Osa hepcidina/feroportina bubrega kontroliše reapsorpciju gvožđa i određuje veličinu bubrežnog i sistemskog preopterećenja gvožđem
Mar 02, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1 i Samira Lakhal-Littleton1
KLJUČNE RIJEČI:feroportin; hemohromatoza; hepcidin; željezo; preopterećenje gvožđem;bubrežnitubule
Feroportin (FPN) je jedini poznati protein za izvoz željeza kod sisara. Posreduje oslobađanje gvožđa u cirkulaciju iz duodenalnih enterocita i retikuloendotelnih makrofaga slezene, odgovarajućih mesta apsorpcije i recikliranja gvožđa.1,2 FPN-posredovano oslobađanje gvožđa je antagonizovano hormonom hepcidinom, takođe poznat kao hepcidin antimikrobni peptid (AMPHH). Proizveden prvenstveno u jetri, hepcidin se vezuje za i indukuje internalizaciju FPN-a, čime ograničava otpuštanje gvožđa u cirkulaciju i njegovu dostupnost perifernim tkivima.3,4 Dakle, HAMP/FPN osa funkcioniše na mestima apsorpcije i reciklaže kako bi kontrolisala sistemske homeostaza gvožđa.
Bubreg je mjesto reapsorpcije željeza. I gvožđe koje nije vezano za transferin i za transferin može preći u glomerularni fifiltrat.5 Velika većina ovog gvožđa se vraća nazad u tubularni epitel. Nekoliko transportera je uključeno u ovo ponovno preuzimanje, uključujući multiligandni megalin-kubilinski receptorski kompleks, transferin receptor 1, transporter dvovalentnog metala 1, transporter cinka ZIP8 i transporter cinka ZIP14.5–10.
Jednom ububrežniepitela, gvožđe se reapsorbuje u cirkulaciju. FPN je u izobiljububregi uključen je u reapsorpciju gvožđa.11–14 Međutim, ostaje nepoznato da li je bubrežni FPN takođe podložan regulaciji endogenog HAMP-a u normalnim fiziološkim uslovima, i ako jeste, da li je takva regulacija važna za sistemsku i/ili renalnu homeostazu gvožđa.
Da bismo odgovorili na ova pitanja, generirali smo novi model miša s inducibilnombubrežnitubul–specifično ubacivanje fpnC326Y, koji kodira protein FPNC326Y otporan na HAMP. Osim toga, da bismo potvrdili prethodno prijavljenu ulogu FPN-a u reapsorpciji željeza, također smo generirali model miša s inducibilnimbubrežnitubul–specifična delecija fpn gena. Naši rezultati pokazuju da endogeni HAMP direktno reguliše apsorpciju gvožđa posredovanu FPN-om i da je ova regulacija važna za obabubrežnii sistemska homeostaza gvožđa, posebno u uslovima viška dostupnosti gvožđa.
Ova studija je prva koja je koristila miševe sa renalno-specifičnim gubitkom reakcije na HAMP da bi se formalno odrediovažnostof thebubrežniHAMP/FPN osa. Pruža nove uvide u ulogu reapsorpcije gvožđa u određivanju stepena bubrežnog i ekstrarenalnog preopterećenja gvožđem u uslovima hemohromatoze.
METODE
Miševi
Sve procedure na životinjama bile su u skladu sa Zakonom o kućnim životinjama (naučne procedure) Ujedinjenog Kraljevstva iz 1986. i odobrene od strane Odbora za etičku provjeru Odjeljenja za medicinske nauke Univerziteta u Oksfordu.
Uvjetni fpnflfl i fpnC326Yflfl aleli su generirani kako je prethodno opisano.15,16
Miševi koji nose transgen Pax8.CreERT2þ bili su poklon dr. Athene Matakidou, UK Kembridž institut za istraživanje raka, Univerzitet u Kembridžu. Ovi miševi su generisani kako je prethodno opisano.17 Svi miševi su bili na pozadini C57BL/6.
Dijeta
Osim ako nije drugačije navedeno, životinje su dobile standardnu ishranu za glodare koja je sadržavala 200 delova na milion (ppm) gvožđa. U eksperimentima manipulacije gvožđem, miševi su dobijali ishranu punu gvožđa (5000-ppm gvožđa; Teklad TD.140464) ili odgovarajuću kontrolnu ishranu (200- ppm gvožđa; Teklad TD.08713) od odvikavanja od 3 mjeseci.
Kvantifikacija željeza i indeksi željeza
Nivoi gvožđa i feritina u serumu određivani su pomoću ABXPentra sistema (Horiba Medical). Vrijednosti hemoglobina određene su HemoCue Hb 201 Hemoglobin mikrokivetama. Nivoi eritroferona u serumu mjereni su enzimskim imunosorbentnim testom (Intrinsic Lifesciences). Određivanje ukupnog elementarnog gvožđa u tkivima izvršeno je induktivno spregnutom plazma masenom spektrometrijom, kao što je prethodno opisano.15,16,18 Kalibracija je postignuta postupkom standardnih adicija, gde su šiljci od 0 ng/g, 0,5 ng/ g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g i 100 ng/g gvožđa su dodani u replikacije odabranog uzorka. Eksterni željezni standard (High Purity Standards ICP-MS-68-Otvor) je razrijeđen i izmjeren kako bi se potvrdila valjanost kalibracije. Rodijum je takođe unesen u svaki slepi uzorak, standard i uzorak kao interni standard u koncentraciji od 1 ng/g. Za kvantifikaciju željeza u urinu, urin je sakupljen od miševa u periodu od 24 sata i podvrgnut induktivno spregnutoj plazma masenoj spektrometriji. Nivoi kreatinina u istim uzorcima izmjereni su pomoću kolorimetrijskog kompleta za analizu kreatinina (Abcam; ab65340), a vrijednosti željeza su normalizirane na koncentraciju kreatinina.
