Istraživanje efekta hipertireoze na stres endoplazmatskog retikuluma i potencijal tranzitnih receptora Canonical 1 Channel u bubregu
Mar 14, 2022
za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT1,*,Erhan ŞAHİN2, Sedat KAÇAR2, Rıdvan BAĞCI3, Şerife KARAKAYA2,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ2, Varol ŞAHİNTÜRK2
1Odsjek za histologiju i embriologiju, Medicinski fakultet Univerziteta Atılım, Ankara, Turska2Katedra za histologiju i embriologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet Osmangazi, Ankara, Turska 3Odsjek IVF jedinice Androloška laboratorija, Gradska obrazovna i istraživačka bolnica Adana, Adana, Turska
Pozadina/cilj:Hipertireozaje povezan s rezultatima u povećanju brzine glomerularne filtracije, kao i povećanju aktivacije renin-angiotenzin-aldosterona. Poremećaj Ca2 plus homeostaze u endoplazmatskom retikulumu (ER) povezan je s mnogim bolestima, uključujući dijabetičku nefropatiju ihipertireoza. Kanal prolaznog receptorskog potencijala kanonski 1 (TRPC1) je prvi klonirani protein iz porodice TRPC. Iako je izražen na mnogim mjestima ububreg, njegova funkcija je neizvjesna. TRPC1 je uključen u regulaciju Ca2 plus homeostaze, a njegova regulacija povećava nivo ER Ca2 plus, aktivira neokrenuti proteinski odgovor, što dovodi do ćelijskog oštećenja ububreg. Ova studija je istraživala ulogu TRPC1 ububrezihipertireoidnih štakora u smislu markera ER stresa koji su glukozom regulirani protein 78 (GRP78), aktivirajući transkripcijski faktor 6 (ATF6), (endoplazmatska retikulum kinaza slična protein kinazi R (PKR)) (PERK), enzim 1 koji zahtijeva inozitol (IRE1).
Materijali i metode: Dvadeset mužjaka pacova raspoređeno je u kontrolne i hipertireoidne grupe (n=10).Hipertireozaje indukovano dodavanjem 12 mg/L tiroksina u vodu za piće pacova tokom 4 nedelje. Izmjereni su T3 i T4 bez seruma (fT3, fT4), TSH, azot ureje u krvi (BUN) i kreatinina. Histohemijska analizabubregrađeni su preseci za morfološke promene, kao i imunohistohemijska i Western blot analiza preseka bubrega na GRP78, ATF6, PERK, IRE1, TRPC1 antitela.
Rezultati: Nivoi TSH, BUN i kreatinina su se smanjili, dok su se nivoi fT3 i fT4 povećali kod hipertireoidnih štakora. Morfološka analiza je rezultirala zadebljanjem kapilarne bazalne membrane u glomerulima i western blotom, a imunohistohemijski rezultati su pokazali povećanje TRPC1, GRP78 i ATF6 kod hipertireoidnog štakora (p <>
Zaključak: U zaključku, u našem istraživanju smo po prvi put pokazali da je odnos između ER stresa i TRPC1 i njihove povećane ekspresije uzrokovao oštećenje bubrega kod hipertireoidnih štakora.
Ključne riječi:Hipertireoza, stres endoplazmatskog retikuluma (ER), prolazni potencijal receptora kanonski 1 (TRPC1),bubreg, pacov
1. Uvod
Trijodtironin (T3) i tiroksin (T4) su tiroidni hormoni neophodni za normalan razvoj organa i metaboličke funkcije [1]. Osim toga, regulišu brzinu rasta, funkciju pumpe natrijuma/kalijuma, otkucaje srca, krvni pritisak, disanje, potrošnju kiseonika, probavu, metabolizam lipida, ugljenih hidrata i proteina, funkciju centralnog nervnog sistema, pokrete i metaboličke funkcije drugih endokrinih žlezda [2] .
Hipertireozaima mnogo efekata na holesterol, trigliceride, lipide, oksidaciju, antioksidanse, malondialdehid (MDA), enzim katalizator katalazu (CAT), enzime jetre, mokraćnu kiselinu, ureu, kreatinin i histopatološke promene u jetri i bubrezima [3]. Disfunkcija štitnjače utječe na fiziologiju i razvoj bubrega. U slučaju hipotireoze u kojoj štitna žlijezda slabije radi, smanjuje se bubrežna masa (odnos mase bubrega i tijela), dok u slučajuhipertireozakod kojih žlijezda intenzivno radi, bubrežna masa se povećava [4]. Međutim, teška hipertireoza rezultira degradacijom proteina i konačno atrofijom bubrega. Hipertireoza uzrokuje povećanje bubrežnog krvotoka (RBF) i brzine glomerularne filtracije (GFR) [5]. Kod hipertireoze, povećana je reapsorpcija natrijuma u proksimalnom tubulu, bazolateralna Na plus /K plus ATPaza [6], apikalni Na plus /H plus modifikator [7] i Na plus /Pi kotransporter [8] aktivacija. Također, hormon štitnjače aktivira modifikator Na plus/Ca2 plus, moguće putem cAMP-povezanog puta, čime se povećava apsorpcija kalcija ububrezi[9].
