Dizajniranje tirozinaze SiRNA pomoću više algoritama predviđanja i evaluacije njihovih antimelanogenih efekata

Abstract

Melanin je pigment proizveden iz tirozina u melanocitima. Iako melanin ima zaštitnu ulogu od oštećenja uzrokovanih UVB zračenjem, on je također povezan s razvojem melanoma i tamnijeg tona kože. Tirozinaza je kritičan enzim u sintezi melanina, koji reguliše korak koji ograničava brzinu tokom konverzije tirozina u DOPA i dopakinon. Da bismo razvili efikasnu terapiju interferencije RNK, dizajnirali smo skup melanina siRNA primjenom višestrukih programa predviđanja za smanjenje nivoa ljudske tirozinaze.

Prvo, 272 siRNA su prošle ciljnu procjenu pristupačnosti pomoću programa RNAxs. Zatim smo odabrali 34 siRNA sekvence sa ΔG većim od ili jednakim -34.6 kcal/mol, i-Score vrijednošću većom ili jednakom 65, a rezultatom siRNA na skali manjim ili jednakim 30. siRNA su dizajnirane kao 19-bp RNA duplekse sa asimetričnim 3' previsom na 3' kraju antisens lanca. Testirali smo da li su ove siRNA efektivno smanjile ekspresiju gena tirozinaze koristeći qRT-PCR i otkrili da je 17 siRNA sekvenci efikasnije od komercijalno dostupne siRNA. Tri dalje testirane siRNA su pokazale efikasnu vizuelnu promjenu boje u MNT-1 ljudskim ćelijama bez citotoksičnih efekata, što ukazuje da su ove sekvence antimelanogene. Naša studija je otkrila da se siRNA ljudske tirozinaze mogu efikasno dizajnirati korištenjem više algoritama za predviđanje.

U našim istraživanjima je utvrđeno da Cistanche deserticola ima učinak izbjeljivanja, način pripreme ekstrakta Cistanche deserticola tuberculosis i kozmetike za izbjeljivanje i anti-aging, metoda pripreme Cistanche deserticola tuberculosis ekstrakta se sastoji od drobljenja, sirove ekstrakcije, centrifugiranja i sakupljanja sirovi ekstrakt, i Nakon mirovanja, eluiranja i sušenja, dobije se ekstrakt Cistanche cistanche. Način pripreme je jednostavan i bez zagađenja, sadržaj ehinakozida u ekstraktu je veći ili jednak 25 posto, sadržaj verbaskozida veći ili jednak 55 posto, a sadržaj ukupnih glikozida je veći ili jednak 80 posto; Nakon ispitivanja antioksidativne aktivnosti i dr., dokazano je da ekstrakt cistanche deserticola ima antioksidativno, izbjeljujuće i anti-age efekte. Dodaje se kozmetici za pripremu kozmetike za izbjeljivanje i starenje, a kozmetika je testirana na citotoksičnost i sigurnost, te je potvrđeno da je kozmetika sigurna i neiritirajuća, te da ima dobar učinak izbjeljivanja.

Kliknite na zdravstvene prednosti cistanchea

Ključne riječi:

Tirozinaza, melanin, siRNA, melanociti, izbjeljivanje.

UVOD

Boju ljudske kože uglavnom određuje pigment melanin, koji proizvode melanociti u epidermi. Proizvodnja melanina se inducira nakon izlaganja kože ultraljubičastom zračenju, a transportuje se do keratinocita na način posredovan vezikulom (Slominski et al., 2004). Dvije vrste melanina, eumelanin i feomelanin, proizvode se iz L-tirozina kroz proces u više koraka. Eumelanin je tamni, smeđe-crni netopivi polimer odgovoran za tamnu boju kože (Slominski et al., 2004). Korak koji ograničava brzinu melanogeneze je pretvaranje L-tirozina u L-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) pomoću tirozinaze (Lerner i Fitzpatrick, 1950; Hearing Tsukamoto, 1991). Za kozmetičke i farmaceutske svrhe razvijeni su mnogi agensi koji inhibiraju tirozinazu za kontrolu pigmentacije kože, kao što su hidrokinon (1,4-dihidroksibenzen), arbutin, azelaična kiselina (1,7-heptan dikarboksilna kiselina), i drugi (Gillbro i Olsson, 2011). Iako su njihovi antipigmentacijski učinci dobro utvrđeni, rizik od nuspojava doveo je do oklijevanja za kontinuiranu upotrebu inhibitora tirozinaze, kao što pokazuju formulacije hidrokinona s koncentracijama preko 1 posto koje su zabranjene u Europi (Gillbro i Olsson, 2011. ).

