sažetak:Ova studija je provedena kako bi se razjasnili inhibitorni efekti cikloheterofilina na sintezu melanina. Da bi se razjasnili inhibitorni efekti cikloheterofilina na ćelijsku liniju B16F10, izmjereni su vitalnost ćelije, ekspresija ribonukleinske kiseline (mRNA), test aktivnosti tirozinaze i test proizvodnje melanina. Utvrđeni su efekti cikloheterofilina na ekspresiju mRNA proteina 1 (TYRP1) povezanog s tirozinazom (TYRP1)/TYRP2/tirozinaza (TYR)/mikroftalmijom asociranog faktora transkripcije (MITF) i sadržaj melanina. Kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu pokazao je da cikloheterofilin smanjuje nivo ekspresije mRNA gena TYRP1/TYRP2/TYR/MITF i sadržaj proizvodnje melanina u odnosu na B16F10 ćelije tretirane -MSH. Test aktivnosti tirozinaze otkrio je da cikloheterofilin smanjuje proizvodnju melanina u B16F10 stanicama. Ovi podaci pokazuju da cikloheterofilin povećava efekte izbjeljivanja u B16F10 ćelijama; stoga je cikloheterofilin moćan sastojak za izbjeljivanje kože. Stoga bi trebalo istražiti dalja istraživanja mehanizma djelovanja cikloheterofilina na razvoj funkcionalnih materijala.

Prema relevantnim studijama, cistanche je uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta je cistanozid, koji ima različite učinke kao što su antioksidans, protuupalni i promocija imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche i izbjeljivanja kože leži u antioksidativnom dejstvu cistanche glikozida. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju katalizira tirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utječe na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.

Kliknite na Kako koristiti Cistanche

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Uvod

Boju kože određuju hemoglobin u krvi, pigment melanina u epidermalnom sloju i -karoten u potkožnom tkivu. Među njima, boja kože je uglavnom određena količinom i distribucijom pigmenta melanina [1]. Melanin je pigment sintetiziran iz melanosoma u melanocitu koji je prisutan u bazalnom sloju. Apsorbira ili raspršuje ultraljubičaste (UV) zrake i ima korisnu funkciju suzbijanja oštećenja stanica kože ili kožnih tkiva. Međutim, prekomjerno nakupljanje melanina može uzrokovati mrlje, pjege i pigmentaciju. Poznato je da uzrokuje hiperpigmentaciju [2,3].

Melanin pigment je reprezentativni iritans koji uzrokuje egzogeno starenje. Nastaje melanogenezom melanocita koji su bili izloženi UV zračenju i ima blagotvornu funkciju zaštite kože od UV zraka potamnjivanjem boje kože. Pigment melanina sastoji se od eumelanina (crni) i feomelanina (crveno-smeđi) [4,5]. Melanin se proizvodi upotrebom L-tirozina, vrste aminokiseline, kao supstrata, i putem L-DOPA (3,4-dihidroksifenilalanin) i dalje oksidira u DOPA-kinon uz pomoć glavnog enzima tirozinaze (TYR), protein vezan za tirozinazu-1 (TYRP1) i TYRP2. DOPA-kinon se dalje oksidira u crveno-žuti feomelanin u prisustvu sulfhidrilnih grupa. DOPA-kinon se također dekarboksilira, oksidira i katalizira u eumelanin kada su sulfhidrilne grupe iscrpljene [4,5]. Enzim tirozinaza je ključni enzim odgovoran za proizvodnju melanina, a poznato je da ekstrakt sladića, ekstrakt japanskog hrasta, arbutin i kojična kiselina, koji su reprezentativni materijali za izbjeljivanje, inhibiraju aktivnost enzima tirozinaze [6,7]. Konkretno, arbutin igra ulogu u inhibiciji aktivnosti tirozinaze tako što kompetitivno reagira s L-tirozinom, koji je sirovina za melanin, i kojičnom kiselinom vezanom za aktivno mjesto tirozinaze pomoću Cu2 plus. Poznato je da Kojična kiselina i arbutin imaju jake efekte izbjeljivanja, ali su prijavljeni neželjeni efekti sigurnosnih problema kao što je iritacija kože [8,9]. Sprovode se mnoge studije kako bi se otkrili novi učinkoviti materijali kao što je razvoj funkcionalnih materijala prirodnog porijekla [8,9].

