Interakcije između polifenolnih antioksidansa kvercetina i naringenina diktiraju prepoznatljivo hemijsko i biološko ponašanje njihovih mješavina vezano za redoks 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Istraživanja provedena u protekle dvije decenije na molekularnoj osnovi nezaraznih kroničnih bolesti kao nprateroskleroza, hipertenzija, dijabetes, a posebno rak koji izaziva veliki interes, otkrilo je da sve ove bolesti dijele zajednički faktor rizika, a to je poremećaj redoks homeostaze koji se često naziva oksidativni stres12. Nastaje kao rezultat povećanog endogenog nivoa reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) zbog pada antioksidativne barijere tijela i vjeruje se da potiče razvoj svih ovih bolesti.3. Stoga je uslijedila pretpostavka da egzogeni faktori koji mogu neutralizirati ROS, npr. biljni antioksidansi, mogu spriječiti ili usporiti razvoj kroničnih bolesti i podržati njihovo liječenje. Provjera ove hipoteze pokrenula je detaljna istraživanja o antioksidansima prisutnim u namirnicama koje bi mogle pokazati preventivni potencijal4. Zaista, nekoliko studija sažetih u meta-analizi upoređujući konzumaciju hrane i kronične bolesti povezane s prehranom otkrilo je smanjeni rizik u slučaju prehrane bogate voćem i povrćem, žitaricama od cjelovitog zrna, kao i pićima kao što su vino, kava i čaj, dakle proizvodi bogati antioksidativnim fitokemikalijama. Nije iznenađujuće, pretpostavilo se da bi ove tvari, jednom izolirane iz svojih prirodnih izvora, pročišćene, a zatim konzumirane u obliku dodataka prehrani koji sadrže veće doze od onih koje se mogu postići ishranom, mogle postati moćna kemopreventivna sredstva. Ovu pretpostavku potvrdio je veliki broj dokaza koji dolaze iz studija koje su koristile različite eksperimentalne in vitro i in vivo modele kroničnih bolesti, uključujući rak.7. Na žalost, nedavno je u ljudskim studijama pokazalo da antioksidativni dodaci ne pokazuju tako obećavajuće aktivnosti . Na primjer, dvije meta-analize istraživanja ljudske kohorte i kontrole slučaja s vitaminom E8 ili preparatima mikronutrijenata" zaključile su da niski nivoi antioksidansa nemaju efekta, dok visoke doze mogu povećati i incidenciju i smrtnost od raka i kardiovaskularnih bolesti. Međutim, kada dodaci su bazirani na pravim biljkama, kao što je specifična mješavina koncentriranih namirnica bogatih polifenolima (šipak, zeleni čaj, brokula i kurkuma), uočen je značajan zaštitni učinak kod muškaraca s rakom prostate1.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Obećavajući efekti cjelovite hrane za razliku od izoliranih spojeva u skladu su s konceptom sinergije hrane, koji se definira kao aditiv ili više od aditivnog utjecaja kombinacije različitih sastojaka hrane na ljudsko zdravlje. Naša ranija studija potvrdila je ovaj koncept upoređujući bioaktivnost prave hrane sa njihovim izolovanim glavnim antioksidansom. Ovo je pokazalo da se biološki efekti ekstrakata bobičastog voća uvelike razlikuju od onih koje pokazuje antocijanin cijanidin{0}}O-glukozid. Neki drugi izvještaji su također ukazali na važnost interakcija između različitih bioaktivnih jedinjenja i komponenti matriksa hrane za koje se pokazalo da su kooperativni faktori, koji određuju konačnu bioaktivnost namirnica3-1. Naša nedavna mehanička istraživanja koja uključuju postupnu rekonstituciju bioaktivnog sastava kakaa također su podržala ideju sinergije hrane, ali su pokazala da biološki efekti uzoraka složenog sastava nisu samo kombinacija aktivnosti koje pokazuju pojedinačne komponente'3. Sva ova zapažanja sugeriraju da kada se razmatraju biološke aktivnosti izolovanih antioksidanata u odnosu na njihove mješavine povezane s redoksom, interakcije između komponenti moraju biti uzete u obzir. Sve veća složenost mješavinefitokemikalijeČinilo se da je stvorio novuredoks aktivna supstancaumjesto da obogate mješavinu novim aktivnostima karakterističnim za dodani spoj, što se zaključuje iz koncepta sinergije hrane.

