LIMIT je imunogena LncRNA u imunitetu protiv raka i imunoterapiji

Abstract

MHC-I predstavlja tumorske antigene CD8+ T ćelijama i pokreće antitumorski imunitet. Ljudi mogu imati 30,000-60,000 dugih nekodirajućih RNK ​​(lncRNA). Međutim, ostaje slabo shvaćeno da li lncRNA mogu utjecati na imunitet tumora. Ovdje identifikujemo LncRNA, sposobnu da izazove MHC-I i imunogenost tumora (LIMIT) kod ljudi i miševa. Otkrili smo LIMIT stimuliran IFN-om, LIMIT klaster gena koji vezuje protein gvanilata (GBP), a GBP-ovi su poremetili povezanost između HSP90 i faktora toplotnog šoka-1 (HSF1) - što je rezultiralo aktivacijom HSF1 i transkripcijom MHC-I mašinerije, ali ne i PD-L1. RNK vođena CRISPR aktivacija LIMIT-a povećala je GBP i MHC-I, te pojačala imunogenost tumora i terapiju kontrolnih tačaka.

Utišavanje LIMIT-a, GBPs i/ili HSF1 smanjilo je MHC-I, oslabio antitumorski imunitet i smanjio efikasnost imunoterapije. Klinički, LIMIT, GBPs- i HSF1-signalni transkripti i proteini su u korelaciji sa MHC-I, T ćelijama koje infiltriraju tumor i odgovorom na blokadu kontrolnih tačaka kod pacijenata sa rakom. Sve u svemu, pokazujemo da je LIMIT ranije nepoznata imunogena lncRNA protiv raka i da bi os LIMIT-GBP-HSF1 mogla biti ciljana za imunoterapiju raka.

Ključne riječi 

Duga nekodirajuća RNA; LIMIT; MHC-I; IFN ; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; imunitet T ćelija; imunoterapija raka

Uvod

Blokada kontrolne tačke oslobađa imunološku moć CD8+ T ćelija protiv raka1. Glavni kompleks histokompatibilnosti-I (MHC-I) igra ključnu ulogu u pražnjenju i aktivaciji CD8+ T ćelija2. Međutim, MHC-I se često smanjuje u ćelijama raka, što rezultira imunološkom evazijom tumora i otpornošću na imunoterapiju3,4. Važno je razumjeti kako oporaviti tumorsku MHC-I ekspresiju i revitalizirati antitumorski imuni odgovor5. LncRNA se brzo pojavljuju zajedno s napretkom u dubokom sekvenciranju RNK, pokrivajući mnogo više lokusa u ljudskom genomu od gena koji kodiraju protein6. LncRNA regulišu gene koji kodiraju proteine ​​na više nivoa7-9 i igraju ključnu ulogu u genomskom otiskivanju10, diferencijaciji ćelija11 i napredovanju raka12. Međutim, identitet, način djelovanja, funkcija i klinički značaj specifičnih lncRNA u imunitetu protiv raka i imunoterapiji ostaju nepoznati. Ovdje identifikujemo LIMIT kao ranije nepoznatu lncRNA imunogenu na rak. LIMIT utiče na MHC-I mašineriju i antitumorski imunitet. Otkrili smo da LIMIT lokalno cilja GBP, čime se formira molekularna kaskada LIMIT-GBP-HSF1-MHC za promjenu antitumorskog imuniteta i efikasnosti imunoterapije tumora. Naš rad ne samo da otkriva prethodno nepoznatu biologiju imunogene lncRNA, LIMIT, već također sugerira da os LIMIT-GBP-HSF1 može biti ciljana za imunoterapiju raka.

LIMIT je imunogena lncRNA

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Da bismo istražili nepoznate regulatorne gene u tumorskom imunitetu, na osnovu infiltracije tumorskih CD8+ T ćelija, podijelili smo humani melanom (TCGA, SKCM) na tipove vrućih i hladnih tumora i analizirali imunogene korelacije gena. Uz CD8A, IFN i MHC-I (HLA-ABC) transkripte, otkrili smo da je lncRNA kandidat obogaćen u vrućem tumoru, među 3926 kandidata za lncRNA označenih GENCODE13 (Slika 1a; Dodatna tabela 1). Na osnovu funkcionalnih studija u sledećim eksperimentima, označili smo ovog kandidata za lncRNA kao GRANICU: lncRNA koja indukuje MHC-I i imunogenost tumora (LIMIT). U skupu podataka o melanomu kod ljudi, nivoi LIMIT-a su u pozitivnoj korelaciji sa nivoima IFN, MHC-I i CD8 (slika 1b-d). U skladu s tim, analiza obogaćivanja genskog skupa (GSEA) otkrila je da je ekspresija LIMIT u korelaciji sa genima odgovora na IFN, prezentacijom antigena putem MHC-I i imunološkom aktivacijom (slika 1e-h). Štaviše, nivoi LIMIT-a su korelirali sa poboljšanim stopama imunoterapije na kontrolnim tačkama 14-17 (slika 1i) i bili su povezani sa preživljavanjem pacijenata sa melanomom (slika 1j). Pored toga, ekspresija LIMIT-a je u korelaciji sa IFN, MHC-I i CD8 kod više tipova raka (Prošireni podaci, slika 1a-l). Dakle, LIMIT je potencijalna imunogena lncRNA.

Provjerili smo da li je LIMIT lncRNA. Northern bloting je pokazao da je LIMIT bio dugačak približno 2 kb u ljudskim ćelijama melanoma A375 (slika 1k). Primijenili smo brzu amplifikaciju cDNK krajeva (RACE) i karakterizirali cDNK krajeve LIMIT-a u ljudskim (A375) i mišjim (B16) ćelijama melanoma (Slika 1l, m). Zatim smo klonirali punu dužinu LIMIT-a i kod ljudi i kod miševa i uskladili ga sa odgovarajućim sekvencama genoma (Prošireni podaci, slika 2a, b). Ljudski LIMIT je bio lociran u hromozomu 1, sa 1967 nukleotida i 6 egzona (prošireni podaci, slika 2a), dok se mišji limit nalazio u hromozomu 3, sa 1634 nukleotida i 7 egzona (prošireni podaci, slika 2b). LIMIT nije sadržavao važeći Kozak niz. Kada smo pripremili RNK iz nuklearnih i citoplazmatskih frakcija ćelija A375, LIMIT je uglavnom detektovan u nuklearnoj frakciji (slika 1n). Dakle, LIMIT nema potencijal za kodiranje proteina. Zajedno, LIMIT ispunjava sve kriterijume da se definiše kao lncRNA. Značajno je da je u LIMIT lokusu, kandidatu za lncRNA, pseudogen GBP1 (GBP1P1) pronađen u hepatocelularnom karcinomu (HCC)18. Međutim, LIMIT je pokazao male sličnosti sa GBP1P1 ili GBP1 (Prošireni podaci, slika 2c, dodatna tabela 2). Dakle, LIMIT nije GBP1P1. Visoka korelacija između LIMIT i IFN odgovornog genskog potpisa (slika 1e) sugerira da IFN može stimulirati LIMIT ekspresiju. Zaista, tretman sa IFN indukovao je ekspresiju LIMIT-a, kao što je prikazano Northern blotingom (slika 1k) i RNA-seq u ćelijama A375, HT29, Meijuso i A549 (slika 1o). Međutim, tretman sa drugim citokinima, kao što su IFN i TNF, nije uspeo da izazove LIMIT ekspresiju (slika 1k). Štaviše, IFN nije uspio da izazove LIMIT u STAT1 nokautiranim (KO) A375 ćelijama (slika 1p). Dakle, LIMIT je ranije nepoznata lncRNA koja reagira na IFN i u ljudskim i u mišjim stanicama.

LIMIT povećava MHC-I izraz

Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Da bismo proučili funkciju LIMIT-a u tumorskim ćelijama, prvo smo srušili LIMIT sa malim ukosnim RNK (shLIMIT). Koristili smo Blast alat da odaberemo LIMIT shRNA koje nemaju kandidata izvan cilja (dodatne tabele 3-6). ShLIMIT nije ciljao GBP kodirajuće gene (prošireni podaci, slika 3a). U ćelijama A375, shLIMIT je potisnuo LIMIT ekspresiju (slika 2a), ali nije uticao na fosforilaciju STAT1 (slika 2b) kao odgovor na IFN - što sugeriše da LIMIT nije uticao na globalnu signalizaciju IFN gena. MHC-I i PD-L1 su ciljni geni IFN19-21. ShLIMIT je doveo do smanjenja ekspresije MHC-I (slika 2c), ali ne i PD-L1 (prošireni podaci, slika 3b), kao odgovor na stimulaciju IFN-om. U skladu sa ovim ljudskim podacima, ograničenje utišavanja u ćeliji mišjeg melanoma YUMM1.7 ili ćeliji raka debelog crijeva CT26 rezultiralo je smanjenom ekspresijom MHC-I kao odgovorom na IFN (slika 2d-g). U ćelijama A375, shLIMIT je uticao ne samo na ekspresiju MHC-I (HLA-ABC, HLA-E i HLA-F) već i na ekspresiju MHC-II (HLA-DRA i HLA-DMA); dok LIMIT nije izmijenio ekspresiju drugih IFN signalnih gena (Prošireni podaci, slika 3c). Dakle, LIMIT učestvuje u regulaciji IFN-indukovane MHC-I i MHC-II ekspresije bez promene globalnog signalnog puta IFN-a.

