Ishophloroglucin A izolovan iz Ishige Okamurae potiskuje melanogenezu izazvanu -MSH: In vitro i in vivo, dio 1

sažetak:Difloretohidroksikarmalol (DPHC) izolovan iz Ishige Okamure (IO) pokazao je potencijalne efekte izbjeljivanja protiv UV-B zračenja. Međutim, komponente IO i njihov molekularni mehanizam protiv -melanocit-stimulirajućeg hormona (-MSH) još uvijek nisu istraženi. Stoga je ova studija imala za cilj istražiti inhibitorne efekte ishophloroglucina A (IPA), florotanina izolovanog iz smeđih algi IO, i njegovog sirovog ekstrakta (IOE), na melanogenezu in vivo u modelu zebrice izazvane -MSH i u stanicama melanoma B16F10. in vitro. Provedene su studije molekularnog spajanja florotanina kako bi se utvrdili njihovi inhibitorni efekti i razjasnio način njihove interakcije s tirozinazom, glikoproteinom povezanim s melanogenezom. Osim toga, morfološke promjene i sadržaj melanina smanjeni su u modelu zebrice izazvane -MSH nakon tretmana IPA i IOE. Nadalje, Western bloting je otkrio da IPA pojačava ekspresiju proteina povezanu s ekstracelularnom populacijom u -MSH-stimuliranim B16F10 stanicama. Stoga, ovi rezultati sugeriraju da IPA izolirana od IOE ima potencijal za upotrebu u farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji.

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite efekte kao nprantioksidans, antiinflamatorna i promocija imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche i izbjeljivanja kože leži u antioksidativnom dejstvu cistanche glikozida.Melaninu ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju katalizira tirozinaza. Reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, tako da radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu.inhibiranje proizvodnje melanina.

1. Uvod

Morske alge su privukle ogromnu pažnju funkcionalne prehrambene, kozmetičke i farmaceutske industrije jer koriste bioaktivne spojeve kao što su florotanini, fukoidani, polisaharidi i proteini [1–7]. Prema prethodnoj studiji, Ishige Okamurae (IO) je testiran na inhibicijski učinak na aktivnost tirozinaze [8]. Iako je njegov florotanin, diphlorethohydroxycarmalol (DPHC), procijenjen na antimelanogenezu induciranu UV-B zračenjem u in vitro modelu [8], nisu provedene daljnje studije koje bi objasnile interakciju između DPHC i proteina povezanih s melanogenezom. U ovoj studiji, novo polifenolno jedinjenje, Ishophloroglucin A (IPA) [9], procenjeno je za njegovu interakciju sa tirozinazom u molekularnoj studiji spajanja, u poređenju sa onom DPHC.

Kliknite na Organic Cistanche Tubulosa za izbjeljivanje

Pitajte za više:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Molekularno spajanje je efikasna računska metoda za predviđanje potencijalnog načina vezivanja malih molekula ili liganada unutar aktivnog mjesta proteina ili receptora poznate trodimenzionalne strukture za proučavanje njihovih obrazaca interakcije ili za dizajn lijeka [10–12]. Prethodne studije su izvijestile o mjestu interakcije enzima tirozinaze i energetskoj vrijednosti kao što je istraživano u studijama molekularnog spajanja [13,14]. Funkcionalno, tirozinaza je enzim koji ograničava brzinu koji katalizuje relativno sporu brzinu reakcije u signalnom putu i igra ključnu ulogu u biosintezi melanina u specijalizovanim organelama zvanim melanosomi, posebno sintetiziranim od strane melanocitnih stanica [15]. Stoga je enzimska aktivnost tirozinaze modelirana simulacijama molekularnog spajanja in silico bila cilj za istraživanje inhibitora za prevenciju kožnih hiperpigmentiranih poremećaja. Na osnovu toga, u eksperimentalnim i računarskim poljima, mnoga fenolna jedinjenja ili inhibitori koji imaju sposobnost heliranja metala su široko proučavana kao inhibitori tirozinaze [16].

Melanin prvenstveno modulira boju kože i djeluje kao zaštitni pigment kada je koža izložena UV zračenju [17]. Izloženost UV zračenju uzrokuje oslobađanje -melanocit-stimulirajućeg hormona (-MSH) iz kožnih keratinocita i melanocita kako bi se inducirala sinteza melanina i potom zaštitila koža od štetnog djelovanja sunčevog zračenja [18]. Međutim, dugotrajno izlaganje UV zračenju inducira značajnu sintezu melanina pomoću -MSH, što dovodi do oštećenja kože kao što su pjege, sunčeve pjege i crne mrlje na epidermi, što dovodi do fotooštećenja DNK i raka kože [19]. Nakon toga, primjena -MSH u melanocite je široko proučavana kako bi izazvala značajne promjene u aktivnosti tirozinaze za melanogenezu u melanomu [20].