Imunohistohemija
Fluorescentno imunološko bojenje je izvedeno u formalinom fiksiranim, parafinom ugrađenim dijelovima tkiva, korištenjem FPN antitijela (Novus Biologicals; NBP1-21502) u 1:100 i Pro-Hepcidin (AA 39-59) antitijela u 1:50 (Antibodies Online; ABIN350367). Specifičnosti FPN i hepcidin antitijela su potvrđene korištenjem Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ životinja i Hamp–/– životinja kao negativnih kontrola (dodatna slika S1). Markeri bubrežnog segmenta su identifikovani korišćenjem akvaporin{13}} antitijela u 1:200 (Biotechne; NB600- 749), akvaporin{17}} antitijela u 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), ili kalbindin antitelo na 1:100 (Abcam; ab82812). Sekundarna antitijela su bila anti-zečji IgG Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), antimagarći IgG Cy3 (Abcam; ab6949) i anti-mišji IgG Alexa568 (Abcam; ab175473). Slajdovi su snimljeni pomoću mikroskopa FV1000 Olympus.
cistanche može zaštititibubregfunkcija
Western blotting
Tkiva su brzo zamrznuta u tečnom azotu, zdrobljena, a zatim lizirana pomoću RIPA sistema pufera za lizu (Santa Cruz; sc-24948), prema uputstvima proizvođača. Lizati tkiva su očišćeni centrifugiranjem na 15 000g 10 minuta na 4 C. Koncentracija proteina u lizatima je izmjerena BCA testom proteina (Pierce; 23225) i normalizirana na istu koncentraciju za svaku seriju. Lizati su zatim razblaženi u neredukcionom Laemmli natrijum dodecil sulfatnom puferu za uzorke i zagrevani na 95°C 5 minuta. Protein (30-50 mg) je stavljen na Mini-PROTEAN TGX gelove (Biorad; 4561096). Nakon elektroforeze, protein je prebačen na poliviniliden diffluoridnu membranu koristeći BioRad Translotter sistem, a membrane su blokirane sat vremena u puferu za blokiranje koji je sadržavao 5 posto goveđeg serumskog albumina. Membrane su zatim obojene preko noći na 4°C zečjim poliklonskim anti-mišjim FPN antitijelom (NBP1-21502; Novus Biologicals) u 1:1000 ili anti-b-aktin antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (Proteintech; HRP{{18} }) u 1:5000. Blotovi su razvijeni korištenjem ECL prime detection kita (RPN2232; VWR International). Intenzitet signala je kvantifikovan pomoću ImageJ, a odnos između signala FPN i b-aktina je izračunat da bi se proizveli normalizovani intenziteti.
Perls boja poboljšana diaminobenzidinom (DAB).
Formalinom fiksirani, parafinom ugrađeni dijelovi tkiva su deparafinizirani korištenjem ksilena, a zatim rehidrirani u etanolu. Stakalca su zatim obojena 1 sat sa 1 procentom kalijum fericijanida u 0.1 mol/L HCl pufera. Aktivnost endogene peroksidaze je ugašena, a zatim su stakalca obojena DAB hromogenim supstratom i kontraobojena hematoksilinom. Vizualizirani su standardnim mikroskopom svijetlog polja.
Kvantitativna lančana reakcija polimeraze
Ekspresija gena je mjerena korištenjem Applied Biosystems TaqMangene ekspresionih sondi za Hamp i kućni gen baktin (Life Technologies). Vrijednost graničnog ciklusa (CT) za gen od interesa je prvo normalizirana oduzimanjem CT vrijednosti za b-aktin da bi se dobila DCT vrijednost. DCT vrijednosti testnih uzoraka su dalje normalizirane na prosjek DCT vrijednosti za kontrolne uzorke da bi se dobile DDCT vrijednosti. Relativni nivoi ekspresije gena su tada izračunati kao 2–DDCT.
Statistika
Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. Uparena poređenja vršena su pomoću Studentovog t testa. Višestruka poređenja su napravljena analizom varijanse. Post hoc testovi su koristili Bonferronijevu korekciju.
Slika 1|Osa hepcidin/feroportina (FPN) u bubrežnim tubulima kontroliše reapsorpciju gvožđa i važna je za homeostazu gvožđa u bubrezimakod ženki miševa. (a)Reprezentativne slike imunofluorescentnog bojenja za FPN, akvaporin 1 (AQP1), akvaporin 2 (AQP2) i kalbindin (CalD) u bubrezima miševa divljeg tipa. Šipke ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. Krajnji panel, šipka ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. (b) Western blot za FPN ububreziženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreER T2 þ miševa i FpnC326Y flfl/flfl kontrola 1 tjedan nakon liječenja tamoksifenom. Kvantifikacija intenziteta signala prikazana je u donjem panelu. (c) Western blot za FPN u bubrezima ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 1 sedmicu nakon tretmana tamoksifenom. Kvantifikacija intenziteta signala prikazana je u donjem panelu. (d) Nivoi gvožđa u bubrezima kod žena i muškaraca FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ miševi i FpnC326Yflfl/flfl kontrole 1 sedmicu, 1 mjesec, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon tretmana tamoksifenom. (e) Reprezentativne slike Perlsovog gvožđa poboljšane diaminobenzidinom (DAB) u kortikalnom području bubrega odgovarajućih životinja 3 mjeseca nakon indukcije tamoksifenom. Šipke ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. (f) Nivoi gvožđa u bubrezima kod ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 1 nedelje, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon indukcije tamoksifena. (g) Reprezentativne slike DAB-pojačane boje Perls gvožđa u renalnoj kortikalnoj regiji odgovarajućih životinja 3 mjeseca nakon indukcije tamoksifenom. (nastavak)
Slika 1 |(Nastavak) Prečke ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. (h) Nivoi gvožđa u serumu kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i kontrole FpnC326Yflfl/flfl 1 nedelje, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon tretmana tamoksifenom. (i) Nivoi gvožđa u serumu kod ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 1 nedelju, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon indukcije tamoksifenom. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" i="" ****p="">< 0,0001.="" b-act,="" b-actin;="" nastavak,="" kontrola;="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenilindol;="" ppm,="" dijelovi="" na="" milion.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
REZULTATI
Osa hepcidin/FPN u bubrežnim tubulima kontroliše reapsorpciju gvožđa i važna je za homeostazu bubrežnog gvožđa kod ženki miševa
Prvo smo nastojali utvrditi tačno mjesto ekspresije FPN-a ububreg. U tu svrhu, mi smo koštali bubrege miša na FPN i segment-specifične markere akvaporin 1 (marker proksimalnih uvijenih tubula i tankog silaznog udova Henleya), akvaporin 2 (marker sabirnih kanala i tubula) i kalbindin (marker distalnih uvijenih tubula i kortikalnih spojnih i sabirnih kanala). Otkrili smo da je FPN snažno izražen u korteksu, kolokalizirajući se s akvaporinom 1 u proksimalnim zavijenim tubulima. Bilo je nešto FPN-a u unutrašnjoj meduli, kolokalizirajući se s akvaporinom 2 u medularne sabirne kanale. Nije bilo kolokalizacije FPN-a s kalbindinom (slika 1a; veći panel prikazan na dodatnoj slici S2). Ovi rezultati potvrđuju da je FPN najzastupljeniji u kortikalnoj regiji unutar proksimalnih uvijenih tubula.