LIMIT je prekinuti gen sa velikim intronima, koji zauzimaju oko 17 kb u genomu. Nismo uspjeli izbaciti LIMIT lokus sa uparenim sgRNA i Cas9. S obzirom na to da postoji 5 predviđenih STAT1/IRF1 veznih mjesta u LIMIT promotoru, dizajnirali smo 4 uparene sgRNA za brisanje ovih mjesta vezivanja u LIMIT promotoru (prošireni podaci, slika 3d). Generirali smo A375 ćelije sa LIMIT delecijom promotora u sve 4 kombinacije sgRNA. Otkrili smo da IFN više nije efikasan da indukuje ekspresiju LIMIT-a i MHC-I u tumorskim ćelijama sa LIMIT delecijom promotora u poređenju sa ćelijama divljeg tipa (slika 2h, i). Dodatno smo koristili CRISPR aktivacijski sistem vođen RNA za aktiviranje Limit ekspresije u tumorskim ćelijama22. Uspostavili smo 4 vodeće RNK koje ciljaju promotorsku regiju Limit (sgLimit) i ko-ekspresovane sa dCas9-VPR, tripartitnim aktivatorom transkripcije spojenim sa Cas9 bez nukleaze, u B16 ćelije (prošireni podaci, slika 4a). Sva 4 sgLimit su poboljšala ekspresiju Limita, kao i MHC-I (Prošireni podaci, slika 4b, c). Kada smo transficirali B16 ćelije sa udruženim sgLimit i neciljanim sgRNA (sgNT), sgLimit je indukovao ekspresiju Limita i MHC-I, ali ne i PD-L1 (slika 2j, k). Stoga, Limit selektivno cilja na MHC-I, ali ne i na PD-L1. Sve u svemu, eksperimenti gubitka i povećanja funkcije pokazuju da LIMIT može promijeniti 1.5-3 ekspresiju MHC-I u više ćelija raka kod miševa i ljudi. Zatim smo istražili da li LIMIT-promijenjena ekspresija MHC-I utiče na TAA-specifično CD8+ T ćelija posredovano ubijanje tumora in vitro. U tu svrhu, prvo smo genetski srušili B2M sa specifičnim shRNA u ovalbuminu (OVA)--koji eksprimiraju B16 ćelije. shRNA-B2M je rezultirao 1.5-putostrukim smanjenjem ekspresije OVA-H2Kb (Prošireni podaci, slika 4d). Kada su B16-OVA ćelije koje nose shFluc i shB2M inkubirane sa OT-I ćelijama, uočili smo smanjenje ubijanja shB2M-B16-OVA ćelija posredovano OT-I u poređenju sa shFluc-B{{63 }}OVA ćelije (Prošireni podaci, sl. 4e-g). Podaci sugeriraju da bi 1.5-3-promjene u ekspresiji MHC-I kontrolisane LIMIT-om mogle biti funkcionalno relevantne u utjecaju na TAA specifične CTL aktivnosti. Da bismo ovo potvrdili, aktivirali smo LIMIT u B16-OVA ćelijama koje eksprimiraju šelak i shB2M. Kao što se i očekivalo, CRISPR aktivacija LIMIT-a izazvala je minimalnu ekspresiju MHC-I u shB2M ćelijama, u poređenju sa kontrolnim ćelijama (slika 2l). Shodno tome, OT-I ćelije su posredovale minimalno ubijanje tumora u shB2M-OVA-B16 ćelijama u poređenju sa kontrolnim ćelijama (Slika 2m, n). Podaci sugeriraju da je ekspresija MHC-I izazvana LIMIT-om važna u TAA-specifičnoj aktivaciji i funkciji T stanica. Ćelije koje predstavljaju antigen (APC), uključujući makrofage i dendritske ćelije (DC), eksprimiraju MHC-I, predstavljaju antigene i aktiviraju TAA-specifične T ćelije. Proširili smo naše studije sa tumorskih ćelija na APC. IFN snažno stimuliše Limit ekspresiju u DC-ovima i makrofagima dobijenim iz koštane srži (Prošireni podaci, slika 4h, i). Transfektirali smo makrofage sa 5'FAM-obilježenom siRNA ciljanom granicom (siLIMIT). Smanjenje LIMIT-a rezultiralo je nižom ekspresijom MHC-I kao odgovorom na stimulaciju IFN-om, u poređenju sa kontrolom (Prošireni podaci, slika 4j, k). Dakle, LIMIT je lncRNA koja reaguje na IFN i može promovirati ekspresiju MHC-I u tumorskim stanicama i APC.

LIMIT jača antitumorski imunitet

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Nedovoljna ekspresija MHC-I dovodi do imunološke evazije tumora i otpornosti na imunoterapiju3. Da bismo razumjeli ulogu Limita u antitumorskim imunološkim odgovorima in vivo, inokulirali smo kontrolne (shFluc) i Limit-silencing (shLimit) YUMM1.7 tumorske ćelije u NOD scid c-deficijent (NSG, imunodeficijent) i divlji tip C57BL/6 (imuno kompetentni) miševi. U poređenju sa kontrolnim tumorima, tumori shLimit YUMM1.7 su uporedivo rasli kod NSG miševa (slika 3a), dok su napredovali brže kod miševa divljeg tipa (slika 3b). Osim toga, inokulirali smo shLimit CT26 tumore u divljeg tipa BALB/c miševa. Opet, ograničenje utišavanja rezultiralo je pojačanim rastom tumora CT26 u imunokompetentnom modelu (slika 3c). Podaci ukazuju na to da Limit utišavanja može narušiti antitumorski imunitet i olakšati rast tumora na imunološki ovisan način. U prilog tome, otkrili smo smanjenje CD3+, IFN + i TNF + T ćelija u tumorima shLimit YUMM1.7 (slika 3d, e). Zajedno, utišavanje Limita narušava antitumorski imunitet. Da bismo odredili ekspresiju MHC-I i MHC-I: SIINFEKL in vivo, ustanovili smo YUMM1.7 ćelije koje stabilno eksprimiraju OVA (YUMM1.7-OVA) i transducirane sa shRNA ciljanjem Limit ili Fluc. Nakon tretmana IFN, otkrili smo smanjenu površinsku ekspresiju OVA-H2Kb u ćelijama shLimit-YUMM1.7 (Prošireni podaci, slika 5a). Inokulirali smo shLimit YUMM1.7-OVA ćelije i shFluc-YUMM1.7-OVA ćelije u C57BL/6 miševe. Zatim smo secirali tumorska tkiva i otkrili ekspresiju H2Db i OVA-H2Kb u tumorskim ćelijama. Uočili smo smanjenje H2Db i OVA-H2Kb u shLimit-YUMM1.7-OVA ćelijama u poređenju sa kontrolnim ćelijama (Prošireni podaci, slika 5b-f). Podaci ukazuju da Limit može uticati na MHC-I i MHC-I: ekspresiju antigena in vivo. Dodatno smo inokulirali kontrolne (sgNT) i limit-aktivirajuće (sgLimit) B16 ćelije u divlje C57/BL6 miševe. Kao što se očekivalo, sgLimit (granična aktivacija) je dramatično smanjio rast tumora (slika 3f). Ovo je bilo praćeno povećanim brojem T ćelija koje infiltriraju tumor i aktivacijom (Slika 3g, h). B16 melanom je relativno neosjetljiv tumorski model na blokadu PD-L123. U skladu s tim, blokada PD-L1 nije uspjela kontrolisati rast tumora sgNT B16 kod miševa. Zanimljivo, Limit aktivacija u B16 tumoru sa sgLimit senzibiliziranim odgovorom tumora na blokadu PD-L1, kao što je prikazano smanjenom progresijom tumora (slika 3i). Sve u svemu, Limit pojačava imunitet tumora i senzibilizira odgovor imunoterapije tumora.