Zebrafish prikazuju varijacije u boji kože poput ljudi. Oni su životinjski model koji se koristi za razumijevanje genetskog porijekla boje ljudske kože, povezujući osnovni model biologije organizma s ljudskom genetikom [21]. Osim toga, pigmenti na ventralnom i bočnom dijelu gastrule zebrice i njihova prozirnost tokom stadija larve omogućavaju jednostavno promatranje procesa pigmentacije, pružajući priliku da se razviju održivi modeli za razumijevanje poremećaja stanica kože koji su rezultat defekata u razvoju melanocita [22- 24].

Sinteza melanina se odvija kroz aktivnost nekoliko proteina povezanih s melanogenezom, kao što su tirozinaza, transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), protein povezan s tirozinazom-1 (Trp-2) i protein povezan s tirozinazom{ {6}} (Trp-1) [15]. U ovoj studiji, imali smo za cilj da istražimo inhibitorni efekat IPA i IO sirovog ekstrakta (IOE) na aktivnost tirozinaze i melanogenezu na -MSH-indukovane zebrice in vivo i ćelije melanoma B16F10 in vitro kako bismo procenili njihovu potencijalnu upotrebu u lečenju pigmentacije kože i melanoma. .

2. Rezultati

2.1. Molecular Docking Study

Provedena je metoda spajanja kako bi se simuliralo vezivanje komercijalnog enzima tirozinaze za IPA, DPHC i arbutin [25]. Načini vezivanja IPA, DPHC ili arbutina sa tirozinazom pečurke prikazani su na slici 1A-C. Kao što je prikazano na 3D dijagramu kompleksa tirozinaza-IPA (slika 1A), tirozinaza-DPHC (slika 1B) i tirozinaza-arbutin (slika 1C), iako su IPA, DPHC i arbutin vezani za aktivno mjesto, tirozinaza- IPA kompleks pokazao je najveću vezujuću površinu. Pored toga, kao što je prikazano na 2D dijagramu, kompleks tirozinaza-IPA pokazao je više interakcija sa različitim aminokiselinama tirozinaze, u poređenju sa tirozinazom-DPHC ili tirozinazom-arbutinom. Sedam benzenskih prstenova (1., 2., 3., 8., 9., 12. i 16.) i njihovi atomi kiseonika imaju π–π interakcije sa Histidinom60, Metioninom61, Lizinom157, Glutamatom158, Prolinom160, Valginom2016, Arginom2016, . Konkretno, 16. benzenski prsten je kombinovan sa Histidinom60 i Histidinom204, glavnim aminokiselinama aktivnog mesta. Osim toga, mnogi atomi kisika u IPA su stupili u interakciju putem vodoničnih veza s glutamatom158, prolinom160, aspartatom167, metioninom184, fenilalaninom197, asparaginom199, glutaminom202, asparaginom205 i argininom209. Nadalje, na osnovu rezultata analize pristajanja, izračunato je da su ukupna energija vezivanja i energija interakcije CDOCKER pomoću programa CDOCKER energije interakcije DS 3.0 (Slika 1D) sljedeće: energija interakcije s tirozinazom: Ishophloroglucin A (IPA): − 152,154 kcal/mol, difloretohidroksikarmalol (DPHC): −65,5221 kcal/mol i arbutin: −33,6835 kcal/mol i energija vezivanja sa tirozinazom: Ishophloroglucin A (IPA): −546,504 diphlohidroxyol.0 kcal: −546,504 kcal. /mol i arbutin: −79,0913 kcal/mol.

2.2. Učinci melanogenih inhibitora na sintezu melanina u larvi zebrice

Svrha ove studije bila je utvrditi mogu li IPA i IOE inhibirati melanogenezu u larvi zebrice in vivo. U našoj prethodnoj studiji, IPA i IOE nisu pokazali toksičnost na larve zebrice [26]. Ličinke zebrice tretirali smo zebricom (0.05, 0.15 i 0.5 nM) i IOE (3, 10 i 30 µg/mL ) kako bi se odredio njihov sadržaj melanina. Da bismo procijenili inhibitorne aktivnosti, izmjerili smo ukupni sadržaj melanina u ekstraktima zebrice. Fenotipski učinak na melanin zebrice uočen je analizom pigmentacije njihovih tijela pod mikroskopom na sobnoj temperaturi. Površinski melanin je značajno smanjen različitim koncentracijama ciljnih inhibitora (slika 2). Tretman sa 3 nM -MSH značajno je povećao sadržaj melanina zebrice u poređenju sa netretiranom grupom. Najveće koncentracije IPA (0,5 nM) i IOE (30 µg/mL) smanjile su ukupni sadržaj melanina za skoro 28,56 posto i 30,36 posto, respektivno, što je pokazalo slične efekte kao grupa tretirana arbutinom (200 µM) (slika 2A, B).