Da bismo utvrdili da li je renalni FPN reguliran HAMP-om, koristili smo miševe koji nose Pax8.CreERT2þ knock-in transgen, koji pokreće tamoksifen-inducibilnu ekspresiju Cre rekombinaze pod kontrolom uparenog box gena 8 pax8 promotora u proksimalnim i distalnim tubulima i u sabirni kanali.17 Ukrstili smo Pax8.CreERT2þ miševe sa miševima koji imaju uslovno ubačeni floksirani alel FpnC326Y, koji kodira FPN otporan na hepcidin. Pored toga, i da bismo potvrdili prethodno prijavljenu ulogu bubrežnog FPN-a u reapsorpciji gvožđa, ukrstili smo Pax8.CreERT2þ miševe sa miševima koji imaju Fpnflfl/flfl alel. Sedmicu nakon tretmana tamoksifenom za indukciju transgena Pax8.CreERT2, nivoi bubrežnog FPN-a su povećani kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa u odnosu na FpnC326Yflfl/flfl kontrole (Slika 1b), što pokazuje da je renalni FPN podložan endogeni HAMP u normalnim fiziološkim uslovima, i pored toga potvrđuje efikasnost Pax8.CreERT2þ transgena. Suprotno tome, nivoi bubrežnog FPN su smanjeni kod ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ miševa u odnosu na Fpnflfl/flfl kontrole, dodatno potvrđujući efikasnost Pax8.CreERT2þ transgena (Slika 1c). Specifičnost ovog Pax8.CreERT2þ transgena je takođe potvrđena prisustvom delecionog alela (DFpn) ububregali ne u jetri ili slezeni Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa (dodatna slika S2A).
Zatim smo krenuli da utvrdimo da li bubrežna HAMP/FPN osa kontroliše reapsorpciju gvožđa. U tom cilju, mjerili smo nivoe željeza u bubrezima i serumu 1 sedmicu, 1 mjesec, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon liječenja tamoksifenom. Našli smo to bubrežno gvožđe
sadržaj je bio niži kod ženki FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ nego kod kontrolnih ženki FpnC326Yflfl/flfl u svim vremenskim tačkama (Slika 1d). Sadržaj gvožđa u bubrezima kod muškaraca nije se razlikovao prema genotipu (Slika 1d). DAB-pojačana Perl-ova mrlja od gvožđa takođe je potvrdila smanjenje nivoa gvožđa u proksimalnim tubulima FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ ženki (Slika 1e; veći panel prikazan na Dodatnoj slici S2). Suprotno tome, otkrili smo da je sadržaj gvožđa u bubrezima veći kod Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ ženki nego kod Fpnflfl/flfl kontrolnih ženki od 1 mjeseca nadalje (Slika 1f). Sadržaj gvožđa u bubrezima kod muškaraca nije bio različit prema genotipu (Slika 1f). DAB-pojačana boja Perls gvožđa takođe je potvrdila akumulaciju gvožđa u proksimalnim tubulima Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ ženki (slika 1g; veći panel prikazan na dodatnoj slici S2).
Nivoi gvožđa u serumu su prolazno povećani i kod mužjaka i kod ženki FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa u odnosu na FpnC326Yflfl/flfl kontrole u 1-mjesečnoj vremenskoj tački (Slika 1h). Suprotno tome, nivoi gvožđa u serumu su smanjeni kod Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ ženki u odnosu na Fpnflfl/flfl kontrolne ženke u vremenskoj tački 1-, dok su ostali uporedivi kod mužjaka različitih genotipova u svim vremenskim tačkama (Slika 1i ). Vraćanje nivoa gvožđa u serumu u odnosu na one uočene kod kontrolnih životinja u dobi od 3 meseca ne može se pripisati obnavljanju normalnih nivoa bubrežnog FPN-a. Zaista, Pax8.CreERT2þ izazvane promjene u nivoima bubrežnog FPN-a su se i dalje održavale 3 mjeseca nakon liječenja tamoksifenom (dodatna slika S2B i C). Smanjen sadržaj gvožđa u bubrezima i povećani nivoi gvožđa u serumu kod ženki FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ pokazuju da je reapsorpcija gvožđa zavisna od FPN-a u proksimalnim tubulima podložna regulaciji HAMP-a u normalnim fiziološkim uslovima. Povećani sadržaj gvožđa u bubrezima i smanjeni nivoi gvožđa u serumu kod ženki Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ potvrđuju prethodne nalaze da bubrežni FPN doprinosi reapsorpciji gvožđa. Pored toga, u normalnim fiziološkim uslovima, čini se da je kontrola reapsorpcije gvožđa preko renalne HAMP/FPN osi važnija kod žena nego kod muškaraca, barem kod C57BL/6 soja.
Cistanche može poboljšati funkciju bubrega
Bubrežna HAMP/FPN osa doprinosi, ali nije neophodna za normalnu sistemsku homeostazu gvožđa u uslovima normalne dostupnosti gvožđa.
Zatim smo krenuli da odredimo doprinos renalne HAMP/FPN ose sistemskoj homeostazi gvožđa. Otkrili smo da su FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ ženke imale prolazno povećanje serumskog feritina (Slika 2a), sadržaja gvožđa u jetri (Slika 2b) i sadržaja gvožđa u slezeni (Slika 2c) u vremenskoj tački 1- kada u poređenju sa kontrolnim ženkama FpnC326Yflfl/flfl. Njihovi nivoi hemoglobina ostali su uporedivi sa onima u kontrolama u svim vremenskim tačkama (slika 2d). Nijedan od ovih parametara se nije razlikovao između FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ mužjaka i njihovih FpnC326Yflfl/flfl kontrola (Slika 2a–d). Nivoi eritroferona nisu se razlikovali prema genotipu (dopunska slika 3A). Suprotno tome, otkrili smo da Fpnflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ ženke imaju niže nivoe feritina u serumu u 1- i 3-mjesečnim vremenskim tačkama (Slika 2e), niži sadržaj gvožđa u jetri na 3- i 6-mjesečne vremenske tačke (Slika 2f), i niži sadržaj gvožđa u slezeni u 1- i 3-mjesečnim vremenskim tačkama (Slika 2g), u poređenju sa Fpnflfl/flfl kontrolnim ženkama. Također su imali prolazno i blago smanjenje nivoa hemoglobina u 3-mjesečnoj vremenskoj tački (slika 2h). Nijedan od ovih parametara se nije razlikovao između Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ mužjaka i njihovih Fpnflfl/flfl kontrola (Slika 2e–h). Nivoi eritroferona također nisu promijenjeni prema genotipu (dodatna slika 3B). Zajedno, ovi podaci pokazuju da, u normalnim fiziološkim uslovima, renalna HAMP/FPN osa doprinosi sistemskim nivoima gvožđa, ali sama po sebi nije neophodna za održavanje normalne sistemske homeostaze gvožđa.