LIMIT cis-aktivira GBP za jačanje MHC-I i imunitet tumora

Zatim smo istražili kako LIMIT utiče na MHC-I i imunitet tumora. LncRNA mogu lokalno regulirati ekspresiju susjednih gena24. LIMIT je lokaliziran blizu klastera gena, proteina koji se vezuju za gvanilat (GBPs), u genomima ljudi i miša (Prošireni podaci, slika 2a, b). Pitali smo da li LIMIT može regulisati izražavanje GBP-a. Utišavanje LIMIT-a smanjilo je nivoe prekursora i zrelih GBP mRNA (slika 4a) i GBP1-5 proteina (slika 4b) u ljudskim A375 ćelijama kao odgovor na tretman IFN-om. Podaci sugeriraju da LIMIT može promovirati transkripciju GBP-a u cis-u. U prilog ovoj mogućnosti, utišavanje limita je takođe smanjilo ekspresiju Gbp2 u YUMM1.7 i CT26 ćelijama miša (Prošireni podaci, slika 6a, b). Nadalje, CRISPR aktivacija Limita je izazvala ekspresiju Gbp2 u B16 ćelijama (slika 4c). Da bismo testirali da li LIMIT može transregulirati GBP, prisilili smo ekspresiju LIMIT cDNK u A375 ćelije. Otkrili smo da GBP1 i višestruki imuni faktori (uključujući IRF1, HLA-ABC i PD-L1) nisu bili promijenjeni prekomjernom ekspresijom LIMIT (Prošireni podaci, slika 6c). Dakle, LIMIT je lncRNA koja djeluje cis sposobna inducirati ekspresiju GBP. Među članovima Gbp porodice, Gbp2 je dominantan član Gbp porodice u ćelijama miša (Prošireni podaci, slika 6d). Da bismo testirali da li LIMIT može regulisati MHC-I preko GBP-a, uspostavili smo stabilne YUMM1.7 ćelije koje nose šelak, shLimit, shGbp2 ili shLimit plus shGbp2. Otkrili smo da kao odgovor na stimulaciju IFN-om, shLimit i shGbp2 dovode do uporedivog smanjenja ekspresije Gbp2 i MHC-I; istovremeno utišavanje Limita i Gbp2 nije uspelo dodatno da promeni ekspresiju Gbp2 i MHC-I (slika 4d, e). Štaviše, pitali smo se da li prekomerna ekspresija GBP može spasiti MHC-I ekspresiju MHC-I smanjene regulacije u Limit srušiti tumorske ćelije. Forsirali smo ekspresiju GBP1 u shLIMIT A375 ćelijama (GBP1OE) i tretirali ove ćelije sa IFN. Primetili smo da je shLIMIT rezultirao smanjenom ekspresijom MHC-I u kontrolnim ćelijama, ali ne i u GBP1OE ćelijama (Prošireni podaci, slika 6e). shLIMIT ili GBP1OE nisu uticali na ekspresiju PD-L1 i IRF1 (Prošireni podaci, slika 6e, f). Stoga, Limit može regulisati ekspresiju MHC-I na način ovisan o GBP. Zatim smo inokulirali YUMM1.7 ćelije sa ograničenjem i/ili Gbp{56}}utišavanjem u C57BL/6 miševe. Utišavanje limita i utišavanje GBP-a je na sličan način rezultiralo bržim rastom tumora u poređenju sa kontrolnom grupom, dok istovremeno utišavanje LIMIT-a i GBP-a nije dalje uticalo na progresiju tumora (slika 4f). Nadalje, otkrili smo smanjenje broja T ćelija koje se infiltriraju u tumor i aktivaciju u shLimit tumorima, shGbp2 tumorima i shLimit plus shGbp2 tumorima (slika 4g i prošireni podaci, slika 6g). Zajedno, LIMIT povećava ekspresiju MHC-I i imunitet tumora na način koji ovisi o GBP-u. GBP su geni koji reaguju na IFN u fibroblastima25 i makrofagima26 u kontekstu odbrane domaćina od patogena. Međutim, uloga GBP-a u imunitetu protiv raka nije poznata. S obzirom da je utišavanje GBPs smanjilo ekspresiju MHC-I i aktivaciju CD8+ T ćelija (slika 4g i prošireni podaci slika 6g), pretpostavili smo da GBPs mogu uticati na efikasnost imunoterapije raka. Da bismo testirali ovu hipotezu, utišali smo Gbp2 u MC38 stanicama, tumorskom modelu osjetljivom na imunoterapiju23. Kao što se i očekivalo, utišavanje Gbp2 u MC38 ćelijama smanjilo je ekspresiju MHC-I nakon tretmana IFN-om (slika 4h) i u velikoj mjeri poništilo efikasnost blokade PD-L1 (slika 4i). Ovo, zajedno sa gore navedenim podacima, sugerira uključenost LIMIT-a i GBP-a u kontroli efikasnosti imunoterapije protiv raka. U prilog ovoj mogućnosti, analiza kliničkih podataka je otkrila da su visoki nivoi ekspresije GBP u korelaciji sa LIMIT-om, ekspresijom MHC-I i odgovorom imunoterapije (Prošireni podaci, slika 6h-j) kod pacijenata sa melanomom14-17. Nadalje, nivoi ekspresije GBP bili su pozitivno povezani sa preživljavanjem pacijenata (Prošireni podaci, slika 6k). Da bismo potvrdili da li su GBP-ovi geni koji reagiraju na IFN u ćelijama raka, stimulirali smo A375 stanice IFN-om i drugim citokinima. GBP su inducirani IFN-om, ali su minimalno pod utjecajem drugih imunoloških citokina (slika 4j). Zatim smo koristili CRISPR-Cas9 sistem da ciljamo zajedničke sekvence između GBP1-5 i generisali GBP1-5 nokaut (KO) A375 ćelije (slika 4k). Primetili smo da IFN slabo stimuliše transkripte mašina MHC-I gena (slika 4l) i površinske HLA-ABC proteine ​​u GBP KO A375 ćelijama (slika 4m). Stoga, LIMIT cis-aktivira GBPs za jačanje MHC-I mašinerije i imuniteta tumora.

GBP aktiviraju HSF1 kako bi stimulirali MHC-I i imunitet tumora

Da bismo pokazali kako GBP mogu regulisati ekspresiju MHC-I i imunitet tumora, prisilili smo ekspresiju GBP u A375 ćelijama. Zanimljivo je da je prekomjerna ekspresija GBP povećala ekspresiju humanog MHC-I - kao što je prikazano qRT-PCR (Slika 5a), bojenjem površine membrane (Slika 5b) i Western blottingom (Slika 5c). Podaci sugeriraju da GBP mogu aktivirati MHC-I na nivou transkripcije. Konzistentno, prekomerna ekspresija Gbp2 povećava ekspresiju mišjeg MHC-I u YUMM1.7 i B16 ćelijama (slika 5d). Da bismo identifikovali faktor(e) transkripcije koji reguliše MHC-I preko GBP-a kao odgovor na IFN, izvršili smo bioinformatičko predviđanje sa PROMO27. Pronašli smo 8 faktora transkripcije izmijenjenih IFN-om u A375 ćelijama, koji mogu ciljati HLA-ABC, HSPA5, CALR i TAP1. Pored nekoliko dobro poznatih faktora, aktivnost HSF1 je bila visoko indukovana IFN-om (prošireni podaci, slika 7a). Obradom ChIP-seq skupova podataka u ENCODE28, otkrili smo da su i STAT1 i HSF1 obogaćeni promotorima gena povezanih s MHC-I sa različitim obrascima vezivanja (Prošireni podaci, slika 7b). Izveli smo ChIP test sa anti-HSF1 antitelom u IFN-stimulisanim A375 ćelijama. HSF1 je obogaćen promotorima HLA-ABC, HSPA5, CALR i TAP1, ali ne HPRT1, negativna kontrola (slika 5e). Rezultati sugeriraju da je HSF1 transkripcijski faktor za MHC-I. HSF1 se obično aktivira prekidom proteostaze29. Da bismo testirali da li će aktivacija HSF1 pojačati ekspresiju MHC-I, tretirali smo A375 ćelije sa listom stresora30: toplotni šok, oksidativni stres (Luperox), inhibitori translacije (puromicin), proteasom (MG-132) i pratilac (17-AAG). Zanimljivo je da su ovi stresori univerzalno stimulisali ekspresiju MHC-I – dok je KRIBB11, inhibitor HSF1, smanjio ovaj efekat (slika 5f i prošireni podaci, slika 7c). Stoga, aktivacija HSF1 općenito inducira ekspresiju MHC-I. Zatim smo postavili pitanje da li GBP-ovi mogu aktivirati HSF1. Prisilna ekspresija GBPs indukovala je aktivnost luciferaze HSF1 reportera HSE-Luc (slika 5g), kao i fosforilaciju HSF1 (slika 5h). Ovo sugerira da bi GBP-ovi mogli aktivirati HSF1. IFN nije uspio inducirati ekspresiju HSPA5 u GBP-KO A375 ćelijama (slika 5i). Dakle, IFN aktivira HSF1 indukcijom GBP ekspresije. Nadalje, tretman sa KRIBB11, inhibitorom HSF1, poništio je regulaciju MHC-I posredovanu prekomjernom ekspresijom GBP1 (slika 5j). Dakle, GBPs stimulišu ekspresiju MHC-I na HSF{78}}zavisan način. Da bismo učvrstili mehaničku vezu između GBP-a i HSF1, utišali smo Gbp2 i/ili Hsf1 u MC38 ćelijama (slika 5k). Nakon tretmana IFN, samo utišavanje Gbp2 ili Hsf1 smanjilo je ekspresiju MHC-I, ali istovremeno utišavanje Gbp2 i Hsf1 nije uspjelo dodatno modulirati ekspresiju MHC-I (slika 5l). Da bismo demonstrirali funkcionalnu relevantnost interakcije između GBP i HSF1 u imunosti tumora, inokulirali smo MC38 tumorske ćelije koje eksprimiraju šelak, shGbp2, shHSF1 ili shGbp2 plus shHSF1 u miševe C57BL/6. U poređenju sa shFluc kontrolama, utišavanje Gbp2 i utišavanje Hsf1 je uporedivo ubrzalo rast tumora (slika 5m), i smanjilo broj T ćelija koje infiltriraju tumor i aktivaciju (slika 5n i prošireni podaci, slika 7d). Štaviše, istovremeno utišavanje Gbp2 i Hsf1 nije moglo dalje da utiče na rast tumora i T ćelije koje se infiltriraju u tumor (slika 5m, n i prošireni podaci, slika 7d). Sve u svemu, GBPs stimulišu ekspresiju MHC-I i antitumorski imunitet aktivacijom HSF1.