Interferencija RNA (RNAi) je prvi put otkrivena kao antivirusni odbrambeni mehanizam u nematodi Caenorhabditis elegans u kojoj dvolančane RNA (dsRNA) pokreću utišavanje gena komplementarnih sekvenci mRNA (Fire et al., 1998). Nakon toga, uočeno je da se umjetno sintetizirane kratke interferirajuće RNK (siRNA) obrađuju u stanicama sisara (Elbashir et al., 2001a). RNAi obrada se sastoji od nekoliko koraka; Generisanje siRNA cijepanjem dsRNA od strane Dicera, sastavljanje siRNA s RNA-induciranim kompleksom za utišavanje (RISC), razdvajanje siRNA lanaca (osjetni (putnički) i antisense (vodič) lanac), vezivanje antisens lanca za mRNA s komplementarnim sekvenca, i degradacija mRNA od strane Argonaute 2 (Ago2) (Engels, 2013).

Strukturne karakteristike siRNA su proučavane decenijama. Klasična struktura siRNA zahtijeva odgovarajuću dužinu dupleksa, 3' prevjesa i asimetričnu strukturu. Iz studije na Drosophila melanogaster, predloženo je da standardni dizajn siRNA budu dsRNA od 21 nt sens/antisense lanaca koji formiraju stabljiku dsRNA od 19 parova baza (bp) sa 2 nt 3' prevjesa na oba kraja (Elbashir et al., 2001b ). Međutim, u ćelijama sisara, nedavne studije su pokazale da nekanonska siRNA može biti jednako efikasna kao i klasična siRNA ili bi se čak mogla poboljšati varijacijama u dužini, simetriji i nadvišenju. siRNA bez 3' prepusta(a) (Czauderna et al., 2003; Rose et al., 2005; Chang et al., 2007) i one duže (Kim et al., 2005) ili kraće (Chu i Rana, 2008 ) od 19 bp su takođe bili efikasni u utišavanju gena u ćelijama sisara. Asimetrija u 3' previsokoj strukturi, samo na antisens lancu, rezultirala je boljim performansama od simetričnih siRNA (Sano et al., 2008).

Za efikasno i specifično rušenje mRNA ciljeva, racionalan dizajn siRNA je kritičan. Algoritmi prve generacije za dizajn siRNA razvijeni su na osnovu termodinamičke stabilnosti (Schwarz et al., 2003.), preferencije položaja (Amarzguioui i Prydz, 2004.; Reynolds et al., 2004.; Ui-Tei et al., 2004.) i jedinstvenosti ciljne sekvence (Pancoska et al., 2004). Ove studije sugerirale su da su funkcionalne siRNA asimetrične u stabilnosti krajeva dupleksa što se vidi po nestabilnom 5' kraju lanaca vodiča i činjenici da 5' krajevi lanaca vodilja preferiraju baze A ili U. Dodatno, procjena ciljnog mjesta dostupnost između siRNA i mRNA je kritična i izračunava se na osnovu energije potrebne za otvaranje mjesta vezivanja i formiranje hibridizacije (Muckstein et al., 2006; Tafer et al., 2008). Da bi se poboljšala tačnost predviđanja, algoritmi druge generacije su koristili nove modele sa velikim brojem opservacija. Primijenili su model umjetne neuronske mreže (Huesken et al., 2005) ili model linearne regresije (Shabalina et al., 2006; Vert et al., 2006; Ichihara et al., 2007).

U ovoj studiji uzeli smo u obzir različite uslove kako bismo dizajnirali efikasne siRNA humane tirozinaze. Da bismo maksimizirali efikasnost u dizajnu siRNA, kombinirali smo poznate kriterije za evaluaciju korištenjem više algoritama dizajna siRNA (RNAxs, i-Score i siRNA skale): dostupnost ciljanog mjesta, GC sadržaj, relativna termodinamička stabilnost na oba kraja, kao i drugi kriteriji. Nadalje smo demonstrirali inhibitorni učinak odabranih siRNA na proizvodnju melanina u ljudskim ćelijama melanoma.