Slika 2|Osa bubrežnog hepcidina antimikrobni peptid/feroportin (FPN) doprinosi, ali nije neophodna za normalnu sistemskuhomeostaza gvožđa u uslovima normalne dostupnosti gvožđa. (a–d)Sistemski indeksi gvožđa kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrola 1 nedelju, 1 mesec, 3 meseca i 6 meseci nakon tretmana tamoksifenom, uključujući (a) serumski feritin, (b) sadržaj gvožđa u jetri , (c) sadržaj gvožđa u slezini i (d) hemoglobin. (e–h) Sistemski indeksi željeza kod ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 1 sedmicu, 1 mjesec, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon indukcije tamoksifenom, uključujući (e) serumski feritin, ( f) sadržaj gvožđa u jetri, (g) sadržaj gvožđa u slezini i (h) hemoglobin. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" i="" ***p="">< 0,001.="" ppm,="" dijelovi="" na="">
Slika 3|Osa bubrežnog hepcidinskog antimikrobnog peptida (HAMP)/feroportina (FPN) određuje veličinu bubrežnog i sistemskog preopterećenja gvožđem u uslovima viška dostupnosti gvožđa. (a–f)Ekstrarenalni indeksi gvožđa kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrola dali su ili kontrolnu ishranu (200 delova na milion [ppm]) ili ishranu punu gvožđa (5000 ppm) tokom 3 meseca. (nastavak)
Slika 3 |(Nastavak) Indeksi uključuju (a) serumsko gvožđe, (b) serumski feritin, (c) sadržaj gvožđa u slezini, (d) sadržaj gvožđa u srcu, (e) sadržaj gvožđa u plućima i (f) sadržaj gvožđa u jetri. (g) Sadržaj gvožđa u bubrezima kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrole su davale ili kontrolnu ishranu (200 ppm) iligvožđemdijeta (5000 ppm) tokom 3 mjeseca. (h,i) Reprezentativne slike diaminobenzidinom (DAB) - poboljšane Perlsove mrlje gvožđa u jetri i bubrežnom kritičnom regionu odgovarajućih životinja. Šipke ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. (j) Relativna ekspresija gena hamp u jetri odgovarajućih životinja. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001,="" *****p="">< 0,00001="" i="" ******p="">< 0,000001.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
Bubrežna HAMP/FPN osa određuje veličinu bubrežnog i sistemskog preopterećenja gvožđem u uslovima viška dostupnosti gvožđa
Zatim smo krenuli da odredimo ulogu bubrežne HAMP/FPN ose u podešavanju preopterećenja gvožđem. U tom smislu, FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ životinje i FpnC326Yflfl/flfl kontrole su inducirane tamoksifenom, a zatim su date ili kontrolnu ishranu, koja sadrži 200 ppm gvožđa, ili ishranu punu gvožđa, koja sadrži 5000 ppm gvožđa za mesece . Otkrili smo da je ishrana bogata gvožđem povećala sadržaj serumskog gvožđa, serumskog feritina i gvožđa u tkivu kod mužjaka i ženki oba genotipa. Međutim, FpnC326Yflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ životinje su imale veći porast željeza u serumu (Slika 3a), serumskog feritina (Slika 3b) i sadržaja željeza u slezeni (Slika 3c), srcu (Slika 3d), plućima (Slika 3e) , i jetra (Slika 3f) od FpnC326Yflfl/flfl kontrola. Nasuprot tome, imali su manji porast sadržaja gvožđa u bubrezima (Slika 3g). Razlike između genotipova u stepenu opterećenja gvožđem u proksimalnim tubulima i u jetri takođe su bile očigledne u DAB-pojačanoj boji Perls gvožđa (Slika 3h i i; veći paneli prikazani na Dodatnoj slici S4). U skladu sa većim sistemskim preopterećenjem gvožđem, FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ životinje su takođe imale veće povećanje ekspresije gena hemp u jetri u poređenju sa kontrolama FpnC326Yflfl/flfl (Slika 3j). Nivo hemoglobina nije utjecao ni dijetom ni genotipom, iu skladu s tim, nivoi serumskog eritroferona su također ostali nepromijenjeni (dodatna slika 4A i B). Ovi nalazi pokazuju da, u uslovima viška dostupnosti gvožđa, kontrola reapsorpcije gvožđa preko renalne HAMP/FPN ose smanjuje sistemsko preopterećenje gvožđem dok povećava preopterećenje bubrega gvožđem.