LIMIT-GBP-HSF1 osovina pokreće MHC-I i imunitet tumora

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Zatim smo ispitali kako GBP aktiviraju HSF1 da bi promijenili ekspresiju MHC-I i imunitet tumora. U normalnim uslovima, monomerni HSF1 je povezan i potisnut sa pratiocima, kao što je HSP9031. Prekid njihove interakcije dozvoljava trimerizaciju i akumulaciju HSF1 u jezgru, što rezultira transkripcionom aktivacijom njegovih ciljnih gena32. Pretpostavili smo da GBP-ovi mogu poremetiti vezu između HSP90 i HSF1, što rezultira aktivacijom HSF1. Da bismo testirali ovu mogućnost, tretirali smo A375 ćelije sa IFN-om i izveli Co-IP sa HSP90 antitelom. Otkrili smo da su endogeni GBP izazvani IFN povezani sa HSP90 (slika 6a). Dodatno, transficirali smo A375 ćelije sa egzogenim Flag-GBP1 i izveli Co-IP eksperiment sa Flag-antitelom. HSP90 je detektovan u IP proizvodu iz ćelija transficiranih Flag-GBP1, ali ne i kontrolnih ćelija transficiranih vektorom (slika 6b). Imunofluorescentno bojenje je pokazalo da su GBP i HSP90 u velikoj mjeri ko-lokalizirani u citoplazmi (slika 6c). Kada smo transficirali 293T ćelije sa povećanjem doze GBP1 plazmida, HSP90-povezan HSF1 je smanjen na način ovisan o dozi (slika 6d). Podaci sugeriraju da su GBP-ovi stupili u interakciju s HSP90 i ova interakcija je poremetila povezanost između HSF1 i HSP90. HSP90 je pratilac za višestruko savijanje i stabilnost proteina, pitali smo se da li GBP mogu promijeniti aktivnost pratioca HSP90. Iako je inhibitor HSP90 potisnuo ekspresiju klijentskih proteina HSP90 (kao što su RAF1, BCL2 i CDK433), prekomjerna ekspresija GBPs nije uspjela (slika 6e). Dakle, GBP-ovi stupaju u interakciju sa HSP90 i oslobađaju HSP90-povezan HSF1, ali ne mijenjaju aktivnost HSP90. Zatim smo direktno ispitali ulogu HSF1 u ekspresiji MHC-I. Tretirali smo A375 ćelije IFN-om u prisustvu HSF1 inhibitora KRIBB11. Kao što se očekivalo, tretman sa KRIBB11 smanjio je IFN-stimuliranu mRNA ekspresiju gena povezanih s MHC-I, uključujući HLA-ABC, TAP1, HSPA5 i CALR, ali ne i IRF1 (slika 6f). Zanimljivo, KRIBB11 je smanjio ekspresiju MHC-I izazvanu IFN-om, ali je imao minimalan efekat na ekspresiju PD-L1 (slika 6g). Dakle, HSF1 može regulisati ekspresiju MHC-I izazvanu IFN-om bez mijenjanja globalne signalizacije IFN-a. Da bismo istražili da li je MHC-I reguliran HSF{72}}funkcionalnom, uzgajali smo B16-OVA sa OT-I ćelijama u prisustvu KRIBB11 i IFN. KRIBB11 je inhibirao IFN-indukovanu ekspresiju OVA-vezanog MHC-I (prošireni podaci, slika 8a). U skladu sa ovim, KRIBB11 je takođe potisnuo OT-I ćelijski posredovane citotoksične efekte na B16-OVA (Prošireni podaci, slika 8b). Da bismo proširili naša zapažanja na dodatne tumore, utišali smo Hsf1 sa shHsf1 u YUMM1.7 i CT26 ćelijama. Utišavanje Hsf1 rezultiralo je smanjenom ekspresijom MHC-I u YUMM1.7 (slika 6h, i) i CT26 ćelijama (prošireni podaci, slika 8c) kao odgovor na stimulaciju IFN-om. U YUMM1.7 ćelijama, utišavanje HSF1 nije uspelo da utiče na ekspresiju Gbp2 kao odgovor na IFN (slika 6h), što ukazuje da Gbp2 nije ciljni gen za HSF1. U ćelijama shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 nije uspeo da potisne ekspresiju MHC-I stimulisanu IFN (prošireni podaci, slika 8d). Podaci sugeriraju da je HSF1 pojačao ekspresiju MHC-I kao odgovor na IFN, a Hsf1 je mehanička meta KRIBB11 za regulaciju MHC-I. S obzirom da je HSF1 utjecao na ekspresiju MHC-I, pretpostavili smo da HSF1 regulira antitumorski imunitet in vivo. Da bismo testirali ovu hipotezu, inokulirali smo kontrolne i shHsf1 YUMM1.7 tumorske ćelije u NSG i C57BL/6 miševe. Uočili smo da je utišavanje HSF1 djelimično usporilo YUMM1.7 progresiju tumora kod NSG miševa (slika 6j), potvrđujući da je Hsf1 pomogao u održavanju homeostaze proteina i progresije tumora u imunodeficijentnom modelu. Međutim, utišavanje Hsf1 dramatično je ubrzalo rast YUMM1.7 tumora kod divljeg tipa C57BL/6 miševa (slika 6k). Podaci pokazuju da Hsf1 može iznenađujuće promovirati snažan antitumorski imunitet u imunokompetentnom modelu. U prilog tome, otkrili smo smanjenje procenta CD3+, Ki67+, IFN + i TNF + T ćelija koje infiltriraju tumor (slika 6l i prošireni podaci slika 8e) u shHsf1 YUMM1.7 tumori u poređenju sa shFluc scramble kontrolama. Osim toga, inokulirali smo shHsf1 CT26 ćelije u divljeg tipa BALB/c miševa. Opet, utišavanje Hsf1 rezultiralo je pojačanim rastom tumora CT26 (Prošireni podaci, slika 8f). Ovo je bilo praćeno smanjenjem procenta CD3+, Ki67+, IFN + i TNF + T ćelija koje infiltriraju tumor (prošireni podaci, slika 8g, h). Sve u svemu, podaci sugeriraju da osovina GBP-HSF1 pokreće ekspresiju MHC-I i antitumorski imunitet. Da bismo mehanički povezali Hsf1 i LIMIT, utišali smo LIMIT u A375 ćelijama. Utišavanje LIMIT-a smanjilo je transkripcionu aktivnost HSF1 kao odgovor na IFN, što je utvrđeno testom luciferaze reporter (HSE-luc) (slika 6m). Podaci pokazuju da LIMIT doprinosi aktivaciji HSF1 kao odgovoru na IFN. Da bismo testirali potencijalno učešće HSF1 u LIMIT posredovanoj indukciji MHC-I, stimulisali smo LIMIT preko CRISPR aktivacije u B16 ćelijama, u prisustvu KRIBB11. Primetili smo da je povećanje regulacije MHC-I, izazvano LIMIT-aktivacijom, poništeno inhibitorom HSF1 (slika 6n). Podaci sugeriraju da LIMIT pojačava ekspresiju MHC-I na HSF{184}}zavisan način. Konačno, analizirali smo vezu između LIMIT-a, GBP-a i HSF1 u kontekstu ekspresije MHC-I, imunosti tumora i imunoterapije kod pacijenata sa rakom. Klinička analiza je pokazala da su HSF{187}}signalni geni u korelaciji sa ekspresijom MHC-I, infiltracijom CD8+ T ćelija i preživljavanjem pacijenata (prošireni podaci, slika 9a-c). U studiji blokade imunoloških kontrolnih tačaka kod pacijenata sa karcinomom bazalnih ćelija34, analiza sekvencioniranja jednoćelijske RNA otkrila je 2 klastera tumora; jedan tumorski klaster je bio osjetljiviji na anti-PD-1 tretman, što pokazuje značajno smanjena populacija tumora (Prošireni podaci, slika 9d). Zanimljivo je da je ovaj klaster tumora osjetljiv na imunološku kontrolnu tačku eksprimirao više nivoe HSF1-signalnih gena, kao i MHC-I genske mašinerije (prošireni podaci, slika 9e). Štaviše, u studiji blokade imunološke kontrolne tačke kod pacijenata sa melanomom35, proteomska analiza je pokazala da je ekspresija proteina GBPs, HSF1 signalnih gena i MHC-I bila veća kod kliničkih pacijenata nego kod onih koji nisu odgovorili (Prošireni podaci, slika 9f). Pored toga, uočili smo pozitivnu korelaciju između GBP1 i HSF1-signalnih gena kod ljudskih karcinoma (Prošireni podaci, slika 9g). Podaci potvrđuju da os LIMIT-GBP-HSF1 može aktivirati ekspresiju MHC-I i favorizirati antitumorski imunitet (Prošireni podaci, slika 10).