Kalcijum je drugi glasnik koji reguliše većinu ćelijskih funkcija, uključujući ekspresiju gena i ćelijsku homeostazu [10], oslobađanje neurotransmitera i funkciju neurona [11], metabolizam i modulaciju života ćelije [12]. Familija kanala prolaznog receptorskog potencijala (TRP) je jedna od najvećih familija katjonskih kanala. TRP familija je podijeljena na TRPC (kanonski), TRPM (melastatin), TRPP (policistin), TRPV (vaniloid), TRPML (bukolski), TRPA (ankirin) i TRPN (sličan NOMPC) podgrupama. Poznato je da TRPC proteini formiraju Ca2 plus propusne, neselektivne katjonske kanale i stoga igraju važnu ulogu u Ca2 plus transdukciji signala. Porodica TRPC sisavaca ima sedam članova pod nazivom TRPC1-TRPC7 [13]. Članovi TRPC porodice su izraženi u različitim dijelovimabubreg. TRPC1, koji igra ulogu posebno u dijabetičkoj nefropatiji, eksprimiran je gotovo svuda, u bubrežnim mezangijalnim stanicama, glomerulima, stanicama proksimalnih tubula i u tankom descendentnom dijelu Henleove petlje, ali je njegova točna funkcija još uvijek nepoznata [14].
Teški poremećaji Ca2 plus mogu izazvati oštećenje ćelija uzrokovano stresom endoplazmatskog retikuluma (ER) kao odgovor na različita patološka stanja [5,15]. Poremećaji Ca2 plus homeostaze u ER su povezani sa mnogim bolestima [16]. ER je intracelularna organela koja je važna za regulaciju Ca2 plus homeostaze i sintezu i savijanje proteina. Modulacija ekspresije/funkcije Ca2 plus permeabilnih kanala također utiče na intracelularne koncentracije Ca2 plus i posljedično Ca2 plus povezane procese kao što su proliferacija stanica, ER stres, apoptoza i autofagija. ER stres je stanje koje remeti redoks ravnotežu i luminalnu Ca2 plus homeostazu, uzrokujući nakupljanje nesavijenih/pogrešno savijenih proteina. Aktivacija nesavijenog proteinskog odgovora (UPR) uzrokuje povećanje glukozom reguliranog proteina 78 (GRP78), ER šaperona, što povećava kapacitet savijanja proteina ER [17]. Aktivacija ER stresa pokreće evolucijski konzervirani UPR pomoću tri glavna signalna pretvarača ER membrane: PERK, IRE1 i ATF6. Ćelijska disfunkcija i ćelijska smrt se javljaju u uslovima u kojima je ER stres hronično produžen, a proteinsko opterećenje na ER znatno premašuje. Poznato je da je jedan od puteva koji uzrokuju ćelijsku smrt uočenih u kroničnim bolestima kao što su hipoksija, ishemija/reperfuzijska ozljeda, neurodegeneracija, srčana oboljenja i dijabetes uzrokovan stresom ER [12].
U svjetlu svih ovih informacija, željeli smo istražiti odnos između puteva transdukcije TRPC1 signala i ER-stresa ububrezi, koji su generalno zahvaćeni uhipertireoza.
Kliknite zaCistanche se koristi za simptome bolesti bubrega
2. Materijali i metode
2.1. Životinje
Našu studiju je odobrio Lokalni komitet za etiku životinja Univerziteta Eskişehir Osmangazi (odluka br. 634 na sastanku br. 117 od 30.11.2017.) i slijedila je Vodič za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja koji su objavili Nacionalni instituti za zdravlje. Dvadeset odraslih (7–8 sedmica) mužjaka Wistar albino pacova, dobijenih iz Centra za medicinska i hirurška eksperimentalna istraživanja (TICAM), održavano je na 24 ± 2 stepena i 55 ± 5 posto vlažnosti tokom 12 sati u svetlom/mračnom okruženju tokom eksperiment. Životinje su smještene u polikarbonatne kaveze 2 sedmice prije eksperimenta i ostavljene da se prilagode ambijentalnim uvjetima, a zatim nasumično raspoređene u kontrolne i hipertireoidne grupe. Kontrolna grupa (eutireoidna) je tokom eksperimenta hranjena standardnom hranom za pacove i vodom iz slavine. Grupa za hipertireozu je uspostavljena standardnom hranom za pacove tokom 4 nedelje i pitkom vodom iz slavine koja sadrži 12 mg/L tiroksina [18]. Na kraju četvrte sedmice, pacovi su eutanazirani intramuskularnom injekcijom ketamina (45 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg). Odmah su od svih životinja uzeti uzorci intrakardijalne krvi. Cijelibubreziuklonjeni su postupkom nefrektomije. Zatim, desno i lijevobubrezipacova su uzdužno izrezani na dva dijela. I desni i lijevi dio bubrega korišteni su za Western blot i svjetlosnu mikroskopsku analizu
2.2. Biohemijske analize
Uzorci krvi su centrifugirani na 11,000 o/min tokom 10 minuta. Serumi su stavljeni u epruvete i čuvani na -80 stepeni do dana analize. Nivoi T3 (fT3), slobodnog T4 (fT4) i tireostimulirajućeg hormona (TSH) bez seruma su zatim izmjereni pomoću ELISA tehnike prema protokolu proizvođača. Nivoi ekspresije optičke gustine (OD) očitani su na 450 nm pomoću BioTek čitača mikroploča 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, SAD), a zatim su rezultati izračunati. Komercijalni kompleti za fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) i TSH (YLA0047RA) kupljeni su od Shanghai YL Biotech, Kina. Takođe, mereni su nivoi azota uree u serumu (BUN) i kreatinina metodom fotometrije apsorpcije od strane Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Švajcarska).
