelijama u istim eksperimentima s vremenskim tokom (podaci nisu prikazani). Ovi eksperimenti su izvedeni korišćenjem fosfospecifičnog p38 MAPK(Thr180/Tyr182) antitela.

Mjerenje vitalnosti ćelija nakon tretmana E18 ćelija inhibitorima parakvata i kinaze

Pokazavši da parakvat u svim slučajevima proizvodi ranu aktivaciju ERK1/2, PKB i JNK1/2 u E18 ćelijama, naknadno smo utvrdili ulogu brze aktivacije ovih kinaznih puteva u ćelijskoj smrti izazvanoj niskim koncentracijama parakvata koristeći farmakološki specifične inhibitori. Kao što je prikazano na slici 1, izlaganje E18 ćelija 25 lM parakvata izazvalo je značajno smanjenje vitalnosti ćelija (oko 50 procenata). Da bi se istražila uloga ERK1/2, PKB i JNK1/2 u ćelijskoj smrti izazvanoj parakvatom, E18 ćelije su prethodno inkubirane 30 minuta sa sljedećim inhibitorima kinaze: PD(Parkinsonova bolest)98059 (50 lM; MEK1/2 inhibitor), LY 294002 (30 lM; PI{6}}K inhibitor), vortmanin (100 nM; PI{8}}K inhibitor) i SP 600125 (10 lM; JNK1/2 inhibitor). Kao što je prikazano na slici 8 (i sažeto je prikazano u tabeli 1), wortmannin, LY 294002 i PD 98059 nisu imali značajan uticaj na gubitak vitalnosti ćelije izazvan 25 lM parakvata.

DISKUSIJA

Nedavno su različite studije povećale interes za mogućnost da neurotoksini iz okoliša, kao što su pesticidi, mogu biti povezani s razvojem negenetskog PD(Parkinsonova bolest)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz i Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ je jedan od mogućih herbicida koji su uključeni u PD, zbog slične hemijske strukture sa MPPþ i jake korelacije između incidencije bolesti i količine PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz i Yu, 2000). Međutim, mehanizam neuronske toksičnosti koja se javlja pri nedovoljnom izlaganju niskim razinama parakvata nije utvrđen. U svakom slučaju, prethodni radovi nisu zainteresovani za rani proces koji se vidi nakon izlaganja parakvatu. Glavni nalaz ove studije je da smo pokazali da ćelije neuroblasta E18 izložene niskim koncentracijama parakvatrapidno povećavaju aktiviranu fosforilaciju općenito antiapoptotičkih signalnih puteva PI-3K/PKB i MEK ERK, kao i općenito proapoptotičkog JNK1/ 2 MAPK. Nasuprot tome, parakvat nije stimulirao mjerljiva povećanja fosforilacije p38 MAPK ovisno o vremenu ili koncentraciji. Kao što je gore navedeno, koristili smo nisku koncentraciju parakvata. Relevantnost činjenice da li parakvat može ući u mozak ili ne zato što je nabijen molekul, raspravlja se. Međutim, nedavna otkrića (Shimizu et al., 2001) otkrila su da parakvat može koristiti pumpu neutralnih aminokiselina da uđe u mozak. Nalazi predstavljeni u ovom radu pokazuju da je potrebna samo niska koncentracija parakvata u ćeliji da bi se brzo stimuliralo nekoliko signalnih puteva uključujući NK, koji su uključeni u procese stanične smrti. Ove rane aktivacije zbog niske koncentracije parakvata su po prvi put predložene u ovom radu.

Malo pažnje je posvećeno proučavanju promena u nivoima fosforilacije PKB ili ERK1/2 izazvanih parakvatom (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). U svakom slučaju, prethodni izvještaji (Peng et al., 2004) koriste relativno visoke koncentracije parakvata (400 lM), mjereći stepen fosforilacije ERK nakon 12-18 sati izlaganja. U tim trenucima nisu uočili promjene u nivoima p-ERK. U našem radu smo otkrili ranu (5-10 minuta) i važnu aktivaciju ERK1/2 (slika 2A). Ova aktivacija polako opada do bazalnih nivoa. U našim uslovima, nivoi fosforilisanog ERK1/2 (nakon 12-18h) su isti kao u kontroli, što ukazuje da ovaj put nije aktivan u tim vremenima (podaci nisu prikazani) kako su opisali Peng et al. (2004). Ova aktivacija ne ovisi o koncentraciji, što ukazuje na rezultat da se robusna stimulacija ERK postiže i održava s vrlo niskim koncentracijama parakvata. Promjene u razinama fosforiliranog PKB-a još uvijek nisu opisane nakon izlaganja parakvatu. Na slici 4 pokazujemo da rezultati ovise o vremenu i koncentraciji, pokazujući maksimalni učinak nakon 20-min ekspozicije sa 25 lM parakvata. To jest, rano parakvatom posredovano povećanje fosforilacije PKB je uporedivo sa onim uočenim za ERK1/2. Ovi podaci otkrivaju rano povećanje aktiviranja fosforilacije i PKB i ERK puteva preživljavanja. Nema podataka o ranoj aktivaciji PKB ili ERK u ćelijskoj smrti izazvanoj parakvatom. Međutim, prethodne studije (Halvorsen et al., 2002) opisuju slično rano povećanje oba puta u ćelijama neuroblastoma SH-SY5Y izloženim MPPþ. U ovom slučaju, nivoi fosforilacije ne opadaju prema bazalnom nivou. Ovi podaci su posebno zanimljivi zbog ranije povezane slične strukture između parakvata i MPPþ, što ukazuje na drugačiji početak ćelijskog stroja koji je uključen u djelovanje oba molekula.