Bubrežna HAMP/FPN osa određuje obrazac preopterećenja tkiva gvožđem u hemohromatozi
Zatim smo krenuli da istražujemo ulogu renalne HAMP/FPN ose u kontekstu nasljedne hemohromatoze, genetskog stanja preopterećenja gvožđem uzrokovanog defektima u proizvodnji hepcidina ili reakciji na hepcidin.19 U tom smislu, koristili smo miševe generirane u kuća u kojoj se nalazi heterozigotni sveprisutni knock-in alela fpnC326Y (Fpnwt/C326Y). Prethodno smo pokazali da ovi miševi razvijaju fenotip preopterećenja gvožđem karakterističan za naslednu hemohromatozu.15,18 Uporedili smo uzorak tkivapreopterećenje gvožđemkod ovih miševa sa onim uočenim kod miševa divljeg tipa koji su hranjeni hranom bogatom gvožđem od odbijanja 3 meseca. I miševi Fpnwt/C326Y i miševi divljeg tipa hranjeni hranom punom željeza imali su
povećan sadržaj gvožđa u jetri, srcu i plućima u poređenju sa njihovim odgovarajućim kontrolama (Slike 4a i b). Sadržaj gvožđa u bubrezima kod Fpnwt/C326Y miševa bio je normalan u dobi od 3 mjeseca (slika 4a) i porastao je samo za 32 posto u odnosu na kontrole u dobi od 6 mjeseci (dodatna slika 5A). Nasuprot tome, životinje divljeg tipa koje su davale ishranu punu gvožđa imale su 260 posto povećanje sadržaja gvožđa u bubrezima u poređenju sa onima na normalnoj ishrani (slika 4b). Relativne razlike u preopterećenju gvožđem u bubrezima i jetri između 2 modela također su bile očigledne u DABenhanced Perls boji željeza (Slike 4c i d; veće ploče prikazane na Dodatnoj slici S5). Veličina ekstrarenalnog preopterećenja gvožđem bila je uporediva između 2 modela, dok je veličina bubrežnog preopterećenja bila znatno veća kod životinja divljeg tipa koje su bile pune gvožđa nego kod Fpnwt/C326Y miševa (Slika 4e). FPN je povećan u korteksu i kod Fpnwt/C326Y miševa i kod miševa divljeg tipa davali su ishranu punu gvožđa (Slika 4f i g; veći paneli su prikazani na Dodatnoj slici S5). Detaljnije ispitivanje mesta ekspresije FPN-a u proksimalnim tubulima otkrilo je da se čini da se lokalizuje intracelularno kao i na bazolateralnoj membrani kod Fpnwt/C326Y miševa. Nasuprot tome, činilo se da se FPN prvenstveno lokalizira u citoplazmi, apikalnoj membrani i iznenađujuće da je jezgro kod miševa obezbjeđivalo prehranu punu željeza (Slike 4f i g, donje ploče). Obrazac lokalizacije FPN-a koji proizlazi iz ishrane bogate gvožđem dodatno je potvrđen upotrebom Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ životinja kao negativnih kontrola (dodatna slika S5B). Ova zapažanja, zajedno s prethodnim otkrićem da FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ životinje imaju niže opterećenje bubrežnim gvožđem od kontrola nakon davanjagvožđemdijete, pokazuju da gubitak djelovanja HAMP-a na bubrežni FPN štitibubregod opterećenja gvožđem u okruženju nasljedne hemohromatoze.
DISKUSIJA
Najvažniji nalaz ove studije je da endogeni HAMP kontroliše FPN-posredovanu reapsorpciju gvožđa. Prethodne studije su izvijestile o regulaciji FPN-a egzogenim HAMP-om u kultiviranim bubrežnim stanicama i inverznom odnosu između nivoa HAMP-a i FPN-a ububregnakon unilateralne okluzije uretera.12,13 Međutim, ovo je prva demonstracija da takva regulacija djeluje in vivo pod normalnim fiziološkim uslovima, i na način koji utiče na bubrežnu i sistemsku homeostazu željeza. Posebna snaga ove studije je upotreba novih miševa, generisanih u kući, kako bi se uklonio gubitak reakcije na HAMP specifičan za bubrege. Ovaj pristup omogućava proučavanje renalne HAMP/FPN ose bez zbunjujućih efekata izmenjene sistemske homeostaze gvožđa, inače viđenih na sveprisutnim životinjskim modelima.
Slika 4|Bubrežni hepcidin antimikrobni peptid/feroportin (FPN) određuje obrazac preopterećenja tkiva gvožđem u hemohromatozi. (a)Nivo gvožđa u bubrezima, jetri, srcu i plućima Fpnwt/C326Y životinja i Fpnwt/wt kontrola u dobi od 3 mjeseca. (b) Nivo gvožđa ububreg, jetra, srce i pluća životinja divljeg tipa davale su ili kontrolnu ishranu (200 dijela na milion [ppm]) ili dijetu punu željeza (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) nakon odvikavanja od 3 mjeseca. (c) Reprezentativne slike Perls gvožđa poboljšane diaminobenzidinom (DAB) u korteksu bubrega i jetri Fpnwt/C326Y životinja i Fpnwt/wt kontrola u dobi od 3 mjeseca. Šipka ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. (d) Reprezentativne slike DAB-pojačane boje Perls gvožđa u korteksu bubrega i jetri divljih životinja dale su ili kontrolnu ishranu (200 ppm) ili ishranu punu gvožđa (5000 ppm) nakon odvikavanja od 3 meseca. Bar ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. (e) Poređenje stepena opterećenja tkiva gvožđem između Fpnwt/C326Y životinja i životinja divljeg tipa hranjenih hranom bogatom gvožđem. Prikazane vrijednosti za svaku životinju su normalizirane na srednju vrijednost odgovarajuće kontrolne grupe. (f) Reprezentativne slike FPN imunofluorescentnog bojenja u korteksu bubrega Fpnwt/C326Y životinja i Fpnwt/wt kontrola u dobi od 3 mjeseca. Gornji panel, šipke ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. Donji panel, šipka ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. (g) Reprezentativne slike FPN imunofluorescentnog bojenja u bubrežnom korteksu divljih životinja davale su ili kontrolnu ishranu (200 ppm) ili dijeta puna gvožđa (5000 ppm) nakon odvikavanja od 3 mjeseca. Gornji panel, šipke ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. Donji panel, šipka ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. Vrijednosti su prikazane kao srednje SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" i="" ****p="">< 0,0001.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
Drugi važan nalaz ove studije je da renalni HAMP/FPN određuje veličinu i bubrežnog i sistemskog preopterećenja gvožđem (Slika 5). Zaista, gubitak odziva na HAMP u bubrežnim tubulima povećao je veličinu preopterećenja gvožđem jetre, slezine, srca i pluća, dok je smanjio veličinu bubrežnog preopterećenja gvožđem nakon ishrane pune gvožđa. U skladu s tim, veće bubrežno preopterećenje gvožđem uočeno je nakon davanja hrane bogate gvožđem životinjama divljeg tipa (kod kojih je bubrežna HAMP/FPN osa netaknuta) nego kod hemokromatoznih miševa (koja je takođe bubrežna HAMP/FPN osa poremećen) (grafički sažetak). Ovaj nalaz može objasniti kliničko zapažanje dabubregnije uobičajeno zahvaćen kod pacijenata sa nasljednom hemohromatozom.19
Slika 5|Uloga renalnog hepcidin antimikrobnog peptida (HAMP)/feroportina (FPN) ose u postavljanju preopterećenja gvožđem.Ishrana bogata gvožđem povećava dostupnost gvožđa u serumu i nivoe gvožđa u glomerularnom fifiltratu i povećava proizvodnju i oslobađanje hepcidina (HAMP) u jetri. Povećani serumski HAMP inhibira reapsorpciju gvožđa blokirajući FPN u bubrežnim tubulima. Inhibicija reapsorpcije gvožđa uzrokuje zadržavanje gvožđa u bubrezima dok istovremeno smanjuje sistemsku dostupnost gvožđa i posljedično smanjuje preopterećenje jetre gvožđem. Kod miševa FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ, gubitak odziva na HAMP u bubrežnim tubulima uzrokuje neregulisanu reapsorpciju gvožđa. Ovo, zauzvrat, sprečava zadržavanje gvožđa u bubrezima dok povećava sistemsku dostupnost gvožđa i posledično povećava preopterećenje jetre gvožđem.