MATERIJALI I METODE

Kombinatorna primjena algoritama i sinteze siRNA dizajna

Za sekvencu mRNA humane tirozinaze (TYR), korištena je referentna sekvenca (RefSeq id NM{{0}}) iz NCBI baze podataka nukleotida. Za procjenu pristupačnosti cilja korišten je alat za dizajn RNAxs. RNAxs kombinuje poznate kriterijume funkcionalnosti siRNA (asimetrija, samosavijanje, slobodni kraj) sa pristupačnošću RISC ciljne lokacije (Tafer et al., 2008). 272 siRNA je prošlo sa zadanim parametrima (8 nt prag pristupačnosti; 0.01157, 16 nt prag pristupačnosti; 0.001002, energija samopreklapanja; 0,9022, asimetrija sekvence; 0,5 energetska asimetrija; 0,4655, slobodni kraj; 0,625) po svim kriterijumima i rangirani su po bodovu. i-Score i siRNA skale su zasnovane na modelu linearne regresije i obučene su korištenjem skupa podataka Hueskena (Huesken et al., 2005). I-Score (inhibicijski-score) algoritam izračunava ΔG vrijednosti siRNA lanaca, dinukleotida na 5' i 3' krajevima, maksimalnu dužinu GC rastezanja i GC sadržaj (Ichihara et al., 2007). Ovaj algoritam identifikuje preferiranu bazu za svaki položaj nukleotida izračunavanjem rezultata inhibicije (i-Score). Također, da bismo poboljšali preciznost dizajna rezultata, odabrali smo manje termostabilne siRNA sa cijelim ΔG vrijednostima većim ili jednakim -34.6 kcal/mol (Ichihara et al., 2007). siRNA skale izračunavaju stabilnost 5' i 3' krajeva i ukupni GC sadržaj (Matveeva et al., 2007). Primijenili smo filtere da rezultati budu iScore veći od ili jednaki 65 i siRNA skale manji ili jednaki 30. Sve siRNA za TYR sintetizirao je Bioneer Inc. (Daejeon, Koreja) kao 21-meri sa 3 ' previse na antisense niti. Pogledajte Tabelu 1 za punu listu siRNA.

Ćelijska kultura

Visoko pigmentiranu ćelijsku liniju ljudskog melanoma MNT{{0}} ljubazno je obezbijedio dr. Minsoo Noh (Seul National University, School of Pharmacy). Ćelije su održavane u minimalnom esencijalnom mediju (MEM) sa dodatkom 20 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 10 posto Dulbecco-ovog modificiranog orlovskog medija (DMEM) i gentamicina (50 ug/mL). Tripsin (0,25 posto) i etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA) su nabavljeni od Gigbco-BRL, a 20 mM HEPES kupljeno je od Sigme (St. Louis, MO, SAD). Ćelije su održavane na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 u zraku.

siRNA transfekcija

Lipofectamine 2000 (11668-027, Invitrogen, Waltham, MA, SAD) ili DharmaFECT (T-2001-02, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) korišten je za transfekciju ćelija prema protokolu proizvođača. 34 anti-Tyrosinase siRNA i neciljane siRNA su kupljene od Bioneer Inc. Pozitivna kontrola siRNA je kupljena od Santa Cruza (#sc-36766, Santa Cruz, Dallas, TX, USA). MNT-1 ćelije su uzgojene do 60 posto konfluencije i transficirane sa Lipofectamine ili DharmaFECT reagensom u zavisnosti od protokola proizvođača.

Imunoblot analiza

Imunoblot analiza MNT-1 ćelije su lizirane puferom za lizu (20 mM tris pH 7,5,5 mM EDTA, 10 mM Na4 P2 O7, 100 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 1 posto NP-40, 1 mM PMSF, 10 ug/mL aprotinina i 10 ug/mL leupeptina) i 15 ug proteina podvrgnuti su SDS-PAGE i prebačeni na nitroceluloznu membranu. Membrane su inkubirane sa antitijelom protiv tirozinaze (#sc-7834, Santa Cruz). Trake su vizualizovane pomoću sistema za snimanje ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) i kvantifikovane pomoću softvera ImageJ (ver. 1.44p, NIH, SAD).

Mjerenje sadržaja melanina

Sadržaj melanina je mjeren kao što je prethodno opisano (Hosoi et al., 1985) uz neke modifikacije. Ukratko, MNT-1 ćelije su posađene na 6-ploče (6×105 ćelija/jažici) i transficirane sa siRNA. 48 h i 168 h nakon transfekcije, ćelije su isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) i sakupljene. Nakon ispiranja sa PBS, ćelijske pelete su rastvorene u 1 mL 1 N NaOH koji sadrži 10 procenata DMSO i inkubirane 1 h na 80 stepeni. Apsorbancija rastvora je merena na 450 nm. Sadržaj melanina je izračunat na osnovu standardne krive dobijene od sintetičkog melanina.