Cistanche može poboljšati imunitet

U trenutnom istraživanju, pojednostavili smo eksperimentalni sistem ograničavajući ga na samo dvije osnovne strukture kako bismo ušli u detalje njihovih interakcija u kontekstu hemijske strukture, redoks reaktivnosti i bioaktivnosti povezanih s redoksom, kako bismo omogućili bolje razumijevanje i predviđanje hemopreventivnog potencijala antioksidanata.'Fitokemikalije korištene u tu svrhu bili su uobičajeni antioksidansi prisutni u raznim biljem, povrću i voću, posebno u citrusnom voću, naime: flavonoli predstavljeni kvercetinom (O) i njegovim ramno-side-rutinom ( R) i flavanone naringeninom (N-) i njegovimneohesperidozidnaringin (N plus ) kao i dve mešavine ovih jedinjenja (QN-, RN plus ). Hemijski sastav studije je obuhvatio određivanja koja daju određeni uvid u termodinamiku i kinetiku oksidativnih procesa, tj. DPPH test, potenciometrijsku titraciju i diferencijalnu pulsnu voltametriju (DPV). Biološkim testovima ispitivan je uticaj proučavanih uzoraka na rast ćelija (MTT test), ćelijsku antioksidativnu aktivnost (CAA test), genotoksičnost (test kometa), globalni nivo metilacije DNK (epigenetska verzija komet testa) i ekspresiju 84 redoks. -srodni geni (tehnologije zasnovane na PCR nizu u realnom vremenu). Biološki eksperimenti su izvedeni korišćenjem preporučene za nutricionističke studije stanične linije adenokarcinoma debelog creva HT29 kao modela intestinalnog epitela koji može biti izložen relativno visokim koncentracijama unesenih antioksidanata.

Rezultati

Naša ranija istraživanja koja su upoređivala redoks svojstva kakao praha i njegovih glavnih sastojaka ukazala su na važnost interakcija između polifenolnih komponenti mješavine na ukupnu antioksidativnu aktivnost. U trenutnom istraživanju, pojednostavili smo eksperimentalni sistem da bismo detaljnije ispitali takve interakcije za par flavonoida koji su uobičajene komponente hrane. Odabrana su dva flavonoida, oba u obliku aglikona i glikozida. Flavonole su predstavljali kvercetin (Q) i njegovramnozid-rutin(R) iflavanoninaringeninom (N-) i njegovim neohesperidozidom naringinom (N plus ). Ovi polifenoli se razlikuju po broju i lokaciji redoks aktivnih hidroksilnih grupa, kao i po sposobnosti formiranja intramolekularnih H-veza, odnosno tri strukturne karakteristike koje mogu ometati smanjenje svojstava antioksidativnih spojeva. Kao što je prikazano na slici 1, intermedijarni semikinon radikali nastali u prvom koraku oksidacije kateholnog dijela u prstenu B

od Q ili R može se stabilizirati na dva načinai8,19. Prvi način je konjugacija obje strukture jezgra preko B i C prstena i formiranje druge H-veze sa susjednom OH grupom ili supstituentima u C prstenu, posebno u R. prisustvo hidroksilnih grupa u šećernom supstituentu na poziciji 3 prstena C može dodatno poboljšati ovaj stabilizacijski učinak zbog više mogućnosti stvaranja H-veza (direktno ili preko molekula vode), Nasuprot tome, srednji fenoksilni radikal u N plus ili N- nije stabiliziran ni konjugiranim dvostrukim vezama koje također uključuju prsten C ni H veza sa susjednim supstituentima. Štaviše, u N plus, šećerna grupa je vezana za prsten A i stoga je predaleko da bi formirala H-vezu sa radikalom u prstenu B. Može se očekivati ​​da će ove strukturne karakteristike uticati na redoks aktivnost proučavanih flavonoida.