Diskusija

Kineska biljka cistanche biljka-antitumor

Ljudi imaju 30,000-60,000 lncRNA. Međutim, identiteti i biološke funkcije velike većine ovih potencijalnih lncRNA ostaju slabo shvaćeni. U polju biologije raka, lncRNA su uglavnom proučavane u imunodeficijentnom modelu, ostavljajući prazninu u znanju o lncRNA u kontekstu imunog sistema. Izvještava se da nekoliko lncRNA utječe na funkciju imunoloških stanica36,37, progresiju raka i efikasnost kemoterapije38,39. Međutim, ostaje neodgovoreno da li su specifične lncRNA uključene u antitumorski imunitet i imunoterapijski odgovor. U ovoj studiji, identifikovali smo da je LIMIT prethodno nekarakteristična lncRNA koja reaguje na IFN u ljudskim i mišjim ćelijama. LIMIT može inducirati ekspresiju MHC-I i MHC-II, promovišući imunološki odgovor tumora posredovan T ćelijama i povećavajući efikasnost imunoterapije. Dakle, LIMIT je ranije nepoznata tumorska imunogena lncRNA. IFN signalni put igra ključnu ulogu u određivanju terapijskog odgovora na imunoterapiju raka40 putem više mehanizama19,20,41,42. Genetske mutacije u IFN signalnim genima doprinose otpornosti na blokadu kontrolnih tačaka kod pacijenata sa rakom43-48. Međutim, IFN signalizacija može inducirati inhibitornu ekspresiju PD-L149. Stoga je idealno identificirati i ciljati ključni gen za signalizaciju IFN-a koji selektivno posreduje antitumorski imunitet, a ne izbjegavanje tumorskog imuniteta. U skladu s ovim pojmom, demonstriramo da LIMIT posreduje u povećanju regulacije MHC-I i MHC-II, ali ne utiče na ekspresiju PD-L1 kao odgovor na IFN. Stoga, LIMIT može biti jedinstveno pozicioniran da bude imunogena meta za imunoterapiju raka. Predloženo je nekoliko strategija za terapeutski ciljanje patogenih lncRNA50. Međutim, kako podići nivoe korisnih lncRNA ostaje izazov. Kako lncRNA koje djeluju cis djeluju lokalno, prisilna ekspresija ovih lncRNA može biti nesposobna za precizno lociranje51. Dok trans-djelujuće lncRNA mogu funkcionirati kroz specifične sekundarne strukture, prekomjerna ekspresija ovih lncRNA možda neće moći generirati njihove prirodne strukture zbog nedostatka odgovarajućih RNA chaperona52. Koristeći RNA vođenu CRISPR strategiju aktivacije22, direktno smo aktivirali LIMIT ekspresiju u tumorskim ćelijama u pretkliničkim modelima. Aktivacija CRISPR LIMIT-a vođena RNA može pokrenuti ekspresiju tumorskog MHC-I i potencirati terapiju blokadom kontrolnih tačaka. S obzirom da se gubitak MHC-I i IFN genskih potpisa često javlja kod ljudskih tumora, predlažemo da CRISPR aktivacija korisnih lncRNA, kao što je LIMIT, može spasiti ekspresiju tumorskog MHC-I i biti potencijalni terapijski pristup. Dok smo u potrazi za mehanizmom kojim LIMIT utiče na imunitet tumora, razjasnili smo da LIMIT cilja GBP na cis način. GBP igraju ulogu u urođenom imunitetu26,53,54. Miševi kojima nedostaje cijeli klaster Gbps pokazuju loš odgovor protiv Toxoplasma gondii55. Međutim, prije našeg rada, mehanička veza između LIMIT-a i GBP-a, te biološka funkcija GBP-a u imunoterapiji tumora i imunoterapiji bili su neutvrđeni. Otkrili smo da su GBP potrebni za IFN-indukovanu tumorsku MHC-I ekspresiju, efikasnost ubijanja CD8+ T ćelija i efikasnu terapiju kontrolnih tačaka. Podaci sugeriraju da su GBP potencijalni ciljni geni za povećanje imunogenosti tumora. Neočekivano smo otkrili da GBP aktiviraju HSF1 kako bi stimulirali ekspresiju gena povezanu s MHC-I i MHC-I. Aktivacija HSF1 posredovana inhibitorima HSP90 korelira sa kontrolom tumora kod imunokompetentnih modela. Međutim, uprkos višestrukim kliničkim ispitivanjima sa inhibitorima HSP90, FDA do sada nije odobrila nijedan od procenjenih inhibitora HSP90 za terapiju raka. Ova razočaravajuća činjenica otvara mogućnost da inhibitori HSP90 mogu biti štetni za imunitet tumora. Toksičnost ovih inhibitora HSP90 može potaknuti uništavanje nekoliko HSP90 klijentskih proteina, kao što su RAF1 i BCL2, koji mogu biti kritični za proliferaciju i preživljavanje efektorskih T ćelija59,60. S obzirom na to da GBP-ovi stupaju u interakciju sa HSP90 i oslobađaju HSP90-mamljeni HSF1, ali ne mijenjaju aktivnost HSP90, naši podaci sugeriraju da ciljanje GBP-a može biti ranije necijenjena i sigurna strategija za aktiviranje HSF1 za imunoterapiju raka. Ukratko, identifikujemo LIMIT kao ranije nepoznatu imunogenu lncRNA protiv raka. Naš rad sugerira da ciljanje LIMIT-GBP-HSF1 signalne ose može spasiti ekspresiju i funkciju MHC-I, predstavljajući obećavajući imunoterapeutski pristup raka.

Metode

Eksperimenti na životinjama

Ženka NSG stara od šest do osam sedmica (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stock# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stock# 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stock# 000651) i OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) miševi su dobijeni iz Jackson Laboratory. Svi miševi su održavani u uslovima bez patogena. Prostorija za životinje ima kontroliranu temperaturu (18-23 stepen), vlažnost (40-60%) i ciklus od 12 svjetla/12 tama. YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2,5 × 106) i B16 (1 × 105) ćelije su supkutano ubrizgane u desni bok miševa. Za liječenje anti-PD-L1 na modelu MC38, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) i kontrolno antitijelo (InVivoMAb, LTF-2) su intraperitonealno primijenjene 6., 9. dana, i 12 nakon inokulacije tumora. Za liječenje anti-PD-L1 na modelu B16, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) i kontrolno antitijelo (InVivoMAb, LTF-2) su intraperitonealno primijenjene 0, 3. 6, 9, 12 i 15 nakon inokulacije tumora. Prečnik tumora je meren pomoću čeljusti. Volumen tumora je izračunat pomoću dužine × širine × širine/2. Studije na životinjama sprovedene su uz odobrenje Institucionalne komisije za negu i upotrebu životinja na Univerzitetu Mičigen (PRO00008278). Studija je u skladu sa svim relevantnim etičkim propisima koji se tiču ​​istraživanja na životinjama. Ni u jednom od eksperimenata veličina tumora ksenografta nije premašila 2 cm u bilo kojoj dimenziji i nijedna životinja nije imala tešku abdominalnu distenziju (veću ili jednaku 10% prvobitnog povećanja tjelesne težine). Veličina uzorka je odabrana na osnovu preliminarnih podataka. Nakon inokulacije tumora, miševi su randomizirani i raspoređeni u različite grupe za liječenje.

Reagensi

KRIBB11 i 17-AAG su kupljeni od Cayman Chemical. MG-132, Puromycin i Luperox su bili iz Sigma-Aldrich. Rekombinantni ljudski IFN (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) i mišji IFN (485-MI) su iz R&D.