Cikloheterofilin (C30H30O7), vrsta prenilflavona, u izobilju je sadržan u Artocarpus heterophyllus i za koji se navodi da ima farmakološke i biološke funkcije uključujući protuupalno, antitrombocitno djelovanje i antioksidantnu efikasnost [10-13]. Osim toga, objavljeno je da ima antioksidativne i anti-age efekte na ljudske dermalne fibroblaste izazvane UV-A [14,15].

Kao takav, objavljeno je da je cikloheterofilin efikasan kod raznih bolesti, ali nema istraživanja o efektima proizvodnje melanina cikloheterofilinom. U ovoj studiji ispitao sam efekte cikloheterofilina na ekspresiju markera TYRP1, TYRP2, TYR i MITF u ćelijama B16F10, ćelijskoj liniji melanoma dobijenoj od miševa, koja se odnosi na mehanizam proizvodnje melanina.

2. Rezultati i diskusija

CCK{{0}} test je izveden da bi se odredila citotoksičnost cikloheterofilina u ćelijskoj liniji B16F10. Dodane su različite koncentracije cikloheterofilina za mjerenje vitalnosti ćelije (Slika 1). Kada su tretirane koncentracijom od 20 µg/mL ili više, potvrđeno je da je stopa preživljavanja B16F10 ćelija značajno smanjena u odnosu na kontrolnu grupu. Kada je dodat cikloheterofilin u koncentraciji od 10 µg/mL, stopa preživljavanja B16F10 ćelija bila je slična onoj u kontrolnoj grupi. Stoga je u dodatnim eksperimentima dodat cikloheterofilin u koncentracijama od 10, 1 i 0,1 µg/mL.

Enzim tirozinaza reaguje sa L-tirozinom da bi proizveo L-DOPA, a L-DOPA konačno proizvodi pigment melanina preko DOPAkinona pomoću tirozinaze, koja je poznata kao ključni enzim koji reguliše melanogenezu [4,5]. U ovom eksperimentu, kojična kiselina je korišćena kao pozitivna kontrola za procenu stepena inhibicije aktivnosti enzima tirozinaze. Stepen inhibicije aktivnosti enzima tirozinaze potvrđen je tretmanom cikloheterofilinom u koncentracijama od 10, 1 i 0.1 µg/mL. Potvrđeno je da je aktivnost enzima tirozinaze inhibirana na način ovisan o koncentraciji cikloheterofilinom (slika 2). U grupama tretiranim cikloheterofilinom u koncentracijama od 10, 1 i 0,1 µg/mL, potvrđeno je da su inhibitorni efekti enzima tirozinaze 58,0, 27,4 i 16,9 posto, respektivno.

UV zraci stimulišu keratinocite u epidermisu da indukuju ekspresiju - melanocit-stimulirajućeg hormona (-MSH), hormona koji stimuliše melanocite, a izlučuje se izvan ćelije, a izlučeni -MSH stimuliše melanocite. Vezivanjem na receptor melanokortina 1 (MC1R), on indukuje signalizaciju vezanu za sintezu melanina u ćeliji, uzrokujući proizvodnju pigmenta melanina [5]. U ovom eksperimentu, da bi se inducirala proizvodnja melanina u B16F10 ćelijama, korišteno je 200 nM -MSH za indukciju proizvodnje melanina u B16F10 stanicama [16]. RT-PCR u realnom vremenu nivoa ekspresije gena TYRP1, TYRP2, TYR i MITF, koji su markeri koji se povećavaju tretmanom -MSH, određen je tretmanom cikloheterofilinom u -MSH-tretiranim B16F10 ćelijama. B16F10 ćelije su tretirane cikloheterofilinom i ekspresija markera je potvrđena RT-PCR u realnom vremenu. Kao rezultat toga, potvrđeno je da su ekspresije TYRP1, TYRP2, TYR i MITF značajno smanjene u grupi koja je tretirana cikloheterofilinom u poređenju sa grupom tretiranom -MSH. Konkretno, u eksperimentalnoj grupi tretiranoj sa 10 µg/mL cikloheterofilina, ekspresija gena TYRP1, TYRP2, TYR i MITF smanjena je za 53,3, 26,6, 58 i 34 procenta, respektivno (Slika 3). U eksperimentalnoj grupi tretiranoj sa 1 µg/mL cikloheterofilina, potvrđeno je da je ekspresija markera značajno smanjena, a ekspresija TYRP1 i TYRP2 gena je na sličan način smanjena u grupi tretiranoj 0,1 µg/mL cikloheterofilinom.