2.3. Efekti IPA i IOE na sintezu melanina u B16F10 ćelijama

Citotoksični efekti IPA i IOE na B16F10 ćelije mjereni su putem MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ 7}}difeniltetrazolijum bromid). Prvobitno smo ispitali citotoksične efekte IPA i IOE na B16F10 ćelije tretirane različitim koncentracijama bez -MSH stimulacije. IPA (0,15, 0,5, 1,5 i 5 nM) nije otkrio nikakvu značajnu citotoksičnost na B16F10 ćelijama, dok IOE (1, 3, 10 i 30 µg/mL) nije pokazao citotoksičnost (Slika 3A, B). Za daljnje proučavanje korištene su koncentracije IPA i IOE bez toksičnosti.

Ispitivali smo da li je efekat inhibicije melanina od IPA ili IOE tretmana in vivo bio reverzibilan bez -MSH stimulacije u B16F10 ćelijama. Sadržaj melanina je značajno smanjen nakon tretmana sa IPA (5 nM) ili IOE (30 µg/mL) u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 3C, D). Ovi rezultati sugeriraju da IPA i IOE inhibiraju sintezu melanina bez -MSH stimulacije u B16F10 stanicama, doprinoseći na taj način njegovom antimelanogeneznom učinku.

2.4. Učinci IPA i IOE na aktivnost tirozinaze i sintezu melanina u -MSH-stimuliranim B16F10 stanicama

Stoga su doze IPA (0.5, 1.5 i 5 nM) i IOE (3, 10 i 30 µg/mL) inkubirane sa stanicama melanoma B16F10 kako bi se odredila njihova bioaktivnost u ćelijskoj aktivnosti tirozinaze i -MSH -posredovana melanogeneza.

Koncentracije -MSH i arbutina određene su na osnovu rezultata njihove citotoksičnosti i proizvodnje melanina u B16F10 ćelijama (Slika S2A-D). Analizom podataka o stopi preživljavanja, 1 nM -MSH i 100 µM arbutina korišćeni su za dalje eksperimente.

Što se tiče aktivnosti stanične tirozinaze, iako su inhibitorni efekti 1,5 nM IPA bili relativno niži od onih prikazanih u pozitivnoj kontroli, koncentracija se razlikovala skoro 10 puta, s višom koncentracijom arbutina na 100 µM (Slika 4A). IOE je smanjio aktivnost tirozinaze uz blagu fluktuaciju između efekata različitih koncentracija u poređenju sa grupom koja je tretirana -MSH (slika 4B). Što se tiče melanogeneze posredovane -MSH, uočeno je značajno smanjenje sadržaja melanina u grupama tretiranim 1,5 i 5 nM IPA (Slika 4C). Pored toga, 30 µg/mL IOE inhibirao je pigmentaciju do tačke koja je ličila na praznu grupu (slika 4D). Ovi rezultati sugeriraju da IPA i IOE smanjuju aktivnost tirozinaze i da ovaj inhibitorni učinak može dovesti do smanjene sinteze ćelijskog melanina u B16F10 stanicama.

2.5. Učinci IPA i IOE na molekularni mehanizam u -MSH-stimuliranim B16F10 ćelijama

Da bismo razjasnili mehanizam koji je odgovoran za njihov inhibitorni efekat melanogeneze, utvrdili smo uticaj IPA i IOE na nivoe ekspresije signalnih molekula uključenih u sintezu melanina (Slika 5). ERK (ekstracelularna signalno regulisana kinaza), JNK (Jun N-terminalna kinaza) i p38 pripadaju mitogen-aktiviranoj protein kinazi (MAPK) intracelularnoj kaskadi transdukcije signala [27,28]. Kao što je prikazano na slici 5A, B, fosforilacija ERK je poboljšana IPA tretmanom, dok je fosforilacija JNK blago smanjena nakon tretmana sa IPA (1,5 i 5 nM) ili IOE (30 µg/mL). Pored toga, kao što je prikazano na slici 5C, nivoi p-p38 su bili visoko povećani u grupama stimulisanim -MSH, na oko 80 procenata u poređenju sa kontrolom. Nadalje, nakon tretmana sa IPA, IOE ili arbutinom, fosforilacija p38 je bila blago potisnuta. Ovi nalazi ukazuju na to da melanogeni inhibitorni efekti IPA i IOE mogu biti povezani sa JNK i p38 MAPK signalnim putevima.

Zatražite više: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501