Plazmidi

Za generiranje HSE-LUC, DNK sekvence koje odgovaraju elementima toplotnog šoka (HSE) su sintetizirane, žarene i ligirane u PGL3-bazni (Promega) plazmid. FLAG-HSF1 je poklon Stuarta Calderwooda (Addgene #32537). Za prisilnu ekspresiju humanog GBP1, GBP2, GBP5 i mišjeg Gbp2, odgovarajuće kodirajuće sekvence su PCR amplificirane iz cDNA generirane iz IFN prethodno tretiranih A375 ćelija ili B16 ćelija i potom umetnute u PCI-Flag plazmid. PCI-Flag plazmid je pripremljen umetanjem sljedeće Kozak sekvence plus Flag tag plus 5 × Glycine sekvence u PCI-neo (Promega) plazmid između NheI i XhoI. Da bi se srušio ljudski LIMIT i mišji LIMIT, shRNA su dizajnirane i ubačene u plazmid PLKO.1 (Addgene #10879). shRNA usmjerena na luciferazu krijesnice (shFluc) služila je kao negativna kontrola. Da bi se ciljalo promotorsko područje Limita za aktivaciju CRISPR-a, sgRNA (sgLimit) su dizajnirane i umetnute u phU6- sgRNA plazmid (Addgene #53188). Neciljana sgRNA (sgNT) služila je kao negativna kontrola. Za brisanje STAT1/IRF1 veznih mjesta u LIMIT promotoru, uparene sgRNA (psgLIMIT) su dizajnirane i umetnute u plazmid PX459 (Addgene #48139). Da bi se srušili mišji Hsf1 i Gbp2, dizajnirane su shRNA i umetnute u plazmid PLKO.1 (Addgene #10879). Da bi se izbacio GBP1-5, sgRNA je dizajnirana i ubačena u plazmid PX459 (Addgene #48139). Ciljne sekvence su navedene u Dodatnoj tabeli 7. Sekvence prajmera navedene su u Dodatnoj tabeli 8.

Cell Culture

Ćelijska linija ljudskog melanoma A375 (CRL-1619), ćelijske linije mišjeg melanoma, B16-F0 (CRL-6322) i YUMM1.7 (CRL-3362 ), ćelijska linija raka debelog crijeva miša CT26 (CRL-2638) i 293T (CRL-3216) kupljeni su od American Type Culture Collection (ATCC). Ćelijska linija raka debelog crijeva miša MC38 je prethodno korištena u Zou laboratoriji23,48. B16- OVA ćelije su uspostavljene kao što je ranije objavljeno42. A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO i A375 LIMIT promotorske delecione ćelijske linije su generisane u ovoj studiji. Sve ćelijske linije su rutinski testirane na kontaminaciju mikoplazmom i potvrđeno je negativno na mikoplazmu. Ćelije su kultivisane u RMPI medijumu (Gibco #11875) sa dodatkom 10% FBS, osim A375 i 293T ćelija, poslednje 2 linije su uzgajane u DMEM (Gibco #11965) sa dodatkom 10% FBS. Sve ćelije su održavane na 37 stepeni i 5% CO2. Za toplotni šok, ćelije su stavljene u inkubator na 43 stepena i 5% CO2 na 2 sata. Za generiranje knockdown staničnih linija, lentivirusne čestice su proizvedene transfekcijom PLKO.1 shRNA plazmida sa psPAX2 (Addgene #12260) i pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) u 293T ćelije, a zatim transducirane u tumor ćelije sa polibrenom (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) preko noći. 48 sati nakon transfekcije, ćelije su odabrane sa puromicinom (1-2 ug/ml) za dodatne 2 sedmice. Da bi se uspostavile knock-out ćelijske linije, plazmidi PX459- sgRNA su transficirani u tumorske ćelije 2 dana i odabrani puromicinom (1-2 ug/ml) dodatna 2 dana. Ćelije su zatim serijski razrijeđene i posađene u ploče sa 96 jažica. Nakon 2-3 sedmica, jednoćelijske kolonije su odvojene i ponovo postavljene u ploče sa 6 jažica. Nakon spajanja ćelija, polovina ćelija je sakupljena i validirana za nokaut (KO) efikasnost putem Western blotinga. Da bi se primijenio sistem aktivacije CRISPR za aktiviranje ograničenja miša, phU6-sgRNA su transficirane zajedno sa SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) u B16 ćelije. Sve transfekcije su provedene s lipofectaminom 2000 (Thermofisher) u omjeru od 1 ug plazmida: 2 ul regensa za transfekciju. Doza transfekcije određena je titracijom.

Test aktivnosti luciferaze

A375 ćelije su transficirane sa HSE-LUC i PRL-SV40P (Addgene #27163) tokom 24 sata, zajedno sa PCI-neo (vektor) ili GBP1, GBP2 tokom 48 sati. A375 shFluc ili A375 shLIMIT ćelije su transfektovane sa HSE-LUC i PRL-SV40P (Addgene #27163) tokom 24 sata, a zatim tretirane sa IFN dodatnih 48 sati. Aktivnost luciferaze za luciferazu krijesnice (HSE-LUC) i luciferazu renila (PRL-SV40P) mjerena je pomoću Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Relativna aktivnost luciferaze krijesnice je normalizovana sa aktivnošću luciferaze renile.

Površinsko bojenje i analiza protočne citometrije (FACS)

Ćelije su tripsinizirane i isprane MACS puferom (PBS, 2%FBS, 1 mM EDTA). Površinsko bojenje je izvedeno dodavanjem sljedećih antitijela u ćelijsku suspenziju u 50 ul MACS pufera: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) i anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Nakon inkubacije od 30 minuta, ćelije su isprane MACS puferom i analizirane na BD Fortessa protočnom citometru.

Kvantitativna PCR (qPCR) analiza

Ukupna RNK je izolovana iz ćelija prečišćavanjem na koloni (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) uz tretman DNase. cDNA je sintetizirana korištenjem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) sa nasumičnim heksamernim prajmerima. Kvantitativni PCR (qPCR) je izveden na cDNK koristeći Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) na StepOnePlus PCR sistemu u realnom vremenu (Thermo Fisher Scientific). Ekspresija gena je kvantificirana korištenjem prajmera navedenih u Dodatnoj tabeli 8. Promjene nabora u ekspresiji mRNA izračunate su ΔΔCt metodom koristeći ACTB kao endogenu kontrolu. Rezultati su izraženi kao promjena puta normalizacijom na kontrole.

Northern blotting

Northern blot analiza je izvedena sa 10 ug ukupne RNK pripremljene iz IFN, IFN i TNF prethodno tretiranih A375 ćelija. RNK su razdvojene elektroforezom denaturirajućeg agaroznog gela (Ambion) i prebačene na Hybond-XL membrane (GE Healthcare). LIMIT je detektovan korišćenjem DNK sondi obeleženih digoksinom sa DIG Northern Starter Kitom (Roche). Sekvence sonde koje ciljaju LIMIT navedene su u dodatnoj tabeli 7.

Rapid Amplification of cDNK ends (RACE)

RACE je izveden da bi se identificirali krajevi cDNK ljudskog LIMIT-a ili mišjeg limita sa SMARTer RACE kompletom za amplificiranje cDNA (Clontech). Prajmeri za RACE su navedeni u dodatnoj tabeli 8.

Klon pune dužine LIMIT

Nakon dobijanja krajnjih sekvenci cDNK, LIMIT pune dužine je PCR amplificiran i umetnut u PCI-neo plazmid između XhoI i NotI. Klonski prajmeri za ljudski LIMIT i limit miša navedeni su u dodatnoj tabeli 8.

Frakcioniranje ćelija za RT-PCR

IFN prethodno tretirane A375 ćelije su sakupljene sa ploča od 15 cm struganjem i jednom isprane hladnim PBS. Ćelije su peletirane centrifugiranjem na 700 g tokom 5 minuta i lizirane puferom za hipotoničnu lizu (10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3% (vol/vol) NP{{ 12}}, 10% (vol/vol) glicerol) za sakupljanje citoplazmatske frakcije. Citoplazmatska RNK je dobijena precipitacijom etanolom preko noći na -20 stepeni, nakon čega je uslijedila re-ekstrakcija pomoću TRIZOL reagensa. Preostali nuklearni pelet je tri puta ispran puferom za hipotoničnu lizu, nakon čega je uslijedila ekstrakcija TRIZOL reagensom prema uputama proizvođača. RNK izolovane iz nuklearnih ili citoplazmatskih frakcija su reverzno transkribovane i RT-PCR za LIMIT sa naznačenim prajmerima. Nespleteni ili zreli ACTB korišteni su kao kontrole za nuklearnu ili citoplazmatsku RNK. Prajmeri za ACTB su navedeni u dodatnoj tabeli 8.