Test vitalnosti ćelije (XTT test)

XTT test (kat# 11465015001, Roche, Pleasanton, Kalifornija, SAD) je izveden prema protokolu proizvođača. Ukratko, 6×105 MNT1 ćelija/jažici su postavljene u ploče sa 6-jažicama. Sljedećeg dana ćelije su transficirane pojedinačnim siRNA. Nakon 24 h, ćelije su postavljene u 96- mikroploče u 5 kopija, a zatim su dodatno održavane naznačeni broj dana. Za XTT test, 50 μL XTT mješavine za označavanje (XTT-reagens za označavanje: reagens za elektronsko spajanje=50:1 da bi se postigla konačna XTT koncentracija od 0,3 mg/mL) je dodano u svaku jažicu i ploče su inkubirane na 37 stepeni u atmosferi sa 5 procenata CO2 tokom 4 h. Apsorpcija je mjerena čitačem ploča za enzimski imunosorbentni test na 450 nm.

Izolacija RNK i kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze (PCR) u realnom vremenu

Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija korišćenjem easy-BLUE kompleta (TRIzol reagens, iNtRON, Seongnam, Koreja), prema protokolu proizvođača. TRIzol je uklonjen dodatkom hloroforma i mRNA je precipitirana sa izopropanolom. Precipitati RNK su isprani sa 75 posto etanola. Optičke gustine na 260 i 280 nm mjerene su UV spektrometrom za procjenu količine i čistoće RNK, a integritet RNK je potvrđen elektroforezom u agaroznom gelu. Gene-specifični prajmeri su dizajnirani da pojačaju ljudsku tirozinazu (TYR), faktor nekroze tumora (TNF), interleukin 6 (IL6) i kućni gen gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) za internu kontrolu. Sljedeći parovi prajmera su korišteni za TYR (F: 5′-GCCAACGATCCTAT CTTCCTTC-3′, R: 5′-GTGCATTGGCTTCTGGATAAAC-3′), TNF (F: 5′-GAGGCCAATGCC-3′), TNF (F: 5′-GAGGCCAATGCC-3′) ′, R: 5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′), IL6 (F: 5′-CTGGATTCAATGAGGAGACTTG-3′ R: 5′-CACTACTCTCAAATCTGTTCTGG-3′: 5′-CACTACTCTCAAATCTGTTCTGG-3′: -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′, R: 5′-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3′). Sve amplifikacije su sprovedene korišćenjem pre-smeše (20 μL) koja sadrži 500 nmol/L gen-specifičnih prajmera i 2 μL šablonske RNK pod sledećim uslovima: denaturacija na 95 stepeni u trajanju od 1 min, nakon čega sledi 45 ciklusa od 95 stepeni za 20 s, 58 stepeni za 20 s i 72 stepena za 25 s, sa konačnim produženjem na 72 stepena u trajanju od 5 minuta.

Statistička analiza

Grafički podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD. Statistička značajnost među tri primjerka i među grupama određena je korištenjem jednosmjerne ili dvosmjerne analize varijanse (ANOVA) praćene Bonferronijevim višestrukim upoređivanjem nakon testa ili Studentovim t-testom, respektivno. Značaj je pretpostavljen kada je str<0.05.

REZULTATI

Dizajn siRNA humane tirozinaze

Da bismo izgradili efikasan skup siRNA koji cilja ljudsku tirozinazu, primijenili smo bioinformatičke alate kombinirajući nekoliko naprednih modela predviđanja. Dobili smo referentnu sekvencu mRNA (RefSeq id NM_000372) iz NCBI nukleotidnog skupa podataka za ljudsku tirozinazu i isključili 5'UTR i 3'UTR regije iz predviđanja jer mogu ometati RISC funkciju (Elbashir et al., 2002). Prvo, sekvencija je procijenjena za dostupnost RISC ciljnom mjestu korištenjem RNAxs softvera, što se smatra važnim faktorom za ograničavanje endonukleolitičke aktivnosti RISC (Tafer et al., 2008). Osim ciljane pristupačnosti, ovaj algoritam također procjenjuje energiju samopreklapanja i asimetriju sekvence kako bi izračunao rezultate.

Iz ovog algoritma, 272 19-mere dvolančane sekvence (17 posto od 1.572 sekvence) prešle su zadani prag. Sekvence su takođe evaluirane pomoću dva algoritma druge generacije zasnovana na modelima linearne regresije: i-Score (inhibitorni-Score) (Ichihara et al., 2007) i siRNA skale (Matveeva et al., 2007). I-Score i siRNA algoritmi skale uzimaju u obzir preferenciju koja zavisi od položaja nukleotida. siRNA skale izračunavaju lokalnu dupleks stabilnost i ukupni G/C sadržaj za procjenu funkcionalnih siRNA. Primijenili smo filtere za i-Score veći od ili jednak 65 i siRNA skale manje od ili jednake 30, sa cijelim ΔG većim ili jednakim -34.6 kcal/mol. Otkrili smo da je i-Score bio strožiji, prolazeći 191 sekvencu (12 posto), dok su skale siRNA bile manje stroge, prolazeći 47 posto sekvenci. Konačno, dobijena je 71 siRNA koja je zadovoljila kriterije sva tri algoritma dizajna siRNA. Kada su primijenjena cjelokupna ograničenja ΔG vrijednosti, samo 34 siRNA (2,2 posto) su konačno prošle bez efekata izvan cilja, što je utvrđeno korištenjem NCBI baze podataka nukleotida (sl. 1A, 1B). Za ovu studiju dizajnirali smo 19-bp RNA duplekse sa asimetričnim 2-nt previsom na 3' kraju antisens lanca za bolje performanse kao što je predloženo (slika 1C) (Rose et al., 2005. Sano et al., 2008.). Pune sekvence siRNA su navedene u Tabeli 1.