Iako su i hemokromatoza i preopterećenje željezom u ishrani povećale FPN u bubrežnim tubulima, čini se da rezultiraju različitim obrascima lokalizacije na apikalni, intracelularni ili bazolateralni odjeljak. Slična zapažanja su obavljena i na dvanaesniku pacova, gdje je pronađeno da gavaža željeza mijenja relativnu distribuciju FPN-a između ovih odjeljaka u duodenalnim enterocitima.20 Jedno tumačenje ovih rezultata je da je u uvjetima preopterećenja željezom u ishrani povećana translacija FPN-a (posredovana regulacijski proteini željeza) djelovali bi na održavanje visoke ukupne proizvodnje FPN-a u bubrežnoj tubularnoj ćeliji, dok bi povećani serumski HAMP smanjio udio FPN-a koji se može lokalizirati na bazolateralnoj membrani. Iz ovog tumačenja slijedi da bi razlika između prethodnih izvještaja o lokalizaciji FPN-a u proksimalnim tubulima mogla odražavati razlike u sadržaju gvožđa u bubrežnim tubulima i u nivoima hepcidina u serumu između životinjskih modela korištenih u različitim studijama.5,11–14,21 Alternativno, ova divergencija mogla bi odražavati stepen nespecifične reaktivnosti koji je ranije objavljen u odnosu na komercijalna FPN antitijela, uključujući i ono korišteno u ovoj studiji.14 Funkcionalni značaj apikalne lokalizacije FPN-a u bubrežnim tubulima ostaje nejasan i nismo mogli otkriti nikakve promjene u izlučivanju gvožđa u urinu kod miševa napunjenih gvožđem (dopunska slika 5C). Još jedno zanimljivo zapažanje je da se neki FPN pojavio lokaliziran na jezgru u bubrežnim tubulima miševa napunjenih željezom. Slična zapažanja su dali drugi u makrofagima punjenim gvožđem i u jetri pacova. Potonja studija otkrila je da je nuklearni FPN uključen u zadržavanje željeza u jezgri kao dio odgovora akutne faze.22,23 Detaljne studije subcelularne lokalizacije FPN-a u različitim stanjima željeza i u različitim patologijama potrebne su kako bi se dodatno unaprijedilo naše razumijevanje uloge FPN u bubregu.
Regulacija i funkcija bubrežnog HAMP-a također nisu u potpunosti shvaćeni. Otkrili smo da je ekspresija hamp gena u bubrezima povećana kod divljih životinja nakon ishrane bogate gvožđem (dopunska slika 5E), ali je ostala nepromenjena kod hemokromatoznih miševa (dopunska slika 5D), i kod onih koji nose bubrežne tubule- specifičan gubitak FPN-a ili renalnih tubula – specifičan gubitak odziva na HAMP (dodatna slika S5F i G). Ovi rezultati ne podržavaju ideju da je ekspresija bubrežnog hamp gena lokalno regulirana razinama željeza u bubrezima. Što se tiče funkcije bubrežnog HAMP-a, prethodna studija na modelu unilateralne okluzije uretera sugerirala je da je uključen u kontrolu bubrežnog FPN-a. Otkrili smo da je bubrežni HAMP (otkriven korištenjem antitijela protiv pro-HAMP peptida) kolokaliziran s kalbindinom (markerom distalnih uvijenih tubula i kortikalnih sabirnih kanala i spojnih kanala) (dodatna slika S5H). S druge strane, ekspresija FPN-a se ne kolokalizira s kalbindinom, čak ni kod miševa koji imaju renalno-specifičan gubitak odziva na HAMP (slika 1a i dodatna slika S5I). Ovi rezultati nisu u skladu s autokrinom ulogom bubrežnog HAMP-a u regulaciji bubrežnog FPN-a. Ipak, bubrežni HAMP može biti uključen u parakrinu regulaciju bubrežnog FPN-a. U budućnosti bi bilo zanimljivo proučavati parakrine funkcije bubrežnog HAMP-a i kvantificirati relativni doprinos bubrežnih i jetrenih HAMP-a kontroli reapsorpcije željeza.
Još jedno zanimljivo zapažanje iz ove studije je da, u uslovima normalne dostupnosti gvožđa, bubrežna HAMP/FPN os nije neophodna za održavanje normalne sistemske homeostaze gvožđa, već je važnija za regulaciju nivoa gvožđa u bubregu, barem kod ženki miševa. soj C57BL/6. Zaista, iako su uočene promjene u nivoima gvožđa u bubrezima koje su rezultat gubitka FPN-a ili odziva na HAMP u bubrežnim tubulima bile uporne, promene u sistemskim indeksima gvožđa bile su prolazne prirode. Prolazna priroda sistemskih efekata sugeriše kompenzacioni mehanizam(e) uključivanja. Jedan od mogućih kompenzacijskih mehanizama je modulacija apsorpcije željeza iz hrane jetrenim HAMP-om. Zaista, otkrili smo da je kod miševa koji imaju renalno specifičan gubitak odziva na HAMP, ekspresija hepatičnog hamp gena povećana nakon povećanja nivoa željeza u serumu u 1-mjesečnoj vremenskoj tački i ostala povećana u kasnijim vremenskim tačkama. Suprotno tome, ekspresija hepatičnog hamp gena bila je potisnuta kod miševa koji su imali renalno-specifičan gubitak FPN-a nakon smanjenja nivoa željeza u serumu u 1-mjesečnoj vremenskoj tački i ostala potisnuta u kasnijim vremenskim tačkama (dodatna slika S6A i B). Osim toga, povećana ekspresija hepatičnog hamp gena u prvoj postavci bila je praćena smanjenim nivoima FPN u crijevima, dok je smanjena ekspresija hepatičnog hamp gena u drugom okruženju bila praćena višim FPN crijeva (dodatna slika S6C i D). Ovi rezultati pokazuju da je djelovanje jetrenog HAMP-a na apsorpciju željeza iz hrane aktivan kompenzacijski mehanizam uključen u održavanje normalne sistemske homeostaze željeza u slučaju poremećene bubrežne reapsorpcije željeza.