Western blotting

Ćelije su isprane u hladnom PBS-u i lizirane u 1 x RIPA puferu za lizu (Pierce) sa 1 x inhibitorom proteaze (Pierce). Lizati su inkubirani na ledu 10 minuta i očišćeni centrifugiranjem na 15,000g 15 minuta. Koncentracija proteina je kvantificirana korištenjem kompleta za analizu proteina BCA (Thermo Fisher). Trideset mikrograma proteina je pomešano sa puferom za uzorke (Thermo Fisher) sa -ME i denaturisano na 95 stepeni 5 minuta. Uzorak je odvojen pomoću SDS-PAGE i prebačen u nitroceluloznu membranu (Bio-Rad). Membrane su blokirane sa 5% w/v nemasnog suvog mleka i inkubirane sa primarnim antitelima preko noći na 4 stepena i HRP-konjugovanim sekundarnim antitelima (CST) 1 sat na sobnoj temperaturi. Signal je detektovan korišćenjem Clarity and Clarity Max Western ECL Blotting supstrata (Bio-Rad) i uhvaćen pomoću ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Antitijela su bila sljedeća: anti-humani GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1:500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1:1,000), anti-fosfo HSF1 (Abcam , 76076, 1:1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1:1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1:1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1:1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1:1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1:1 ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000) i anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5,000). Za humani MHC-I Western blotting, ukupni ćelijski lizati su denaturirani u puferu za uzorke bez -ME (nereducirajući) kako bi se održali disulfidni mostovi i konformacija proteina koja se otkriva anti-HLA-ABC antitijelom (W6/32 , Novus Biologicals, 64775, 1:1000).

Ko-imunoprecipitacija (Co-IP)

Ćelije su sakupljene sa IP puferom za lizu (Pierce, 87787) plus inhibitorom proteaze. Koncentracija proteina je određena pomoću kompleta za analizu proteina BCA. Uzorci proteina od 200-500 ug dodani su 1-3 ug primarnim antitijelima anti-HSP90 (Proteintech, 13171) ili anti-HSF1 (CST, 12972) i inkubirani uz lagano ljuljanje na 4 stepena preko noći. Zatim su uzorci dalje inkubirani sa 20 ul Protein A/G PLUS-agaroze (Santa Cruz, sc-2003) tokom 2 sata na 4 stepena; i centrifugiran na 7500 × g 30 sekundi na 4 stepena. Ćelijske pelete su isprane 4 puta sa IP puferom za lizu, resuspendovane sa 40 ul 2 x pufera za uzorke sa -ME i zagrejane 5 minuta na 95 stepeni. Uzorci denaturiranih proteina analizirani su Western blot-om. Za Flag IP, ćelijski lizati su inkubirani sa 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) i isprani, denaturirani i analizirani kako je gore opisano.

Imunofluorescentno bojenje

A375 ćelije postavljene na pokrovno staklo tretirane su IFN-om 24 sata. Nakon 2 puta ispiranja sa PBS, ćelije su fiksirane sa 4% PFA tokom 15 minuta i isprane 2 puta sa PBS po 5 minuta svaka. Zatim su ćelije permeabilizirane sa 0.5% triton x-100 u PBS-u 10 minuta i isprane 2 puta sa PBS-om po 5 minuta svaka. Antigeni su blokirani sa 10% normalnog kozjeg seruma u PBS-u 30 minuta. Zatim su dodana primarna antitela u razblaženjima 1:50 mišjeg anti-humanog GBP1-5 antitela (Santa Cruz, 166960) ili zečjeg anti-humanog HSP90 antitela (CST, 4877), i inkubirana na 4 stepena preko noći. Nakon toga, ćelije su isprane i inkubirane sa 1:500 razblaženja Qdot 605 označenog sekundarnog kozjeg anti-mišjeg antitijela (Thermo Fisher, Q11002) ili AF488-obilježenog sekundarnog kozjeg anti-zečjeg antitijela (Thermo Fisher, A11034), a zatim se montira na staklene pločice sa ProLong Gold reagensom koji sadrži DAPI. Slike konfokalne fluorescencije su prikupljene korišćenjem 63X objektiva za uranjanje u ulje (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Imunoprecipitacija hromatina (ChIP)

ChIP-ovi su izvedeni sa umreženim hromatinom iz ćelija A375 tretiranih IFN-om i bilo HSF1 antitijelom (CST, 12972) ili normalnim zečjim IgG (CST, 2729), korištenjem Simple ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (magnetne kuglice) (CST, 9005). Obogaćena DNK je kvantificirana PCR-om u realnom vremenu korištenjem prajmera navedenih u Dodatnoj tabeli 8. Količina imunoprecipitirane DNK u svakom uzorku predstavljena je kao signal u odnosu na ukupnu količinu ulaznog hromatina, što je ekvivalentno 1.

Izolacija OT-I ćelija i ko-kultura sa OVA+ tumorskim ćelijama

C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) miševi (JAX stock #003831) kupljeni su od The Jackson Laboratory. Slezena je homogenizovana, a pojedinačne ćelije su suspendovane u 2 ml pufera za lizu crvenih krvnih zrnaca (Sigma-Aldrich) tokom 1 minute. Splenociti su peletirani, isprani i resuspendirani u količini od 2 × 106 ćelija po ml u mediju za kulturu RPMI koji sadrži 1 ug/ml OVA257-264 peptida, 5 ug/ml mišjeg rekombinantnog IL-2 i 40 μM { {15}} merkaptoetanol. Ćelije su inkubirane na 37 stepeni 5 dana. Da bi se uspostavila ko-kultura OT-I i OVA+ tumorskih ćelija, splenociti su sakupljeni nakon 5-dnevne aktivacije. OT-I ćelije su pročišćene korištenjem EasySep miša CD8+ T Cell Isolation Kit (Stemcell). B16-OVA ćelije su zasijane preko noći. OT-I ćelije su zatim dodane u kulturu u različitim omjerima. Sve ćelije su sakupljene tripsinizacijom i analizirane protočnom citometrijom (FACS).

Dendritične ćelije izvedene iz koštane srži (BMDC) i makrofagi (BMDM)

Koštana srž je izolovana iz femura miša C57BL/6 i kultivisana u kompletnoj podlozi RPMI1640 sa 20 ng/ml GM-CSF (R & D). Ćelije su inkubirane na 37 stepeni i 5% CO2. Dodatnih 10 ml medijuma sa 20 ng/ml GM-CSF-a dodato je 3. dana. Dana 7. neadherentne i slabo adherentne ćelije u supernatantu kulture sakupljene su blagim ispiranjem sa PBS-om i smatrane su BMDC. Adherentne ćelije su smatrane BMDM.

Profiliranje intratumoralnih imunoloških ćelija

Za kvantificiranje intratumoralnih T ćelija i ekspresije efektorskih citokina T ćelija, jednoćelijske suspenzije su pripremljene od svježih tumorskih tkiva fizičkim prolaskom kroz 100 μm ćelijske cjediljke. Imunske ćelije su obogaćene centrifugiranjem u gradijentu gustine. Za bojenje citokina, intratumoralne imune ćelije su inkubirane u mediju kulture RPMI koji sadrži PMA (5 ng/ml), jonomicin (500 ng/ml), brefeldin A (1:1,000) i Monessen (1:1 ,000) na 37 stepeni tokom 4 sata. 2-3 ul Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD Biosciences), anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) i anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) antitijela su dodana 20 minuta za površinsko bojenje. Ćelije su zatim isprane i resuspendovane u 1 ml sveže pripremljenog rastvora Fix/Perm (BD Biosciences) na 4 stepena preko noći. Nakon ispiranja sa Perm/Wash puferom (BD Biosciences), ćelije su obojene sa 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), i anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) 30 minuta, isprani i fiksirani u 4% formaldehidu (Sigma Aldrich). Svi uzorci su očitani na LSR Fortessa citometru i analizirani pomoću softvera FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Izračunavanje rezultata potpisa

Koristili smo normalizovanu ekspresiju gena da definišemo sledeće potpise: infiltracija CD8+ T ćelija (CD8A, CD8B, PRF1 i GZMB), MHC-I ekspresija (HLA-A, HLA-B i HLA-C) , i HSF1 signalizacija (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 i HSP90B1).

Statistička analiza

Za eksperimente bazirane na ćelijama, biološki triplikati su izvedeni u svakom pojedinačnom eksperimentu općenito, osim ako nije drugačije navedeno. Za studije na životinjama korišćeno je ne manje od 5 ponavljanja po grupi. Životinje su randomizirane u različite grupe nakon inokulacije tumorskih stanica. Istraživači nisu bili zaslijepljeni raspodjelom tokom eksperimenata i procjene ishoda. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti sa standardnim izvođenjem. Statistička analiza je izvršena korišćenjem softvera GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Dvostrani 2--strani t-test je korišten za poređenje tretiranih grupa sa kontrolnim grupama; Funkcija preživljavanja je procijenjena Kaplan–Meierovim metodama, a za izračunavanje statističkih razlika korišten je log-rank test.