Nakon potvrde da je tretman cikloheterofilinom smanjio nivo ekspresije mRNA markera koji se odnosi na melanogenezu, potvrđena je brzina proizvodnje pigmenta melanina kako bi se utvrdilo da li je proizvodnja pigmenta melanina u B16F10 stanicama značajno smanjena (slika 4) . Ćelijske linije B16F10 tretirane cikloheterofilinom u koncentracijama od 10, 1 i 0,1 µg/mL, respektivno, sakupljene su i potvrđen je stepen proizvodnje melanina. Kao rezultat toga, potvrđeno je da je proizvodnja pigmenta melanina značajno smanjena cikloheterofilinom u koncentracijama od 10 i 1 µg/mL (slika 4A). Dodatno, potvrđeno je da je proizvodnja pigmenta melanina u stanju tretiranom cikloheterofilinom smanjena u odnosu na kontrolnu grupu (slika 4B). Kada se doda 10 i 1 µg/mL cikloheterofilina, stopa proizvodnje pigmenta melanina se smanjila za 44,6 odnosno 37,8 posto, što je značajno smanjeno u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 4B). Ovi rezultati imaju tendenciju da budu u skladu sa eksperimentalnim rezultatima RT-PCR u realnom vremenu na nivoima ekspresije mRNA markera povezanih sa melanogenezom.

Poznato je da su antioksidansi poput askorbinske kiseline važan materijal za izbjeljivanje koji inhibira sintezu pigmenata melanina redukujući DOPAkinon, međusupstancu tokom procesa proizvodnje eumelanina, u L-DOPA [16,17]. Prijavljeno je i da cikloheterofilin ima antioksidativne efekte [11,12]. Pokazano je da cikloheterofilin može biti efikasan u izbjeljivanju ovog antioksidativnog efekta. Kao rezultat potvrđivanja antioksidativnog efekta in vitro putem ovog testa uklanjanja radikala DPPH, potvrđeno je da ima antioksidativni učinak uporediv s onim askorbinske kiseline, pozitivna kontrola pod visokom koncentracijom cikloheterofilina (Slika 5). U budućnosti bi trebalo provesti daljnja istraživanja antioksidativnog djelovanja cikloheterofilina u melanocitima i ekspresije antioksidativnih enzima kao što su katalaza, SOD1, SOD2 i SOD3.

3. Materijali i metode

3.1. Eksperimentalni materijali i ćelijska kultura

Ćelijska linija B16F10 kupljena je od Korean Cell Line Bank (Koreja), a medij za ćelijsku kulturu je bio 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS, SFBU−0500, Equitech-bio, Kerrville, TX, SAD) u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) , LM 001–05, Welgene, Gyeongsan-si, Koreja), i dodan je 1 posto penicilina/streptomicina (Gibco, 15140–122, Waltham, MA, SAD). Ćelije su uzgajane u inkubatoru na 37 ◦C i 5 posto CO2 [16]. Cikloheterofilin korišten u ovom eksperimentu ekstrahiran je iz Artocarpus heterophyllus koristeći DMSO i kupljen od ChemFaces Co. (CFN97748, Wuhan, Kina, čistoća veća ili jednaka 98 posto).