Antioksidativna aktivnost prema hemijskim testovima.

Određivanje redukcijskih svojstava za proučavane polifenole i njihove mješavine obavljeno je pomoću dva hemijska testa na 37 stepeni C kako bi se uskladili stanični uslovi redoks procesa. Prva metoda je uobičajeno korišteni šaržni spektrofotometrijski DPPH test; rezultati za pojedinačne flavonoide i njihove mješavine prikazani su na slici 2A. One se izražavaju kao stehiometrijske vrijednosti n gdje se broj 10 odnosi na trajanje reakcije—10 min. Uvođenjem vremenskog parametra u mjerenja, kinetički aspekt je postao uključen u procjenu antioksidativne aktivnosti kao što je ranije opisano13. U ovim određivanjem, oba aglikona su pokazala jača redukcijska svojstva od odgovarajućih glikozida, što je također ranije pokazano u ovom testu 2021, dok su flavonoli bili više aktivniji od flavanona. O je bio najefikasniji spoj u uklanjanju DPPHradikala, a slijedi ga R. Uprkos zanemarljivoj reaktivnosti prema DPPH, oba flavanona, uključujući N koji sam po sebi nije pokazao redoks svojstva u periodu od 10 minuta reakcije, značajno su povećali ukupnu antioksidativnu aktivnost mješavine, u slučaju oba aglikona ON- i glikozida RN plus .

Druga metoda je uključivala potenciometrijsku titraciju (PT) koja omogućava mjerenje standardnog redukcijskog potencijala (E) i na taj način procjenjivala termodinamičku sposobnost čistih spojeva da dobiju elektrone. Utvrđene vrijednosti potvrđuju da su Q i R jaka redukcijska jedinjenja (slika 2B). Međutim, u PT, R je prihvatio donore elektrone spremnije nego Q. Određivanje E za N- i N plus nije bilo moguće zbog vrlo sporog prijenosa elektrona tokom procesa oksidacije (sporije za N plus). PT mjeri razliku potencijala između referentne elektrode i mjerne elektrode nakon dodavanja svakog dijela titranta. Stalni potencijal znači da je kvocijent reakcije (Q) između titranta i analita stabilan (Q= konstanta). Ako je brzina prijenosa naboja tokom reakcije niska (niske struje u voltametriji), onda je potrebno mnogo vremena da se Q u PT stabilizira. Posljedično, za vrlo spore reakcije, potenciometrijsku krivulju titracije je teško dobiti i stoga je pronađena vrijednost E" manje pouzdana.

Antioksidativno djelovanje diferencijalnom pulsnom voltametrijom,

Korišteni hemijski testovi sugerirali su da razjašnjavanje antioksidativnog djelovanja polifenola mora uzeti u obzir kinetičke aspekte, gdje bi stabilnost intermedijarnih radikala mogla igrati ulogu. Kao što je ilustrovano na slici 1, semikinon radikali koji nastaju u prvoj fazi oksidacije flavanola su mnogo bolje stabilizovani od fenoksil radikala koji nastaju oksidacijom flavanona. Ovaj odnos je ilustrovan na slici 1 i može uticati na brzinu redoks procesa. Stoga su redukcijsko-oksidacijska svojstva proučavanih čistih antioksidanata i njihovih mješavina dalje analizirana uz pomoć diferencijalne pulsne voltametrije (DPV). Budući da ova tehnika omogućava praćenje termodinamičkih i kinetičkih aspekata oksidacijskih reakcija, obje se konačno kombinuju u parametru koji se zove antioksidativna snaga (AOP)15.