Procjena efikasnosti siRNA tirozinaze u ćelijskoj liniji humanog melanoma MNT-1

Da bismo procijenili efikasnost siRNA odabranih alatima za dizajn siRNA, transficirali smo MNT{{0}} ćelije sa 34 pojedinačne siRNA i izmjerili ekspresiju mRNA tirozinaze (TYR) pomoću qRT-PCR. Kao što je prikazano u eksperimentalnoj šemi opisanoj na slici 2A, nivoi ekspresije mRNA tirozinaze su izmjereni 2. dan nakon transfekcije. 34 siRNA su smanjile nivoe mRNA tirozinaze u prosjeku za 57,8 posto (SD=0.141) u prvom skriningu. 13 siRNA je bilo efikasnije od komercijalno dostupne siRNA, koja je korišćena kao pozitivna kontrola (PC) sa značajnošću (slika 2B, tabela 2). Dalje smo kvantificirali mRNA tirozinaze kako bismo potvrdili efikasnost 6 najefikasnijih (#16, 17, 23, 26, 28 i 31) i 3 najmanje efikasne (#2, 3 i 5) siRNA. Do prvog skrininga, 6 najefikasnijih siRNA efikasno je srušilo ekspresiju tirozinaze (0.294- puta u odnosu na NC) i također efikasnije od pozitivne kontrole (0.39- puta u odnosu na NC), dok su 3 najmanje efikasne siRNA pokazale sličnu ili nižu efikasnost (sl. 3A, 3B).

U drugom skriningu, čak i najmanje efikasne siRNA su srušile ekspresiju tirozinaze otprilike 0.5- puta. Da vidimo da li siRNA smanjuju nivoe proteina tirozinaze, izvršili smo imunoblot analizu. Kao rezultat nivoa mRNA, nivo proteina tirozinaze je efektivno smanjen (slika 3C). Generalno, 6 najefikasnijih siRNA je pokazalo bolje performanse od 3 najmanje efikasne. Uzimajući u obzir efektivno obaranje koje pružaju čak i naše najlošije siRNA, naši rezultati podržavaju ideju da je proizvodnja siRNA kombinacijom više algoritama dizajna siRNA bila efikasan pristup.

Anti-melanogeni efekat siRNA u MNT-1 ćelijama

Gore navedeni rezultati pokazuju da bi siRNA koje smo dizajnirali mogle smanjiti sintezu melanina u stanicama koje proizvode melanin. Da bismo testirali efekat naših siRNA (#16, 17, 26) na sintezu melanina pomoću tirozinaze, izmjerili smo sadržaj melanina u siRNA transficiranim MNT-1 ćelijama. Kao što je prikazano na slici 4A (gornja), sadržaj melanina je samo minimalno promijenjen drugog dana nakon transfekcije. Međutim, kada je 7. dana analiziran sadržaj melanina, otkriven je antimelanogeni efekat ovih siRNA (slika 4A, niže). Kolorimetrijsko mjerenje ovih uzoraka (7. dan) pokazalo je da sve siRNA značajno smanjuju sadržaj melanina (p<0.001). siRNAs #16 and 17 were as effective as the positive control in reducing melanin content by approximately 0.55-fold (0.56-fold by P.C.) although siRNA #26 was less effective (~0.74-fold) (Fig. 4B). These data show that the siRNAs we designed are effective in reducing melanin synthesis in cells.