3.2. Cell Viability Assay Cell

Vijabilnost je procenjena pomoću CCK-8 rastvora (komplet za brojanje ćelija; EZ-3000, EZ-Cytox, Seoul, DoGen). Ćelijske linije B16F10 su zasijane u medijumu kulture gustine 2 × 104 ćelije/ploče sa 96 jažica. Nakon 24 h dodat je cikloheterofilin (CFN97748, Chemfaces). Ćelijska linija B16F10 tretirana cikloheterofilinom je inkubirana 24 h, a rastvor CCK-8 je dodan 30 minuta u inkubatoru na 37 ◦C. Apsorpcija je izmjerena na 450 nm pomoću čitača mikroploče (Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek), a vijabilnost ćelija je izračunata na osnovu apsorpcije kontrolne grupe bez ćelija [16].

3.3. DPPH test

3.4. In vitro aktivnost tirozinaze gljiva

3.5. Kvantitativna reverzna transkripcija-polimeraza lančana reakcija u realnom vremenu (Q-RT-PCR)

Ukupna RNK je izolovana upotrebom Trizola (15596018, Carlsbad, CA, USA, Thermo Fisher Scientific). Koncentracija RNK određena je spektrofotometrijski (BioTek). Četiri mikrograma RNK su reverzno transkribovana u cDNK koristeći ReverTra Ace® komplet za reverznu transkripciju (Toyobo, FSQ101, Osaka, Japan). Reverzna transkripcija je zaustavljena dodavanjem Tris-EDTA pufera (pH 8,0) u ukupno 200 µL rastvora cDNK. TaqMan® setovi za analizu genske ekspresije kupljeni su od Applied Biosystems. Q-RT-PCR su rađeni prema uputama proizvođača. Ukratko, 20 µL Q-PCR mješavine sadržavalo je 10 µL 2× TaqMan Universal Master Mix-a (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD), 1 µL 20× Taqman ekspresijski test (Applied Biosystems) i 50 ng cDNK. Q-PCR smeša je reagovala na 95 ◦C tokom 20 s i 40 puta ciklusne reakcije (95 ◦C tokom 1 s i 60 ◦C tokom 20 s) sa StepOnePlus sistemom (Applied Biosystems). Identifikacioni brojevi gena za TaqMan test ekspresije koji se koristi u Q-RT-PCR analizama predstavljeni su u Tabeli 1. Humani GAPDH (Applied Biosystems) je korišćen za normalizaciju varijacija u količinama cDNK iz različitih uzoraka.

3.6. Test melanina

Za mjerenje količine pigmenta melanina, Hosoijeva metoda je djelomično modificirana [17]. Ukupno 1 × 105 B16F10 ćelija je inokulisano u posudu za kulturu tkiva od 60 mm. Nakon kultivisanja ćelija tokom 24 h, dodato je 200 nM -melanocit stimulirajućeg hormona (-MSH; M4135, Sigma-Aldrich) i cikloheterofilin (10, 1, 0,1 µg/mL) u toku 72 h pri svakoj koncentraciji. Nakon uklanjanja podloge za kulturu, dodano je 200 µL rastvora NaOH (1N; S8045, Sigma-Aldrich) i inkubirano na 60 ◦C 2 h da bi se melanin rastvorio. Apsorbancija je mjerena spektrofotometrom (405 nm, Epoha). Kao pozitivna kontrola korišćeno je 100 µg/mL arbutina (A4256, Sigma-Aldrich). Inhibicija proizvodnje pigmenta melanina izražena je kao procenat količine melanina proizvedenog u uslovima -MSH tretmana. Izvedeno je samostalno izvođenjem tri nezavisna eksperimenta.

3.7. Statistička analiza

4. Zaključak

UV koje se susreće u svakodnevnom životu ima korisne funkcije kao što su sinteza vitamina D i sterilizacija, ali u drugim aspektima uzrokuje gubitak elastičnosti kože, bora, pigmentaciju, eritem, upalu, itd., lančanom reakcijom reaktivnih vrsta kisika [18, 19]. Osim toga, egzogeno starenje uzrokovano vanjskim faktorima poput UV zraka sprječava funkciju normalnih tkiva i regeneraciju kada je tkivo oštećeno uslijed smanjenja i propadanja sastavnih stanica u živom tijelu [20,21].