Opažanja napravljena DPV mjerenjima (Slika 2B-F) bila su u suprotnosti sa onima dobijenim DPPH testom (Slika 2A). Iznenađujuće, DPV je otkrio da se Q opisan u literaturi kao odličan reduktor, kada se uzmu u obzir samo termodinamički aspekti (anodni vršni potencijal, E.), pokazao kao najslabiji antioksidans (slika 2B, C). Termodinamički, R je bio nešto jači antioksidans. Zanimljivo je da se N- i N plus u literaturi smatraju slabim antioksidansima, termodinamički pokazuju najveće vrijednosti E, što znači da su bili vrlo jaki redukcioni agensi. Za obje klase flavonoida, glikozidni dio povećao je antioksidativnu aktivnost aglikona. Međutim, kinetički parametri (Sl. 2E, F), tj. anodna struja (I,.) i gustina naelektrisanja (Q), otkrili su da je oksidacija N plus sporiji proces u poređenju sa oksidacijom Q i R. Slično , anodna struja (I) je bila niža za N- nego za Q i R, ali je prijenos naelektrisanja za ovo jedinjenje dostigao najveću vrijednost.

U slučaju mješavina, otkrivena su dva anodna pika (1. i 2.) na voltametrijskim krivuljama, što se i moglo očekivati ​​za dvokomponentnu smjesu. Utvrđene vrijednosti anodnih vršnih potencijala (E.) su pokazale da 1. uočeni pik odražava oksidaciju flavonola, dok 2"d pik oksidaciju flavanona (Dopunski materijali-Sl. S1). U većini slučajeva, prisustvo druge komponente u smeša je uticala na termodinamiku i/ili kinetiku redoks procesa u poređenju sa oksidacijom čistih jedinjenja.Na primer, za QN-, vrednost E., za 1. vrh oksidacije bila je jednaka potencijalu anodnog vrha Q oksidacija. Međutim, anodni pik od 2" koji odgovara N-oksidaciji i potencijal ovog prijelaza bio je veći od anodnog potencijala čistog N-(Sl.2C). Uočena je suprotna situacija za kinetiku ove reakcije. I i Q 1s anodnog vrha QN bili su blizu kinetičkih parametara oksidacije čistih komponenti (slika 2E, F), dok je naboj razmijenjen tokom 2n koraka ON-oksidacije bio mnogo manji od onog za N-oksidaciju (Sl.2F). Ovi kombinovani termodinamički i kinetički efekti rezultirali su povećanjem AOP (slika 2D) ove mješavine, što je u skladu s rezultatima DPPH testa.

Procjena citotoksičnosti.

MTT testom je procijenjen uticaj proučavanih flavonoidnih aglikona (Q, N-), glikozida (R, N plus ) i njihovih mješavina (QN-, RN plus ) na rast crijevnih stanica. Ćelijska linija adenokarcinoma debelog crijeva HT29 odabrana je kao model epitela probavnog trakta, odnosno tkiva u direktnom kontaktu sa unesenim sastojcima hrane kao što su polifenoli. Ćelije su tretirane pojedinačnim flavonoidima i njihovim mješavinama u fiziološkim koncentracijama koje se potencijalno mogu pojaviti u krvi (0.01-1 uM)22-2 ili koncentracijama dostupnim u probavnom traktu (10-100 uM) nakon uzimanja hrane25-27. Krivulje doza-odgovor za tretmane od 6,24 i 72 sata prikazane su na Sl.3.