Cistanche može popraviti funkciju bubrega
Treba napomenuti da je u uslovima normalne dostupnosti gvožđa, renalna HAMP/FPN osa izgleda važnija kod ženki miševa nego kod mužjaka miševa, barem u soju C57BL/6. Ovo zapažanje se ne može pripisati razlikama između muškaraca i žena u aktivnosti Pax8.CreERT2þ transgena. Seksualni dimorfizam u nivoima i obrascima transportera duž nefrona je ranije zabilježen kod ovog soja miševa.24 U skladu s tim, pronašli smo veću bazalnu ekspresiju FPN-a ububreziženki nego u bubrezima mužjaka legla (dodatna slika S2D). Prethodna studija koja je koristila drugačiji transgen Cre rekombinaze, vođena konstitutivno aktivnim Nestin promotorom da izbriše fpn u cijelom nefronu, također je prijavila povećanje nivoa gvožđa u bubrezima i smanjenje zaliha željeza u serumu i jetri. Međutim, ta studija je provedena na drugom soju miševa (129/SvEvTac) i nije analizirala fenotip prema spolu ili vremenskom toku.14
hemohromatoza i drugi poremećaji željeza.
OTKRIVANJE
Svi autori su se izjasnili da nema suprotstavljenih interesa.
ZAHVALNICA
SL-L je primio postdoktorsku stipendiju British Heart Foundation Intermediate Basic Science (FS/12/63/29895). GM je finansirao aBritanski projekat istraživanja bubregagrant (RP_020_20160303) dodijeljen SL-L.
DOPRINOSI AUTORA
SL-L koncipirana studija. SL-L i GM su sproveli eksperimente. SL-L je analizirao i interpretirao rezultate. SL-L je napisao rukopis. AM je dao materijale. PAR je komentirao rukopis.
DODATNI MATERIJAL
Dodatni fajl (PDF)
Slika S1. Potvrda specifičnosti FPN i HAMP antitijela. (A) Reprezentativne slike FPN imunofluorescentnog bojenja u korteksu bubrega Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ životinja i Fpnflfl/flfl kontrola u dobi od 3 mjeseca. Gornji paneli, traka ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. Donje ploče, šipka ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. (B) Reprezentativne slike HAMP imunofluorescentnog bojenja u bubrežnom korteksu Hamp–/– životinja i kontrola divljeg tipa na 3 mjeseci starosti. Gornji paneli, šipka ¼ 200 mm, originalno povećanje 10. Donje ploče, šipka ¼ 25 mm, originalno povećanje 60.
Slika S2. Potvrda aktivnosti i specifičnosti Pax8.CreERT2þ. (A) Genotipizacija Fpnflfl/flfl i Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa korištenjem genomske DNK ekstrahirane iz jetre, slezene ibubreg1 sedmicu nakon indukcije tamoksifenom. (B) Western blot za FPN inbubreziženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Y kontrola 3 mjeseca nakon liječenja tamoksifenom. Kvantifikacija intenziteta signala prikazana na donjem panelu. (C) Western blot za FPN u bubrezima ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 3 mjeseca nakon liječenja tamoksifenom. Kvantifikacija intenziteta signala prikazana na donjem panelu. (D) Western blot za FPN u bubrezima ženki divljeg tipa i mužjaka legla u dobi od 3 mjeseca. Kvantifikacija intenziteta signala prikazana na donjem panelu. (E–G) Veće verzije panela na slici 1a, g i e. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. *P < 0.05,="" ***p=""><>
Slika S3. Nivoi eritroferona u serumu nisu promijenjeni kod FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ i Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2 miševa. (A) Nivoi eritroferona u serumu kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrola u 1 sedmici, 1 mjesecu, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon liječenja tamoksifenom. (B) Nivoi eritroferona u serumu kod ženki i mužjaka Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i kontrole Fpnflfl/flfl u 1 sedmici, 1 mjesecu, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon indukcije tamoksifenom. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM.
Slika S4. Nivoi hemoglobina i eritroferona u serumu nisu promijenjeni kod FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ koji se hrani hranom bogatom gvožđem. (A) Nivo hemoglobina kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrole hranjene su ili kontrolnom dijetom (koja sadrži 200 ppm gvožđa) ili ishranom bogatom gvožđem (sadrži 5000 ppm gvožđa) od 3 meseca od wean i. . (B) Nivo eritroferona u serumu kod ženki i mužjaka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i kontrola FpnC326Yflfl/flfl hranjenih ili kontrolnom ishranom (koja sadrži 200 ppm gvožđa) ilidijeta puna gvožđa(sadrži 5000 ppm gvožđa) od odbijanja 3 meseca. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. (C,D) Veće verzije panela na slici 3h i i.