Utjecaj siRNA na vitalnost stanica

Neke siRNA dovode do toksičnosti, utječući na vitalnost stanice neciljnim efektima koji se odnose na rast, smrt i druga svojstva ćelije. Da bismo utvrdili da li ove siRNA dovode do toksičnosti ćelije, analizirali smo vitalnost ćelije posmatrajući promjene u morfologiji ćelije i XTT testovima u siRNA-transficiranim MNT-1 ćelijama. Dan 1 ili 2 nakon transfekcije siRNA (#16, 17, 26 i PC), nije uočena značajna promjena u ćelijskoj morfologiji (slika 5A). Dodatno, nije uočena nikakva uočljiva promena u vitalnosti ćelija izmerena XTT testom (slika 5B). Dalje smo testirali da li ove siRNA mogu izazvati imuni odgovor mjerenjem nivoa mRNA TNF i IL-6. siRNA #16 i 17 nisu uticali na ekspresiju TNF mRNA, dok je #26 pokazao porast od oko 18-puta iu golim iu uslovima uz pomoć liposoma (slika 5C).

Međutim, nivo nije bio veći od onog kod pozitivne kontrole (PC). Nasuprot tome, IL-6 je bio povećan sa sve tri siRNA u uslovima uz pomoć liposoma, dok pozitivna kontrola nije pokazala nikakav štetan efekat. Posebno, siRNA #26 i PC su pokrenuli imunološke odgovore čak iu golom stanju, u kojem nije otkrivena redukcija mRNA tirozinaze. Sve u svemu, naši podaci su pokazali da je kombinovanje algoritama za dizajn siRNA efikasan pristup za razvoj novih sekvenci siRNA. Osim toga, odabrane siRNA (#16 i 17) bile su efikasne u suzbijanju sinteze ljudskog melanina, što sugerira da bi se ove siRNA mogle dalje razvijati kao nove siRNA sekvence za upotrebu u biomedicinskim istraživanjima i kozmetičkim poljima.

DISKUSIJA

Sredstva za posvjetljivanje kože korisna su u kozmetičke svrhe i mnoge su takve formulacije razvijane decenijama. Trenutno su dostupni različiti agensi s različitim mehanizmima djelovanja kao što su inhibicija tirozinaze (hidrokinon, azelainska kiselina, arbutin), stimulacija obrta keratinocita i smanjenje prijenosa melanosoma (retinoidi), helacija bakra (kojična kiselina i askorbinska kiselina), i inhibicija sazrevanja melanozoma (arbutin) (Sheth i Pandya, 2011). Tirozinaza je enzim koji ograničava brzinu proizvodnje melanina iz melanocita (Lerner i Fitzpatrick, 1950; Hearing i Tsukamoto, 1991). Ovdje smo nastojali smanjiti ekspresiju tirozinaze primjenom siRNA tirozinaze dizajniranih korištenjem višestrukih alata za predviđanje.

Efikasan dizajn siRNA je ključan, jer čak i suptilne promjene sekvence mogu značajno promijeniti funkcionalnost. Trenutno su razvijeni brojni algoritmi za dizajn siRNA i ovi algoritmi smatraju da su različiti faktori kritični za funkcionalnost, kao što su pristupačnost cilja, sekundarne strukture mRNA i preferencije položaja siRNA sekvence. Predložene su rane studije o pravilima za preferirane uzorke siRNA sekvence: N2SN17WN2 prema Ui-Tei pravilu (Ui-Tei et al., 2004), N4AN6TN2HN5WN2 od Reynoldsa (Reynolds et al., 2004), itd. Ova pravila također obično ukazuju da je asimetrična struktura siRNA kritična: potrebno je više A/U baza na 5'-kraju antisens lanca, dok je više G/C baza potrebno na 5'-kraju osjetilnog lanca. Smatra se da nizak sadržaj GC na 5'-kraju antisens lanca pomaže u odmotavanju i inkorporaciji siRNA dupleksa u RISC kompleks.

Algoritmi i-Score i siRNA skale izračunavaju preferenciju nukleotida na svakoj poziciji siRNA pored ostalih faktora. Iz tog razloga, rezultati iz algoritama i-Score i siRNA skala pokazali su blagu do umjerenu korelaciju (R2 =0.4309) (podaci nisu prikazani), a uključena je većina siRNA koje su zadovoljile zahtjeve i-Score algoritma u siRNA skalama. Naši rezultati su takođe pokazali da je podrazumevani prag koji obezbeđuju siRNA skale manje strog od i-Score (47 procenata prema 12 procenata od ukupnog broja).

Prethodne studije su sugerirale da su vrijednosti ΔG sekundarne strukture siRNA kritična determinanta efikasnosti siRNA (Ichihara et al., 2007; Ladunga, 2007). Posebno, siRNA sa ΔG vrijednostima manjim od -34.6 kcal/mol, koje su termodinamički stabilne, pokazale su slabu knockdown efikasnost (Ichihara et al., 2007). Kada smo izračunali koeficijent korelacije između ΔG vrijednosti i nivoa supresije koristeći naše podatke, nije uočena značajna korelacija (podaci nisu prikazani). Međutim, pošto smo ispitali samo mali broj siRNA, ne možemo zaključiti da ΔG vrijednosti nisu statistički povezane sa efikasnošću siRNA. Da bi se odredio učinak cijelih vrijednosti ΔG na aktivnost siRNA, potreban je veliki broj uzoraka i siRNA sa nižim vrijednostima ΔG u cijelosti treba dodati u test radi poređenja.