Pojedinačna jedinjenja nisu značajno uticala na rast ćelija ni u jednoj od ispitivanih koncentracija, ni za kratke ni za produžene tretmane. Izuzetak je bila najveća koncentracija N-a koja je nakon 72 h inhibirala rast stanica do 75 posto u odnosu na kontrolu. Nasuprot tome, ispitivane mješavine (QN-, RN plus ) značajno su stimulirale rast stanica na način ovisan o koncentraciji za sva testirana vremena izlaganja. Ovaj efekat je uočen pri niskim koncentracijama (0.01-1 uM) koje su bile dostupne u krvotoku, a bio je još snažniji pri višim koncentracijama (10-100 uM) na koje epitelne ćelije probavnog trakta mogu biti izloženi. Samo u slučaju najveće koncentracije QN-, nakon 72 h tretmana, stimulacija je prestala, vjerovatno zbog inhibitornih efekata uočenih u takvim uslovima za N-. Ćelijska antioksidativna aktivnost. Efikasnost pročišćenih flavonoida i njihovih mješavina u podržavanju endogene antioksidativne barijere HT29 ćelija potvrđena je uz pomoć CAA testa. Ova metoda se oslanja na sposobnost uzorka koji sadrži redoks aktivna jedinjenja da inhibiraju ili promoviraju oksidaciju apsorbirane sonde. ćelijama do njegovog fluorescentnog oblika. Slabljenje oksidacije sonde, posmatrano kao gašenje fluorescencije, mjera je reducijskog kapaciteta antioksidanata u stanicama (pozitivne vrijednosti CAA), dok povećanje oksidacije sonde označava njihovu prooksidativnu aktivnost (negativne vrijednosti CAA)28 . Određivanja su provedena za aglikone i glikozide u koncentracijama koje odražavaju i fiziološku – endogenu – i egzogenu – crijevnu izloženost dobivenu iz hrane. Inkubacija sa ispitivanim flavonoidima je provedena u standardnom preporučenom periodu od 1 h18 za aglikone i glikozide. Produženi tretmani (3 i 6 h) za praćenje kinetike redoks odgovora u primijenjenom ćelijskom modelu korišćeni su samo u slučaju aglikona, zbog njihovog izraženijeg uticaja na ćelijsku antioksidativnu aktivnost.

Ispitivani flavanoni i flavonoli su se razlikovali po svom uticaju na redoks status HT29 ćelija. U slučaju pojedinačnih aglikona, definisani odgovori ovisni o koncentraciji uočeni su nakon 1 h izlaganja. Međutim, flavonol-Q antioksidativna aktivnost se povećava sa primenjenom koncentracijom, dok je u slučaju flavanona-N- uočeno postepeno pojačavanje prooksidativnog efekta (slika 4A). Ovisnost o dozi pojedinačnih glikozida bila je manje očigledna; samo je R u svojoj najvećoj koncentraciji uvjerljivo povećao ćelijsku antioksidativnu aktivnost (slika 4A). Zanimljivo je da su obje mješavine pokazale pojačanu antioksidativnu aktivnost, na koju očigledno nije utjecao prooksidativni učinak uočen za pojedinačna jedinjenja.

Slika 4B prikazuje kinetiku promjena vrijednosti CAA utvrđene nakon 1,3 i 6h tretmana HT29 ćelija aglikonima. Za najnižu koncentraciju (1 μM), koja odgovara fiziološkoj ekspoziciji, vremenska ovisnost nije uočena ni za pojedinačne aglikone niti za njihovu mješavinu. Međutim, utjecaji veće koncentracije na vrijednosti CAA jasno su ovisili o vremenu. Produženo izlaganje smanjilo je i prooksidativni efekat N- kao i antioksidativnu aktivnost Q i QN-.

Ispitivani aglikoni su pokazali različitu nutrigenomsku aktivnost, dodatno modificiranu koncentracijom primijenjenom na stanice.

Flavanon N-at l μM značajno smanjuje ekspresiju CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Ovaj flavanon primijenjen na HT29 ćelije pri 10 uM utjecao je na ekspresiju 5 gena, koji su također bili smanjeni njegovom nižom dozom, naime: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutacija superoksidnih radikala u vodikov peroksid i kisik6. Blago povećanje ekspresije uzrokovano N-na 10uM uočeno je samo za VIMP gen (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Ovaj članak je preuzet sa www.nature.com/scientificreports