2.3. Histološka procjena
Bubregkomadi uzeti za ispitivanje na nivou svjetlosnog mikroskopa fiksirani su u 10 posto formaldehida 48 h. Nakon rutinske obrade tkiva dobijeni su parafinski blokovi. Zatim su uzeti serijski rezovi od 5 µm i obojeni tehnikom Periodic acid-Schiff (PAS). Mikroskopska procjena je izvršena za glomerule i tubule pod Olympus BX-51 mikroskopom (Olympus America, Inc., New York, SAD). Sekcije su bodovane na slijepi, polukvantitativni način korištenjem utvrđene bodovne skale. Za svakog pacova u grupama ispitano je najmanje 10 polja velike snage (×1000). Postotak glomerula koji pokazuju zadebljanje bazalne membrane glomerula je ocijenjen na sljedeći način: 0=nema, 1 manje ili jednako 25 posto, 2=25 posto do 50 posto, 3 =50 posto do 75 posto , 4 Veće ili jednako 75 posto [19]. Debljina bazalne membrane glomerula (µm) izmjerena je pomoću ZEISS ZEN 3.0 Microscope Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Njemačka).
2.4. Imunohistohemijska evaluacija
Parafinski blok sekcije od svakebubregtkivo je uzeto na pozitivno nabijena stakalca. Nakon deparafinizacije, stakalca su prebačena kroz degradiranu seriju etanola, a zatim kroz ksilol. Sekcije su inkubirane sa 3 posto vodikovog peroksida kako bi se spriječila aktivnost endogene peroksidaze. Nakon uzimanja antigena citratnim puferom, sekcije su razgraničene pap-pen, isprane 3 × 5 minuta fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS), a zatim blokirane Ultra V-blokom 1 h na sobnoj temperaturi. Sekcije su inkubirane sa zečjim poliklonskim ATF6 antitelom (ab203119, Abcam Inc., Kembridž, SAD), zečjim poliklonskim IRE1 antitelom (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, Kina), mišjim monoklonskim PERK antitelom (sc377400) ., Heidelberg, Njemačka) i mišje monoklonsko TRPC1 antitelo (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) preko noći na plus 4 stepena u vlažnim uslovima. Nakon pranja 3 × 5 min sa PBS, sekcije su inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelima (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim su ponovo isprani 3 × 5 min sa PBS-om i obojeni hematoksilinom. Stakalca su nanesena pokrovnim staklom koristeći medije na bazi vode. Mikroskopski pregled je obavljen korišćenjem mikroskopa Olympus BX51 i kompjuterski potpomognutog sistema za snimanje (Olympus America, Inc., Njujork, SAD).
Glavni autor je procijenio sve imuno obojene dijelove na šifriran način, koji nije mogao vidjeti naziv grupe eksperimenata. Ekspresije TRPC1, ATF6, IRE1 i PERK otkrivene su uglavnom u tubulima i/ili glomerulima. Izrazi su semikvantitativno određeni prema procentu pozitivnihbubregsekcije. Intenzitet bojenja je klasifikovan u četiri stepena: nikakav ({{0}}), slab (1), umjeren (2) i jak (3). Procenat pozitivnih histoloških preseka bubrega klasifikovan je u 4 stepena: 0 (0 procenata), 1 (1 procenat –10 procenata), 2 (11 procenata –49 procenata) i 3 (50 procenata –100 procenata). Ukupan rezultat bio je proizvod dva rezultata, a konačni rezultat jednog uzorka bio je srednja vrijednost 10 mikroskopskih polja. TRPC1, ATF6, IE1 i PERK su procijenjeni prema prijavljenoj metodi [20].
Cistanche-funkcija bubrega
2.5. Western blot analize
Odrediti promjene u količini specifičnog proteina ububregtkiva odhipertireozai kontrolne grupe, bubrezi su isječeni na male komadiće, a homogenizacija je izvršena dodavanjem pufera za lizu RIPA u epruvete od 2 mL. Nakon homogenizacije, epruvete su inkubirane na 4 stepena najmanje 30 min, a zatim su lizati tkiva centrifugirani na 4 stepena, 15,000 g 20 min. Supernatant koji sadrži ukupni protein prebačen je u novu epruvetu. Određivanje proteina je izvršeno iz supernatanta sa Qubit 2.0 uređajem (Invitrogen Inc., Waltham, MA, USA). U svaku jažicu je stavljeno 50 µg proteina, podvrgnuto elektroforezi sa SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blotom (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornija, SAD), a zatim prebačeno na PVDF membranu pomoću Bio-Rad Trans Turbo uređaja. Membrane su blokirane sa 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) u trajanju od 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim su inkubirane sa mišjim monoklonskim GRP78 antitelom (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), zečjim poliklonskim Cam antitelom (ab203119, Abcam Inc.). most, SAD), zečje poliklonsko IRE1 antitijelo (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., Kina), mišje monoklonsko PERK antitijelo (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), mišje monoklonsko TRPC1 antitijelo (sc133076, Santa Cruz Biotechn Inc., Inc. ) i mišje monoklonsko antitijelo na aktin (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (za kontrolu opterećenja) preko noći na 4 stepena. Nakon toga, membrane su ispirane 3 × 10 min otopinom za ispiranje (TBST), nakon čega je uslijedila inkubacija s odgovarajućim sekundarnim antitijelima (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Nakon što su membrane isprane 3 × 10 minuta sa TBST, nivoi ekspresije proteina u imunoreaktivnim trakama su praćeni sistemom za snimanje (C-Digit, Licor, Cambridge, UK). Rezultati slike su analizirani programom Image J 1.49v.