Slika S5. Rukovanje bubrežnim gvožđem i ekspresija bubrežne brazde u različitim modelima miševa. (A) Nivoi gvožđa u bubrezima kod Fpnwt/C326Y životinja i Fpnwt/wt kontrola u dobi od 6 meseci. (B) Reprezentativne slike FPN i AQP1 imunofluorescentnog bojenja u bubrežnom korteksu Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ životinja i Fpnflfl/flfl kontrole hranjene hranom bogatom gvožđem koja sadrži 5000 ppm 3 mjeseca od odbića. Bar ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. (C) Nivoi gvožđa u urinu (normalizovani na kreatinin u urinu) kod životinja divljeg tipa koje su hranjene hranom bogatom gvožđem koja sadrži 5000 ppm gvožđa ili kontrolnom ishranom koja sadrži 200 ppm gvožđa od odbijanja tokom 3 meseca. (D) Ekspresija gena bubrežnog hamp kod Fpnwt/C326Y životinja i Fpnwt/wt kontrola u dobi od 3 mjeseca. (E) Ekspresija gena bubrežnog hamp kod divljih životinja koje su hranjene hranom bogatom gvožđem koja sadrži 5000 ppm gvožđa ili kontrolnom ishranom koja sadrži 200 ppm gvožđa od odbijanja tokom 3 meseca. (F) Ekspresija bubrežnog hamp gena kod ženki i mužjaka FpnC326Yflflflfl,Pax8.CreERT2þ miševa i kontrole FpnC326Yflflflfl 1 sedmice, 1 mjesec, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon liječenja tamoksifenom. (G) Ekspresija bubrežnog hamp gena kod ženki i mužjaka Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 1 tjedan, 1 mjesec, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon indukcije tamoksifenom. (H) Reprezentativne slike HAMP i CalD imunofluorescentnog bojenja u korteksu bubrega divljih životinja u dobi od 3 mjeseca. Bar ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. (I) Reprezentativne slike FPN i CalD imunofluorescentnog bojenja u korteksu bubrega FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ životinja u dobi od 1 mjeseca. Šipka ¼ 25 mm, originalno uvećanje 60. (J–M) Veće verzije panela na slikama 4c, d, f i g, redom. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. *P <>
Slika S6. Ekspresija gena hamp u jetri i nivoi FPN u crijevima su promijenjeni kod miševa sa fpn specifičnim za bubrežne tubule i kod miševa sa knock-inom fpnC326Y specifičnim za bubrežne tubule. (A) Relativna ekspresija hamp mRNA u jetri ženki FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrola u 1 sedmici, 1 mjesecu, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon liječenja tamoksifenom. (B) Relativna ekspresija hamp mRNA u jetri ženki miševa Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ i kontrolama Fpnflfl/flfl u 1 sedmici, 1 mjesecu, 3 mjeseca i 6 mjeseci nakon liječenja tamoksifenom. (C) Reprezentativne slike FPN imunobojenja u crijevima ženki FpnC326Y flflflfl, Pax8.CreERT2þ miševa i FpnC326Yflfl/flfl kontrola 1 mjesec nakon tretmana tamoksifenom. Bar ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. (D) Reprezentativne slike FPN imunološkog bojenja u crijevima ženki Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ miševa i Fpnflfl/flfl kontrola 1 mjesec nakon tretmana tamoksifenom. Bar ¼ 200 mm, originalno uvećanje 10. Vrijednosti su prikazane kao srednji SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" i=""><>
Cistanche može ublažiti infekciju bubrega
REFERENCE
1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL, et al. Izvoznik gvožđa feroportin/slc40a1 je neophodan za homeostazu gvožđa. Cell Metab. 2005;1:191–200.
2. Ganz T. Ćelijsko željezo: feroportin je jedini izlaz. Cell Metab. 2005;1:155–157.
3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin reguliše ćelijski efluks gvožđa vezujući se za feroportin i indukujući njegovu internalizaciju. Nauka. 2004;306:2090–2093.
4. Qiao B, Sugianto P, Fung E, et al. Endocitoza feroportina izazvana hepcidinom ovisi o ubikvitinaciji feroportina. Cell Metab. 2012;15:918–924.
5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R, et al. In vivo karakterizacija bubrežnog transporta gvožđa kod anesteziranih pacova. J Physiol. 2000;524:581–586.
6. Christensen I, Birn H, Storm T, et al. Endocitni receptori u proksimalnom tubulu bubrega. fiziologija. 2012;27:223–236.
7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. Bubrežni metabolizam željeza: prijenos željeza u transferinu i uloga regulatornih proteina željeza. J Am Soc Nephrol. 2007;18:401–406.
8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Ćelijska i subćelijska lokalizacija Nramp2 transportera gvožđa u intestinalnoj ivici i regulacija gvožđem iz hrane. Krv. 1999;93: 4406–4417.
9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S, et al. ZIP8 je transporter gvožđa i cinka čija se ekspresija na ćelijskoj površini pojačano reguliše punjenjem ćelijskog gvožđa. J Biol Chem. 2012;287:34032–34043.
10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. Metabolizam gvožđa u patogenezi oštećenja bubrega izazvanih gvožđem. Nat Rev Nephrol. 2013;9:385–398.
11. Wolff N, Liu W, Fenton R, et al. Feroportin 1 se eksprimira bazolateralno u stanicama proksimalnih tubula bubrega pacova, a višak gvožđa povećava njegov membranski promet. J Cell Mol Med. 2011;15:209–219.
12. Pan S, Qian ZM, Cui S, et al. Lokalni hepcidin je povećao intracelularno preopterećenje gvožđem kroz razgradnju feroportina u bubrezima. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:322–327.
13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C, et al. Hepcidin reguliše intrarenalno rukovanje gvožđem na distalnom nefronu. Kidney Int. 2013;84:756–766.
14. Wang X, Zheng X, Zhang J, et al. Fiziološke funkcije feroportina u regulaciji bubrežnog recikliranja željeza i ishemijske akutne ozljede bubrega. Am J Physiol Renal Physiol. 2018;315:F1042–F1057.
15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ, et al. Bitna ćelijska autonomna uloga hepcidina u srčanoj homeostazi željeza. Elife. 2016;5: e19804.
16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA, et al. Srčani feroportin reguliše ćelijsku homeostazu željeza i važan je za rad srca. Proc Natl Acad Sci US A. 2015;112:3164–3169.
17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K, et al. Generisanje i karakterizacija Pax8-CreERT2 transgene linije i Slc22a6-CreERT2 knock-in linije za inducibilnu i specifičnu genetsku manipulaciju epitelnim ćelijama bubrežnih tubularnih ćelija. PLoS One. 2016;11:e0148055.
18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frize M, et al. Intracelularni nedostatak gvožđa u ćelijama glatkih mišića plućnih arterija izaziva plućnu arterijsku hipertenziju kod miševa. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116:13122–13130.
19. Camaschella C. Razumijevanje homeostaze željeza kroz genetsku analizu hemohromatoze i srodnih poremećaja. Krv. 2005;106: 3710–3717.
20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A, et al. Opskrba gvožđem određuje apikalnu/bazolateralnu distribuciju intestinalnih transportera gvožđa DMT1 i feroportina 1. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298:C477–C485.
21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. Uloga bubrega u homeostazi željeza: bubrežna ekspresija prohepcdina, feroportina i DMT1 kod anemičnih miševa. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295:F1213–F1221.
22. Naz N, Malik I, Sheikh N, et al. Feroportin-1 je "nuklearno"-negativni protein akutne faze u jetri pacova: poređenje sa drugim proteinima koji prenose željezo. Lab Invest. 2012;92:842–856.
23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. Opterećenje gvožđem povećava nivoe heterogene nuklearne RNK i mRNA feroportina u mišjim J774 makrofagima. J Nutr. 2009;139:434–438.
24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J, et al. Seksualni dimorfni obrazac bubrežnih transportera i homeostaze elektrolita. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 3504–3517.