Više pažnje je posvećeno ulozi JNK1/2puta u posredovanju signala koji doprinose parakvat-indukovanoj ćelijskoj smrti. U ovoj studiji smo pokazali da niske koncentracije (25 lM) parakvata izazivaju značajno povećanje fosforilisanog JNK1/2 (slika 6). Kao što se dešava u PKBor ERK1/2, ova aktivacija zavisi od vremena sa vrlo ranim početkom (5 min) i sa sporim povratkom na bazalne nivoe. Prethodni radovi (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) pokazuju kasne (12-18 h) aktivacije JNK1/2puta proizvedene u svakom slučaju relativno visokim koncentracijama parakvata (od 400lM [Peng et al., 2004] do 800 lM [Chunet al., 2001]). U našim uslovima, stepen fosforilacije JNK1/2 u naznačenim vremenima je uporediv sa kontrolom. Sve u svemu, ovi rezultati po prvi put pokazuju da izlaganje ćelija vrlo niskoj koncentraciji parakvata dovodi do rane aktivacije PKB, ERK1/2 i JNK1/2 puteva.

Nakon što smo ustanovili da parakvat pokreće ranu aktivaciju PKB, ERK1/2 i JNK1/2 u E18 ćelijama, zatim smo istražili ulogu ovih puteva protein kinaze u ćelijskoj smrti izazvanoj parakvatom koristeći nekoliko farmakoloških inhibitora. Vijabilnost ćelije je praćena merenjem transformacije u MTT u boju za formazan koja apsorbuje svetlost na 570 nm. MTT test je korišten za precizno mjerenje neuronske ozljede nakon raznih uvreda uključujući MPPþ ili paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003., 2004.; Schmuck et al., 2002.; Sheng et al., 2002.; Storch et al., 2004. ), i to je najčešće korištena metoda za određivanje stanične smrti. Kao što je prikazano na slici 8, predtretman selektivnim JNK1/2 inhibitorom SP 600125 značajno je smanjio smrt ćelija izazvanu parakvatom. Ova koncentracija SP 600125 potpuno je blokirala parakvatom indukovanu aktivaciju JNK1/2 (slika 7). Ovi podaci ukazuju na to da inhibicija rane aktivacije JNK1/2 puta štiti ćelije od ćelijske smrti izazvane parakvatom. Ovi podaci su u skladu sa prethodnim studijama (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), koje su pokazale da je JNK1/2 uključen u smrt neuronskih ćelija izazvanu parakvatom. Međutim, ove studije koriste između 15 i 30 puta više koncentracije parakvata od one korištene u ovoj studiji. Također smo pokazali da niske koncentracije parakvata mogu proizvesti ne samo aktivaciju već i ranu aktivaciju ovog puta. Zaštita primećena sa SP600125 takođe ukazuje da je put JNK1/2 uključen u ćelijsku smrt izazvanu parakvatom. Dodatno, JNK1/2 inhibicija je dizajnirana kao potencijalna strategija u liječenju PD(Parkinsonova bolest)na nekoliko modela i in vivo i in vitro (Wang et al., 2004).

neuroprotektivni efekat cistanchea

Prethodne studije su pokazale da su i PKB i ERKputevi uključeni u neuronsko preživljavanje (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). U ovoj studiji smo pokazali da niske koncentracije parakvata proizvode i rano stimuliraju PKB i ERK puteve. Ova zapažanja sugeriraju da parakvatom indukovana PKB i ERK aktivacija može biti uključena u zaštitu ćelija od ćelijske smrti izazvane parakvatom. Da bismo istražili ovu mogućnost, koristili smo strukturno nepovezane PI-3K inhibitore wortmannin i LY 294002 i ERK1/2inhibitor PD(Parkinsonova bolest)98059. Zanimljivo je da i PKB i ERK inhibicija nisu promijenile vitalnost ćelije u prisustvu parakvata, što sugerira da, u našim uvjetima, povećana PKB i ERKaktivacija nije od suštinskog značaja za preživljavanje u ćelijskoj smrti izazvanoj parakvatom u E18 ćelijama.

Dobro je poznato da je mehanizam neurotoksičnosti parakvata, između ostalih faktora, posredovan oksidativnim stresom (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). U tom smislu, nedavno je opisan vrlo brz citosolni oksidativni stres u ranim apoptotičkim događajima koji su implicirani u ćelijsku smrt izazvanu parakvatom (Gonzalez-Polo et al., 2004). Kako oksidativni stres aktivira članove porodice MAPK (kao što su ERK1/2 i JNK1/2) i PKB (Kamata i Hirata, 1999), ova rana aktivacija ERK1/2, JNK1/2 i PKB može se pripisati brzoj oksidaciji izazvano stresom nakon izlaganja parakvatu.

Ukratko, naši rezultati po prvi put pokazuju da niske koncentracije parakvata stimuliraju vrlo rano i snažno povećanje fosforilacije PKB, ERK1/2 i JNK1/2 u ćelijama E18. Pored toga, pokazali smo da inhibicija rane aktivacije JNK1/2 puta štiti ćelije E18 od ćelijske smrti izazvane parakvatom. Ovaj rezultat ukazuje na postojanje nekih ranih događaja (kao što je brza aktivacija JNK1/2) koji igraju bitnu ulogu u ćelijskoj smrti izazvanoj niskim koncentracijama parakvata. Ovaj rezultat također otvara novu i uzbudljivu liniju u proučavanju toksičnosti parakvata i njegove moguće implikacije u razvoju PD(Parkinsonova bolest).

BILJEŠKA: Cistancheje tradicionalna kineska biljka koja djeluje na neurone i moždane stanice. cistanche je također poznat kao pustinjski ginseng, potencijalni je lijek za neuro bolesti kao nprParkinsonova bolestna osnovu savremenih farmakoloških studija