2.6. Statistička analiza
Sve statističke analize su obavljene sa IBM SPSS 21.0 programom statističkog paketa (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Western blot eksperiment je ponovljen tri puta za svaku grupu. Nivo značajnosti je prihvaćen kao p < 0.05.="" za="" određivanje="" normalne="" distribucije="" podataka="" korišten="" je="" shapiro-wilkov="" test.="" test="" homogenosti="" varijanse="" (levenov="" test)="" je="" korišten="" za="" procjenu="" da="" li="" grupe="" imaju="" jednake="" varijanse.="" za="" podatke="" koji="" pokazuju="" normalnu="" distribuciju="" urađen="" je="" t-test="" nezavisnih="" uzoraka.="" mann-whitney="" u="" test="" je="" izveden="" za="" podatke="" koji="" pokazuju="" nenormalnu="">
3. Rezultati
3.1. Biohemijski rezultati
Nivoi fT3, fT4 i TSH u serumu, nivoi BUN-a i kreatinina u serumu pacova prikazani su na slici 1. Rezultati sugeriraju da su nivoi fT3 i fT4 značajno porasli u hipertireoidnoj grupi u poređenju sa kontrolnom grupom (oba p < {{5="" }}.05).="" osim="" toga,="" utvrđeno="" je="" značajno="" smanjenje="" nivoa="" tsh="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" u="" odnosu="" na="" kontrolnu="" grupu="" (p="">< 0.05)="" (slika="" 1a).="" nivoi="" bun="" u="" serumu="" (slika="" 1b)="" i="" kreatinina="" (slika="" 1c)="" značajno="" su="" se="" smanjili="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnom="" grupom="" (oba="" p=""><>
3.2. Histohemijski rezultati
Histološke promjenebubrezigrupe pacova prikazane su na slici 2. Histologija bubrega (glomeruli, tubuli i vaskularne strukture) bila je tipična za kontrolnu grupu (slika 2A). Kako god,hipertireozaizazvalo zadebljanje bazalne membrane kapilara u glomerulu (slika 2B). Debljina bazalne membrane glomerula je značajno povećana u hipertireoidnoj grupi u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 3-4), (p < 0.05).="" nije="" bilo="" očigledne="" razlike="" između="" kontrolne="" i="" hipertireoidne="" grupe="" u="" smislu="" tubularne="">
Slika 1. Nivoi slobodnog trijodtironina (fT3), slobodnog tiroksina (fT4) i tireostimulirajućeg hormona (TSH) u grupama pacova (a). * Razlikuje se od kontrolne grupe (p < 0.05).="" nivoi="" bun="" u="" serumu="" (b)="" i="" kreatinina="" (c)="" grupa="" pacova.="" *za="" razliku="" od="" kontrolne="" grupe="" (p="">< 0,001),="" urađen="" je="" t-test="" nezavisnih="">
Slika 2. Mikrografije odbubregtkiva kontrolne (A) i hipertireoidne (B) grupe. U kontrolnoj grupi se vidi tipična histologija bubrega (A). U grupi sa hipertireozom,hipertireozauzrokovao zadebljanje bazalne membrane kapilara u glomerulu. Uočeno je zadebljanje bazalne membrane kapilara u glomerulu (strelica) (B). Nema očiglednih razlika u meduli bubrega u obje grupe pacova. (Bojenje periodičnom kiselinom-Schiff (PAS)). Šipke su 20 µm i 50 µm.
3.3. Imunohistohemijski rezultati
Imunohistohemijske reakcije TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK i njihova ekspresija su polukvantitativno određene prema procentu pozitivnihbubrezigrupa pacova (Slika 5-9). Također, njihova prosječna varijacija prikazana je u tabeli. U poređenju sa kontrolnom grupom, ekspresija proteina TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1 i PERK značajno je povećana u hipertireoidnoj grupi u glomerulima i tubulima (Slika 5-9) (p < 0,="" 000).="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" je="" trpc1="" eksprimiran="" u="" glomerularnim="" i="" tubularnim="" strukturama="" u="" kontrolnoj="" grupi="" (slika="" 5-1ab)="" i="" da="" je="" njegova="" ekspresija="" povećana="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" (slika="" 5-2ab).="" grp78="" nije="" eksprimiran="" u="" kontrolnoj="" grupi="" (slika="" 6-1ab)="" i="" njegova="" pozitivna="" reakcija="" je="" uočena="" u="" tubulima="" i="" glomerulima="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" (slika="" 6-2ab);="" dok="" atf6="" nije="" bio="" eksprimiran="" u="" kontrolnoj="" grupi="" (slika="" 7-1ab),="" njegove="" ekspresije="" su="" pozitivno="" reagirale="" u="" tubulima="" i="" glomerulima="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" (slika="" 7-2ab).="" ire1="" nije="" eksprimiran="" u="" kontrolnoj="" grupi="" (slika="" 8-1ab),="" a="" njegova="" pozitivna="" reakcija="" je="" uočena="" u="" tubulima="" i="" glomerulima="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" (slika="" 8-2ab).="" dok="" perk="" nije="" bio="" izražen="" u="" kontrolnoj="" grupi="" (slika="" 9-1ab),="" ekspresija="" perk="" je="" bila="" ograničena="" na="" tubule="" u="" hipertireoidnoj="" grupi="" (slika="">
Slika 3. Poređenje debljine bazalne membrane glomerula između kontrolne i hipertireoidne grupe. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.05),="" urađen="" je="" t-test="" nezavisnih="">
Slika 4. Poređenje debljine bazalne membrane glomerula između kontrolne i hipertireoidne grupe. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.05),="" urađen="" je="" mann-whitney="" u="">
3.4. Western blot rezultati
Western blot rezultati (Slika 10) su pokazali statistički značajno povećanje ekspresije TRPC1, PERK, ATF6 i GRP78 u hipertireoidnoj grupi u poređenju sa kontrolnom grupom (p < 0.05).="" povećanje="" ire1="" bilo="" je="" statistički="" značajno,="" ali="" ne="" toliko="" kao="" drugi="" nivoi="" proteina="" (p=""><>Hipertireozaizazvalo je povećanje ekspresije GRP78 (2,16 puta), ATF6 (2,82 puta), PERK (1,95 puta), IRE1 (1,60 puta) i TRPC1 (1,53 puta) u poređenju sa kontrolnom grupom.