Kolektivno smo dizajnirali siRNA ljudske tirozinaze koristeći više algoritama i parametara i identificirali visoko efikasne siRNA koje mogu biti korisne u kozmetičkom polju. Mnoge siRNA se trenutno razmatraju za upotrebu u biomedicini i kozmetici i testirane su u kliničkim ispitivanjima širom svijeta. Međutim, za široku upotrebu aplikacija baziranih na siRNA, neke prepreke još uvijek treba riješiti, kao što su pitanja sigurnosti, stabilnosti i isporuke.

ZAHVALNICA

Ova studija je podržana grantom Leaders Cosmetics, Samsung L&S Co., Ltd (#2015/05/20-31) i Programom osnovnih naučnih istraživanja kroz Nacionalnu istraživačku fondaciju Koreje (KRF) koju finansira Ministarstvo Obrazovanje (2016R1D1A1B01012515).

REFERENCE

Amarzguioui, M. i Prydz, H. (2004) Algoritam za odabir funkcionalnih siRNA sekvenci. Biochem. Biophys. Res. Commun. 316, 1050-1058.

Chang, CI, Hong, SW, Kim, S. i Lee, DK (2007) Studija odnosa strukture i aktivnosti siRNA sa strukturnim varijacijama. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 997-1003.

Chu, CY i Rana, TM (2008) Potentni RNAi kratkim RNA okidačima. RNA 14, 1714-1719.

Czauderna, F., Fechtner, M., Dames, S., Aygun, H., Klippel, A., Pronk, GJ, Giese, K. i Kaufmann, J. (2003) Strukturne varijacije i stabilizirajuće modifikacije sintetičkih siRNA u ćelije sisara. Nukleinske kiseline Res. 31, 2705-2716.

Elbashir, SM, Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. i Tuschl, T. (2001a) Dupleksi 21-nukleotidnih RNK ​​posreduju u interferenciji RNA u kultivisanim ćelijama sisara. Priroda 411, 494-498.

Elbashir, SM, Harborth, J., Weber, K. i Tuschl, T. (2002) Analiza funkcije gena u ćelijama somatskih sisara koristeći male interferirajuće RNK. Metode 26, 199-213.

Elbashir, SM, Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. i Tuschl, T. (2001b) Funkcionalna anatomija siRNA za posredovanje efikasnog RNAi u lizatu embrija Drosophila melanogaster. EMBO J. 20, 6877-6888.

Engels, JW (2013) Utišavanje gena hemijski modifikovanim siRNA. N. Biotechnol. 30, 302-307.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, MK, Kostas, SA, Driver, SE i Mello, CC (1998) Potentna i specifična genetska interferencija dvolančane RNK u Caenorhabditis elegans. Priroda 391, 806-811.

Gillbro, JM i Olsson, MJ (2011) Melanogeneza i mehanizmi sredstava za posvjetljivanje kože--postojećih i novih pristupa. Int. J. Cosmet. Sci. 33, 210-221.

Hearing, VJ i Tsukamoto, K. (1991) Enzimska kontrola pigmentacije kod sisara. FASEB J. 5, 2902-2909.

Hosoi, J., Abe, E., Suda, T. i Kuroki, T. (1985) Regulacija sinteze melanina B16 ćelija mišjeg melanoma pomoću 1 alfa, 25-dihidroksi vitamina D3 i retinoične kiseline. Cancer Res. 45, 1474-1478.

Huesken, D., Lange, J., Mickanin, C., Weiler, J., Asselbergs, F., Warner, J., Meloon, B., Engel, S., Rosenberg, A., Cohen, D., Labow, M., Reinhardt, M., Natt, F. i Hall, J. (2005) Dizajn biblioteke siRNA u cijelom genomu korištenjem umjetne neuronske mreže. Nat. Biotechnol. 23, 995-1001.

Ichihara, M., Murakumo, Y., Masuda, A., Matsuura, T., Asai, N., Jijiwa, M., Ishida, M., Shinmi, J., Yatsuya, H., Qiao, S., Takahashi, M. i Ohno, K. (2007) Termodinamička nestabilnost siRNA dupleksa je preduslov za pouzdano predviđanje aktivnosti siRNA. Nukleinske kiseline Res. 35, e123.