Dostupnost podataka

Podaci RNA-seq (GSE99299) i obrađeni jednoćelijski podaci (GSE123814) su dobijeni iz Gene Expression Omnibusa (GEO). Podaci MS proteomike (PXD006003) su dobijeni iz PRIDE repozitorija. TCGA skupovi podataka o raku dobijeni su od UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). RNA-seq podatke i kliničke informacije za ICB klinička ispitivanja dali su odgovarajući autori. Svi neobrađeni podaci koji podržavaju nalaze ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na zahtjev. Izvorni podaci dati su u ovom radu.

Dostupnost koda

Sve analize korištene u ovoj studiji obavljene su slijedeći priručnike Prism Graphpad verzije 8.0 i online web stranicu na adresi http://xena.ucsc.edu/. Nijedan novi kod ili algoritmi nisu razvijeni tokom ove studije.

Prošireni podaci

Prošireni podaci Slika 1:

LIMIT korelira sa efektorskim imunim genima kod više vrsta raka.

Prošireni podaci Slika 2:

Genetski lokusi i sekvence ljudskog LIMIT-a i mišjeg limita.

Prošireni podaci Slika 3: LIMIT povećava MHC-1 izraz

Prošireni podaci Slika 5:

LIMIT povećava ekspresiju MHC-1 napunjenog antigenom in vivo.

Prošireni podaci Slika 6:

LIMIT cis-aktivira GBP za jačanje MHC-1 i imuniteta na tumor.

Prošireni podaci Slika 7:

GBP aktiviraju HSF1 da stimulišu ekspresiju MHC-I.

Prošireni podaci Slika 8:

HSF1 pokreće ekspresiju MHC-I i imunitet tumora.

Prošireni podaci Slika 9:

HSF1 signalni geni su u korelaciji sa MHC-I i imunitetom tumora.

Prošireni podaci Slika 10: Šema koja pokazuje kako os LIMIT-GBP-HSF1 utječe na MHC-I i imunitet tumora

Dodatni materijal

Pogledajte web verziju na PubMed Central za dodatni materijal.

Priznanja

Zahvaljujemo članovima Zou laboratorije na njihovom intelektualnom doprinosu. Ovaj rad je dijelom podržan od strane grantova za istraživanje iz US NIH/NCI R01 grantova (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) i (CA216919, CA213566, CA213566, 85 NIH20), iz Michigan Rogel Cancer Center Grant (CA46592).

Reference

1. Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) i PD-1 blokada puta za terapiju raka: Mehanizmi, biomarkeri odgovora i kombinacije. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigeni u imunoterapiji raka. Science 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I & Garrido F MHC klase I antigeni, imunološki nadzor i bijeg od tumora. J Cell Physiol 195, 346–355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC antigeni i malignitet. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T Hitna potreba za oporavkom MHC klase I kod karcinoma radi efikasne imunoterapije. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC et al. Atlas ljudskih dugih nekodirajućih RNK ​​sa preciznim 5' krajevima. Nature 543, 199–204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Duge nekodirajuće RNA: uvid u funkcije. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Evolucija i funkcije dugih nekodirajućih RNA. Cell 136, 629–641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Duge nekodirajuće RNK: funkcionalna iznenađenja iz svijeta RNK. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT Duge nekodirajuće RNK: prošlost, sadašnjost i budućnost. Genetics 193, 651–669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Duge nekodirajuće RNK u programiranju i reprogramiranju ćelijske sudbine. Cell Stem Cell 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Nova uloga lncRNA u raku. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. GENCODE referentna napomena za genome ljudi i miša. Nukleinske kiseline Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N et al. Evolucija tumora i mikrookruženja tokom imunoterapije Nivolumabom. Cell 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W et al. Genomske i transkriptomske karakteristike odgovora na anti-PD-1 terapiju u metastatskom melanomu. Cell 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM et al. Genomski korelati odgovora na blokadu CTLA-4 kod metastatskog melanoma. Science 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T et al. Somatske mutacije i neoepitopska homologija u melanomima liječenim CTLA{1}} blokadom. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Sistematske analize novog potpisa povezanog sa lncRNA kao prognostičkog biomarkera za hepatocelularni karcinom. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH et al. Demonstracija sistema za nadzor tumora zavisnog od interferona gama kod imunokompetentnih miševa. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Prezentacija Fruh K & Yang Y antigena pomoću MHC klase I i njegova regulacija interferonom-gama. Curr Opin Immunol 11, 76–81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H et al. B7-H1 povezan sa tumorom potiče apoptozu T-ćelija: potencijalni mehanizam imunološke evazije. Nat Med 8, 793–800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. Aktivacija gena vođena RNA pomoću CRISPR-Cas9-baziranih transkripcijskih faktora. Nat Methods 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H et al. Ekspresija PD-L1 domaćina određuje efikasnost regresije tumora posredovane blokadom puta PD-L1. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q & Prasanth KV Nuklearne duge nekodirajuće RNA: ključni regulatori ekspresije gena. Trends Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Interferonska indukcija proteina fibroblasta sa aktivnošću vezivanja gvanilata. J Biol Chem 258, 7746–7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH i dr. Interferonom inducirani proteini koji vežu gvanilat u aktivaciji inflamasoma i odbrani domaćina. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X et al. PROMO: otkrivanje poznatih regulatornih elemenata transkripcije pomoću pretraživanja prilagođenih vrstama. Bioinformatics 18, 333–334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Konzorcijum, EP Integrisana enciklopedija DNK elemenata u ljudskom genomu. Nature 489, 57–74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Čuvar proteostaze kod raka. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Aktivatori malih molekula reakcije toplotnog šoka: hemijska svojstva, molekularne mete i terapeutsko obećanje. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Represija aktivacije faktora transkripcije HSF1 toplotnog šoka pomoću HSP90 (kompleks HSP90) koji formira kompleks osjetljiv na stres sa HSF1. Cell 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Regulacija faktora toplotnog šoka kod sisara 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 i praćenje raka. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE et al. Klonska zamjena tumor-specifičnih T ćelija nakon PD-1 blokade. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M et al. Proteomika odgovora melanoma na imunoterapiju otkriva mitohondrijalnu zavisnost. Cell 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA Duge nekodirajuće RNK u regulaciji imunološkog odgovora. Trends Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Duge nekodirajuće RNA u regulaciji imunološkog odgovora i obučenog imuniteta. Front Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY Duge nekodirajuće RNA u putevima raka. Cancer Cell 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT et al. LncRNA GClnc1 promoviše karcinogenezu želuca i može djelovati kao modularni okvir kompleksa WDR5 i KAT2A za specificiranje obrasca modifikacije histona. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Primarna, adaptivna i stečena rezistencija na imunoterapiju raka. Cell 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D et al. Epigenetsko utišavanje hemokina tipa TH1- oblikuje imunitet tumora i imunoterapiju. Nature 527, 249–253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W et al. CD8(+) T ćelije regulišu feroptozu tumora tokom imunoterapije raka. Nature 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J et al. Gubitak gena IFN-gama puta u ćelijama tumora kao mehanizam rezistencije na anti-CTLA-4 terapiju. Cell 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. Mutacije povezane sa stečenom rezistencijom na PD-1 blokadu u melanomu. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT et al. In vivo CRISPR skrining identifikuje Ptpn2 kao metu imunoterapije raka. Nature 547, 413–418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS et al. Primarna rezistencija na PD-1 blokadu posredovanu JAK1/2 mutacijama. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A et al. Stečena otpornost na IFNgamma narušava antitumorski imunitet i dovodi do lezija melanoma otpornih na T ćelije. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J et al. Mutacije epigenetičkih pokretača u ARID1A oblikuju imuni fenotip raka i imunoterapiju. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL et al. Signalizacija tumorskog interferona reguliše program multigenske rezistencije na blokadu imunološke kontrolne tačke. Cell 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​Terapijsko ciljanje dugih nekodirajućih RNA kod raka. Trends Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Regulacija ekspresije gena dugim nekodirajućim RNA s cis djelovanjem. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Izazovi i perspektive za strukturnu biologiju lncRNA-primjer Xist lncRNA A-ponavlja. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR et al. GBP5 promovira sklapanje inflamasoma NLRP3 i imunitet kod sisara. Science 336, 481–485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Interferonom inducirani gvanilat-vezujući proteini: Čuvari odbrane domaćina u zdravlju i bolesti. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M et al. Grupa interferon-gama inducibilnih p65 GTPaza igra ključnu ulogu u odbrani domaćina od Toxoplasma gondii. Immunity 37, 302–313, doi:10.1016/j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM et al. Inhibicija HSP90 pospješuje imunoterapiju raka regulacijom gena odgovora na interferon. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF Ciljanje proteina toplotnog šoka 90 (HSP90) kao komplementarna strategija blokadi imunološke kontrolne tačke za terapiju raka. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A et al. Klinička evaluacija i profiliranje biomarkera inhibitora Hsp90. Metode Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J et al. Prekomjerna ekspresija Bcl-2 povećava preživljavanje T-ćelija specifičnog za tumor. Cancer Res 65, 2001–2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H et al. Raf-1 je neophodan za proizvodnju IL2 T-ćelija. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]