4. Diskusija
U ovoj studiji smo po prvi put predložili kako je bubrežno tkivo zahvaćenohipertireozau smislu uloge ER stresa i TRPC1 kanala u ovom procesu. U našem istraživanju, povećana ekspresija TRPC1 izazvala je povećanje koncentracije Ca2 plus u ćeliji, posebno zadebljanje bazalne membrane kapilara i povećanu ekspresiju GRP78 u tubulima, posebno u glomerulima. Mislimo da ER stres igra aktivnu ulogu u ovom procesu ćelijskog oštećenja, posebno kroz ATF6 i PERK signalni pretvarač u UPR (unfolded protein response) putu.
Kao što se vidi u mnogim studijama kao iu našoj studiji [18], vrijednosti fT3 i fT4 se povećavaju u slučaju hipertireoze, dok se nivo TSH smanjuje. Bilo koja disfunkcija štitnjače može utjecati na proizvodnju fT3 i fT4, što se može povezati s različitim patologijama u cijelom tijelu [21]. Thebubreziigraju vitalnu ulogu u izlučivanju otpadnih proizvoda i toksina kao što su urea, kreatinin i mokraćna kiselina. Procjena bubrežne funkcije je važna u liječenju pacijenata s bubrežnom bolešću ili patologijama koje utječu na funkciju bubrega. Testovi bubrežne funkcije su korisni u identifikaciji prisustva bubrežne bolesti, praćenju odgovora bubrega na liječenje i određivanju progresije bubrežne bolesti. Nivo kreatinina u serumu se smanjuje kod hipertireoze, ne samo zbog povećanja GFR-a već i zbog povećanja mišićne destrukcije. Također, smanjenje koncentracije BUN-a uhipertireozasmatra se da je to zbog smanjene ekspresije akvaporina 1 i 2. Stoga su se nivoi BUN-a i kreatinina smanjili u mnogim studijama [22] kao iu našoj studiji. U patološkim stanjima, ćelije mogu izgubiti proteostazu što rezultira akumulacijom nesavijenih i pogrešno savijenih proteina u ER, što izaziva UPR ili ER stres [23].
Slika 5. Imunohistohemijsko bojenje za TRPC1 u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) grupama ububregtkiva. Ekspresija TRPC je povećana u hipertireoidnoj grupi u odnosu na kontrolnu grupu (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.000),="" urađen="" je="" mann-whitney="" u="">
Slika 6. Imunohistohemijsko bojenje za GRP78 u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) grupama ububregtkiva. Ekspresija GRP78 je povećana u hipertireoidnoj grupi (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.000),="" urađen="" je="" mann-whitney="" u="">
Slika 7. Imunohistohemijsko bojenje za ATF6 u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) grupama ububregtkiva. Ekspresija ATF6 je povećana u hipertireoidnoj grupi (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.000),="" urađen="" je="" mann-whit="" ney="" u="">
Slika 8. Imunohistohemijsko bojenje za IRE1 u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) grupama ububregtkiva. Ekspresija IRE1 je povećana u hipertireoidnoj grupi (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.000),="" urađen="" je="" mann-whitney="" u="">
Slika 9. Imunohistohemijsko bojenje za PERK u kontrolnim (1A-B) i hipertireoidnim (2A-B) grupama ububregtkiva. Ekspresija PERK je povećana u hipertireoidnoj grupi (strelice). Šipke su 50 µm. *Za razliku od kontrolne grupe (p < 0.000),="" urađen="" je="" mann-whitney="" u="">
Poremećaji ER i citosolne Ca2 plus homeostaze povezani su s mnogim bolestima, uključujućibubreg. Poremećaj ER Ca2 plus homeostaze pokreće UPR, koji sprečava dalje nakupljanje novosintetizovanih proteina u ER. Dakle, pokazuje odbrambeni mehanizam za preživljavanje smanjenjem opterećenja na ER [24].