Kim, DH, Behlke, MA, Rose, SD, Chang, MS, Choi, S. i Rossi, JJ (2005) Sintetički dsRNA Dicer supstrati povećavaju potenciju i efikasnost RNAi. Nat. Biotechnol. 23, 222-226.

Ladunga, I. (2007) Potpunije utišavanje gena uz manje siRNA: transparentan optimizirani dizajn i biofizički potpis. Nukleinske kiseline Res. 35, 433-440.

Lerner, AB i Fitzpatrick, TB (1950) Biohemija formiranja melanina. Physiol. Rev. 30, 91-126.

Matveeva, O., Nechipurenko, Y., Rossi, L., Moore, B., Saetrom, P., Ogurtsov, AY, Atkins, JF i Shabalina, SA (2007) Poređenje pristupa racionalnom dizajnu siRNA koji vodi ka novom efikasan i transparentan metod. Nukleinske kiseline Res. 35, e63.

Muckstein, U., Tafer, H., Hackermuller, J., Bernhart, SH, Stadler, PF i Hofacker, IL (2006) Thermodynamics of RNA-RNA binding. Bioinformatika 22, 1177-1182.

Pancoska, P., Moravek, Z. i Moll, UM (2004) Efikasna interferencija RNK zavisi od globalnog konteksta ciljne sekvence: kvantitativna analiza efikasnosti utišavanja korišćenjem Eulerovog grafskog prikaza siRNA. Nukleinske kiseline Res. 32, 1469-1479.

Reynolds, A., Leake, D., Boese, Q., Scaringe, S., Marshall, WS i Khvorova, A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotechnol. 22, 326-330.

Rose, SD, Kim, DH, Amarzguioui, M., Heidel, JD, Collingwood, MA, Davis, ME, Rossi, JJ i Behlke, MA (2005.) Funkcionalni polaritet je uveden Dicer obradom kratkih supstratnih RNK. Nukleinske kiseline Res. 33, 4140-4156.

Sano, M., Sierant, M., Miyagishi, M., Nakanishi, M., Takagi, Y. i Sutou, S. (2008) Efekat asimetričnih terminalnih struktura kratkih RNA dupleksa na aktivnost interferencije RNA i selekciju lanca. Nukleinske kiseline Res. 36, 5812-5821.

Schwarz, DS, Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N. i Zamore, PD (2003) Asimetrija u sklapanju RNAi enzimskog kompleksa. Ćelija 115, 199-208.

Shabalina, SA, Spiridonov, AN i Ogurtsov, AY (2006) Računski modeli sa termodinamičkim i sastavnim karakteristikama poboljšavaju dizajn siRNA. BMC Bioinformatika 7, 65.

Sheth, VM i Pandya, AG (2011) Melasma: sveobuhvatno ažuriranje: dio II. J. Am. Akad. Dermatol. 65, 699-714.

Slominski, A., Tobin, DJ, Shibahara, S. i Wortsman, J. (2004) Pigmentacija melanina u koži sisara i njena hormonska regulacija. Physiol. Rev. 84, 1155-1228.

Tafer, H., Ameres, SL, Obernosterer, G., Gebeshuber, CA, Schroeder, R., Martinez, J. i Hofacker, IL (2008) Utjecaj pristupačnosti ciljanog mjesta na dizajn efektivnih siRNA. Nat. Biotechnol. 26, 578-583.

Ui-Tei, K., Naito, Y., Takahashi, F., Haraguchi, T., Ohki-Hamazaki, H., Juni, A., Ueda, R. i Saigo, K. (2004) Smjernice za odabir visoko efikasnih siRNA sekvenci za interferenciju RNK sisara i pilića. Nukleinske kiseline Res. 32, 936-948.

Vert, JP, Foveau, N., Lajaunie, C. i Vandenbrouck, Y. (2006) Tačan i interpretabilan model za predviđanje efikasnosti siRNA. BMC Bioinformatika 7, 520.
Ok-Seon Kwon1,†, Soo-Jung Kwon1,†, Jin Sang Kim2, Gunbong Lee2, Han-Joo Maeng3, Jeongmi Lee4, Gwi Seo Hwang5, Hyuk-Jin Cha1,* i Kwang-Hoon Chun3,*.

Odeljenje za životne nauke, Univerzitet Sogang, Seul 04107.

2 Leaders Cosmetics Co., Ltd., Anseong 17599.

3 Gachon Institute of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Gachon University, Incheon 21936.

4 Farmaceutski fakultet, Univerzitet Sungkyunkwan, Suwon 16419.

5 Laboratorij za istraživanje diferencijacije ćelija, Koledž korejske medicine, Univerzitet Gachon, Seongnam 13120, Republika Koreja.

For more information:1950477648nn@gmail.com