Poznato je da različiti faktori izazivaju ER stres i okidačbubregoštećenja. ER stres u bubregu može uzrokovati diferencijaciju tubularnih epitelnih stanica mezenhimskom tranzicijom iz epitela, gubitak bubrežnih epitelnih stanica apoptoze i konačno bubrežnu patologiju uključujući gubitak nefrona, što smanjuje kapacitet filtracije bubrega. U studiji Dickhout et al., prikazan je ER stresom izazvan epitelno-mezenhimalni prijelazni proces u ćelijskoj liniji renalnih proksimalnih tubula HK-2 za hroničnu bolest bubrega [25]. Pored mnogih studija [9] kako se vidi u našoj studiji,hipertireozauzrokovao zadebljanje bazalne membrane kapilara u glomerulu. Pretpostavljeno je da je povećano zadebljanje bazalne membrane kapilara u glomerulima nastalo kao rezultat procesa epitelno-mezenhimske tranzicije zbog povećane ekspresije GRP78 i ER-konvertera signala stresa. Značaj ER stresa se pokazao kod hroničnihbubregbolesti u mnogim patološkim stanjima. U modelu dijabetesa izazvanog streptozotocinom kod miševa C57BL/6, razvio se ER stres, a ozbiljna nefropatija koja se javila u dvadeset drugom mjesecu bila je povezana s regulacijom CHOP/GADD153, jedne od komponenti puta apoptoze posredovane stresom ER [26 ]. Kod pacijenata sa nefrotskim sindromom, IgA nefropatijom, primarnim mezangijalnim proliferativnim glomerulonefritisom i membranskom nefropatijom, uključujući pacijente sa minimalnim simptomima, GRP78 i inducibilni endoplazmatski retikulum (ER) molekula šaperona molekula kisika regulirana kisikom povećana je ekspresija kisika regulirana 1500) (Imunohemijska kontrola P proteina 1500) (Imunohemijska kontrola proteina povećana je za 150) (OR) Ekspresija CHOP/GADD153 je također povećana i uočena je nuklearna lokalizacija u epitelu proksimalnog tubula nefrotičnih pacijenata. U ljudskim bubrežnim ćelijama izloženim visokim nivoima serumskog albumina, primećena je indukcija ER stresa i pokazalo se da izaziva apoptozu putem CHOP/GADD153 puta [25]. Tubulointersticijski ER stresni odgovor je pronađen u glomerularnim bolestima sa apoptozom tubularnih stanica povezanom s puromicin amino nukleozidnom nefrozom, preopterećenjem proteinima i proteinurijom povezanom s eksperimentalnom ili humanom dijabetičkom nefropatijom [27]. Lorz et al. objavili su da paracetamol, analgetik i antipiretik, uzrokuje oštećenje bubrežnih tubula i apoptozu zbog ER stresa [28]. Paracetamol inducira ER odgovor na stres uključujući indukciju CHOP i cijepanje kaspaze-12. Prekomjerna akumulacija sekretornih proteina izaziva ER stres, uzrokujući oštećenje podocita [29]. Napad komplementa također izaziva ER stres i aktivira PERK put koji vodi do oštećenja glomerularnih epitelnih stanica. Svi ovi nalazi pokazuju da je ER stres jedan od glavnih uzroka oštećenja bubrega, a odgovor na stres ER je odbrambeni mehanizam protivbubregoštećenja [30]. U našoj studiji smatramo da hipertireoza izazvana 12 mg/L tiroksinom uzrokuje ER stres u bubrežnom tkivu i oštećenje uzrokovanohipertireozau tkivu bubrega je povezan sa regulacijom posebno ATF6 i PERK.
Prvi klonirani TRP kanal sisara, jonski kanal TRPC1, nalazi se u ćeliji unutar ER, plazma membrane, intracelularnih vezikula i primarnog cilijara. Izražava se skoro svuda u tkivima ljudi i glodara. TRPC1 stupa u interakciju sa različitim grupama proteina, uključujući podjedinice jonskih kanala, receptore i citosolne proteine kako bi posredovao u svom efektu na Ca2 plus signal. Deluje kao neselektivni katjonski kanal u putevima koji kontrolišu priliv Ca2 plus kao odgovor na aktivaciju receptora na površini ćelije. Kroz ovu funkciju, takođe su dostupne proliferacija, preživljavanje, diferencijacija, sekrecija i migracija ćelija, kao i karakteristike kao što su neuronski konusi rasta i fuzija mioblasta kemotropnih funkcija specifičnih za ćelije [12].
Postoje mnoge studije o promjeni ekspresije TRPC1 u mnogim patološkim stanjima koja uzrokuju ER stres. Sukumaran i dr. pokazalo je da postoji korelacija između ER stresa i ekspresije TRPC1 koja može promijeniti preživljavanje stanica u pljuvačnoj žlijezdi. Oni su izrazili da se ekspresija TRPC1 smanjila u uslovima ER stresa i da je smrt ćelije usled ER stresa zavisila od ekspresije CHOP. Uočeni su povećani ER stres i infiltracija u ćelijama pljuvačnih žlijezda TRPC1-/- nokaut miševa [16].
Slika 10. ThebubregNivoi ekspresije proteina GRP78, ATF6, TRPC1, IRE1 i PERK i grafikon promjene nabora. Povećanje svih proteina bilo je statistički značajno (*p < 0.05),="" urađen="" je="" t-test="" nezavisnih="">
KadabubreziKod modela dijabetičkih pacova, objavljeno je da je ekspresija TRPC1 mRNA smanjena [31]. Kod pacijenata sa dijabetičkom nefropatijom ili Zucker dijabetičkim štakorima u poređenju sa kontrolnom populacijom, smanjena ekspresija TRPC1 ukazuje na to da TRPC1 utiče na razvoj dijabetičke nefropatije [32]. TRPC1 igra vitalnu ulogu u održavanju ER Ca2 plus homeostaze, a smanjena funkcija dovodi do produžene aktivacije UPR puta i remeti aktivaciju AKT, što zatim dovodi do neurodegeneracije. Smanjenje ekspresije TRPC1 uočeno je u modelu Parkinsonove bolesti kod miša izazvanog neurotoksinom. Povećana ekspresija TRPC1 povećava preživljavanje neurona regulacijom AKT/mTOR puta, uprkos ER stresu i UPR uzrokovanom neurotoksinom [33]. Li et al. izvijestili su da je ekspresija TRPC1 također povećana kod hipertrofije kardiomiocita izazvane Namptinom u zavisnosti od vremena. Kada je TRPC1 gen utišan, to je rezultiralo inhibicijom hipertrofije srca izazvane nikotinamid fosforibozil transferazom. Međutim, prekomjernom ekspresijom TRPC1, smatralo se da nikotinamid fosforiboziltransferaza inducira hipertrofiju kardiomiocita putem ER stresom izazvanog puta. Sa ove tačke gledišta, utišavanje TRPC1 gena može igrati zaštitnu ulogu u prevenciji srčane hipertrofije [34]. U našoj studiji, ER stres i TRPC1 su također značajno porasli. Ovo sugerira da zadebljanje bazalne membrane kapilara uzrokovano povećanim stresom ER u bubrežnom tkivu zboghipertireozaje zbog povećane ekspresije TRPC1.
Ova studija ima neka ograničenja. Genetski modificirani miševi su možda korišteni umjesto modela pacova hipertireoze izazvanog tiroksinom. Sa urinom prikupljenim pomoću metaboličkih kaveza, neštobubregfunkcionalni testovi su mogli biti izmjereni iu urinu. Promjena nivoa ER stresa mogla bi se istražiti korištenjem inhibitora TRPC1.
Kao rezultat našeg pregleda literature, efekat hipertireoze na odnos između ER stresa i TRPC1 kanala u bubrežnom tkivu je prvi put prikazan u ovoj studiji. Utvrđeno je dahipertireozaizazvalo je povećanje ekspresije TRPC1 što inducira ER stres. Predlažemo da smanjenje ekspresije TRPC1 može biti potencijalna terapijska strategija za hipertireozu izazvanububrega možda i druga oštećenja organa.
Reference
1. Kim D, Kim W, Joo SK, Bae JM, Kim JH et al. Subklinički hipotireoza i niska normalna funkcija štitnjače povezani su s nealkoholnim steatohepatitisom i fibrozom. Klinička gastroenterologija i hepatologija 2018; 16 (1): 123-131. DOI: 10.1016/j.cgh.2017.08.014
2. Bolkiny Y, Toulson E, El-Atrsh A, Akela M, Farg E. Ekstrakt korijena Costus ublažava biohemijske poremećaje krvi eksperimentalno izazvanih hipo-ihipertireozakod miševa. Godišnje istraživanje i pregled iz biologije 2019; 31 (5): 1-10. DOI: 10.9734/arb/2019/v31i530063
3. Sakr S, Abdel-Ghafar FR, Abo-El-Yazid SM. Selen ublažava hepatotoksičnost izazvanu karbimazolom i oksidativni stres kod albino pacova. Časopis Coastal Life Medicine 2015; 3 (2): 930-936. DOI: 10.1016/j.jtemb.2010.07.002
4. Vargas F, Moreno JM, Rodríguez-Gómez I, Wangensteen R, Osuna A, et al. Vaskularna i bubrežna funkcija kod eksperimentalnih poremećaja štitnjače. European Journal of Endocrinology 2006; 154 (2): 197-212. DOI: 10.1530/tee.1.02093
5. Rhee CM. Interakcija između štitne žlijezde ibubregbolest: pregled dokaza. Aktuelno mišljenje u endokrinologiji 2016; 23 (5): 407-415. DOI: 10.1097/Med.0000000000000275
6. Wijkhuisen A, Djouadi F, Vilar J, Merlet-Benichou C, Bastin J. Hormoni štitnjače regulišu razvoj enzima energetskog metabolizma u proksimalnim zavijenim tubulima pacova. American Journal of Physiology-Renal Physiology 1995; 268 (4): 634-642. DOI: 10.1152/ajprenal.1995.268.4.F634
7. Baum M, Dwarakanath V, Alpern RJ, Moe OW. Efekti hormona štitnjače na neonatalni kortikalni Na plus /H plus antiporter. Kidney International 1998; 53 (5): 1254-1258. DOI: 10.1046/j.1523-1755.1998.00879.x
8. Alcalde AI, Sarasa M, Raldúa D, Aramayona J, Morales R et al. Uloga hormona štitnjače u regulaciji bubrežnog transporta fosfata kod mladih i starijih pacova. Endocrinology 1999; 140 (4): 1544-1551. DOI: 10.1210/endo.140.4.6658
9. Iglesias P, Bajo MA, Selgas R, Díez JJ. Disfunkcija štitnjače i bolest bubrega: ažuriranje. Pregledi endokrinih i metaboličkih poremećaja 2017; 18 (1): 131-144. DOI:
10.1007/s11154-016-9395-710. Selvaraj S, Watt JA, Singh BB. TRPC1 inhibira apoptotičku degeneraciju ćelija izazvanu dopaminergičkim neurotoksinom MPTP/MPP plus. Cell Calcium 2009; 46 (3): 209-218. DOI: 10.1016/j.ceca.2009.07.008
11. Goda Y, Südhof TC. Regulacija oslobađanja neurotransmitera kalcijumom: pouzdano nepouzdana? Current Opinion in Cell Biology 1997; 9 (4): 513-518. DOI: 10.1016/s0955-0674(97)80027-0
12. Sukumaran P, Schaar A, Sun Y, Singh BB. Funkcionalna uloga TRP kanala u moduliranju ER stresa i autofagije. Cell Calcium 2016; 60 (2): 123-132. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.012
13. Goel M, Sinkins WG, Zuo CD, Estacion M, Schilling WP. Identifikacija i lokalizacija TRPC kanala kod pacovabubreg. American Journal of Physiology-Renal Physiology 2006; 290 (5): 1241-1252. DOI: 10.1152/ajprenal.00376.2005
14. Chubanov V, Kubanek S, Fiedler S, Mittermeier L, Gudermann T et al. Bubrežne funkcije TRP kanala u zdravlju i bolesti. U: Emir TLR (urednik). Neurobiologija TRP kanala. 1st ed. Boca Raton, Florida, SAD: CRC Press/Taylor & Francis; 2017. str. 187-212.
15. Jeschke MG, Gauglitz GG, Song J, Kulp GA, Finnerty CC et al. Kalcij i ER stres posreduju u apoptozi jetre nakon opekotine. Journal of Cellular and Molecular Medicine 2009; 13 (8b): 1857-1865. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00644.x
16. Sukumaran P, Sun Y, Zangbede FQ, Nascimento da Conceicao V, Mishra B et al. Ekspresija i funkcija TRPC1 inhibiraju ER stres i ćelijsku smrt u stanicama pljuvačnih žlijezda. FASEB BioAdvanc es 2019; 1 (1): 40-50. DOI: 10.1096/fab.1021
17. Zhao Y, Yan Y, Zhao Z, Li S, Yin J. Dinamičke promjene markera puteva stresa endoplazmatskog retikuluma GRP78 i CHOP u hipokampusu dijabetičkih miševa. Brain Research Bulletin 2015; 111: 27-35. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2014.12.00618. Araujo A, Schenkel P, Enzveiler A, Fernandes T, Partita W et al. Uloga redoks signalizacije u srčanoj hipertrofiji izazvanoj eksperimentalnimhipertireoza. Journal of Molecular Endocrinology 2008; 41 (6): 423-430. DOI: 10.1677/JME-08-002419. Wang Z, do Carmo JM, Aberdein N, Zhou X, Williams JM et al. Sinergijska interakcija hipertenzije i dijabetesa u promicanju oštećenja bubrega i ulozi stresa endoplazmatskog retikuluma. Hypertension 2017; 69 (5): 879-891. DOI: 10.1161/hyper tensionaha.116.08560
20. Zhang LY, Zhang YQ, Zeng YZ, Zhu JL, Chen H et al. TRPC1 inhibira proliferaciju i migraciju raka dojke pozitivnog na estrogenski receptor i daje bolju prognozu inhibiranjem PI3K/AKT puta. Istraživanje i liječenje raka dojke 2020; 182 (1): 21-33. DOI: 10.1007/s10549-020-05673-8
21. Aldubayan MA. Proantocijanidin iz sjemenki grožđa ublažava oksidativni stres i apoptozu uključenu u jetru hipertireoidnih miševa. Godišnje istraživanje i pregled u biologiji 2019: 1-11. DOI: 10.9734/arb/2019/v33i630138
22. Sonmez E, Bulur O, Ertugrul DT, Sahin K, Beyan E i dr.Hipertireozautiče na funkciju bubrega. Endocrine 2019; 65 (1): 144-148. DOI: 10.1007/s12020-019-01903-2
23. Yan M, Shu S, Guo C, Tang C, Dong Z. Stres endoplazmatskog retikuluma u ishemijskoj i nefrotoksičnoj akutnojbubregpovreda. Anali medicine 2018; 50 (5): 381-390. DOI: 10.1080/07853890.2018.1489142
24. Bezprozvanny I, Mattson MP. Pogrešno rukovanje neuronskim kalcijem i patogeneza Alchajmerove bolesti. Trends in Neurosciences 2008; 31 (9): 454-463. DOI: 10.1016/j.tins.2008.06.005
25. Dickhout JG, Carlisle RE, Austin RC. Međusobna povezanost srčane hipertrofije, zatajenja srca i kronične bolesti bubrega: stres endoplazmatskog retikuluma kao medijator patogeneze. Circulation Research 2011; 108 (5): 629-642. DOI: 10.1161/circresaha.110.226803
26. Wu J, Zhang R, Torreggiani M, Ting A, Xiong H et al. Indukcija dijabetesa kod ostarjelih miševa C57B6 dovodi do teške nefropatije: povezanost s oksidativnim stresom, stresom endoplazmatskog retikuluma i upalom. The American Journal of Pathology 2010; 176 (5): 2163-2176. DOI: 10.2353/ajpath.2010.090386
27. Cybulsky AV. Stres endoplazmatskog retikuluma kod proteinurične bolesti bubrega.BubregInternational 2010; 77 (3): 187-193. DOI: 10.1038/ki.2009.389
28. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subirá D, Egido J et al. Paracetamolindukovana ozljeda bubrežnih tubula: uloga za ER stres. Journal of the American Society of Nephrology 2004; 15 (2): 380-389. DOI: 10.1097/01.asn.0000111289.91206.b0
29. Inagi R, Nangaku M, Onogi H, Ueyama H, Kitao Y et al. Uključenost stresa endoplazmatskog retikuluma (ER) u ozljedu podocita uzrokovanu prekomjernom akumulacijom proteina.BubregInternational 2005; 68 (6): 2639-2650. DOI: 10.1111/j.1523-1755.2005.00736.x
30. Yoshida H. ER Stres i bolesti. The FEBS Journal 2007; 274 (3): 630-658. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05639.x
31. Nesin V, Tsiokas L. TRPC1. U: Nilius B, Flockerzi V (urednici). Kationski kanali prolaznog receptorskog potencijala sisara (TRP). 24th ed. Berlin, Hajdelberg, Nemačka: Springer; 2014. str. 15-51.
32. He F, Peng F, Xia X, Zhao C, Luo Q i dr. MiR-135a potiče fibrozu bubrega kod dijabetičke nefropatije regulacijom TRPC1. Diabetologia 2014; 57 (8): 1726-1736. DOI: 10.1007/s00125-014-3282-0
33. Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, Wang S, Lei S et al. ER stres izazvan neurotoksinom u dopaminergičkim neuronima miša uključuje smanjenje TRPC1 i inhibiciju AKT/mTOR signalizacije. The Journal of Clinical Investigation 2012; 122 (4): 1354-1367. DOI: 10.1172/JCI61332
34. Li J, Wu W, Zhao M, Liu X. Uključivanje TRPC1 u Nampt indukovanu hipertrofiju kardiomiocita kroz aktivaciju ER stresa. Cellular and Molecular Biology 2017; 63 (4): 33-37. DOI: 10.14715/CMB/2017.63.4.6