Kroz ovu studiju, bilo je moguće potvrditi odgovarajuću koncentraciju cikloheterofilina za liječenje B16F10 ćelija. Potvrđeno je da koncentracija od 10 µg/mL ne utiče na vitalnost ćelija, kao što je prikazano na slici 1. Rezultati merenja inhibitornog dejstva enzima tirozinaze, potvrđeno je da koncentracije cikloheterofilina od 10, 1, i 0,1 µg/mL značajno smanjuju aktivnost enzima tirozinaze (slika 2). Pored toga, potvrđeno je da cikloheterofilin značajno smanjuje ekspresiju markera (TYRP1, TYRP2, TYR i MITF gen) u poređenju sa stanjem tretiranim -MSH (Slika 3). Dodatno, potvrđeno je da cikloheterofilin smanjuje količinu sinteze melanina u B16F10 ćelijama (Slika 4). Na osnovu ovih rezultata, cikloheterofilin pokazuje potencijal kao novi kandidat za izbjeljivanje.

Ova studija je prva koja potvrđuje inhibitorni učinak cikloheterofilina na sintezu melanina i sugerira mogućnost inhibicije starenja kože uzrokovanog UV zracima. Osim toga, čini se da su neophodni daljnji dubinski njegovi efekti na signalne mehanizme ćelija B16F10, na signalne sisteme uključene u izbjeljivanje i na različite antioksidativne enzime prisutne u melanocitima.

Reference

1. Bonaventure, J.; Domingues, MJ; Larue, L. Ćelijski i molekularni mehanizmi koji kontroliraju migraciju melanocita i stanica melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2013, 26, 316–325. [CrossRef] [PubMed]

2. Gilchrest, BA; Eller, fotooštećenje MS DNK stimulira melanogenezu i druge fotoprotektivne reakcije. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 1999, 4, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

3. Sugumaran, M. Komparativna biokemija eumelanogeneze i zaštitne uloge fenoloksidaze i melanina kod insekata. Pigment Cell Res. 2002, 15, 2–9. [CrossRef] [PubMed]

4. Ito, S.; Wakamatsu, K. Kvantitativna analiza eumelanina i feomelanina kod ljudi, miševa i drugih životinja: uporedni pregled. Pigment Cell Res. 2003, 16, 523–531. [CrossRef]

5. Yoon, YM; Bae, SH; An, SK; Choe, YB; Ahn, KJ; An, IS efekti ultraljubičastog zračenja na kožu i signalne puteve ćelija kože. Kor. J. Aestet. Cosmetol. 2013, 11, 417–426.

6. Baek, YS; Ryu, YB; Curtis-Long, MJ; Ha, TJ; Rengasamy, R.; Yang, MS; Park, KH tirozinaza inhibitorni efekti 1,3- difenil propana iz Broussonetia Kozinski. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 35–41. [CrossRef]

7. Kim, HJ; Seo, SH; Lee, BG; Lee, YS Identifikacija inhibitora tirozinaze iz Glycyrrhiza uralensis. Planta Med. 2005, 71, 785–787. [CrossRef]

8. Han, NK; Park, CM; Kwon, JC; Joung, MS; Choi, JW Izbjeljivanje ekstrakta Fagopyrum tataricum. J. Soc. Cosmet. Sci. Korea 2014, 40, 179–186.

9. Kim, BY; Park, SH; Park, BJ; Kim, JJ Izbjeljivanje ekstrakta Androsace umbellate. J. Soc. Cosmet. Sci. Koreja 2015, 41, 21–26.

10. Lin, CN; Lu, CM; Lin, HC; Fang, SC; Shieh, BJ; Hsu, MF Novi antitrombocitni sastojci iz Formozanskih morskih biljaka. J. Nat. Prod. 1996, 59, 834–838. [CrossRef]

11. Wang, JP; Raung, SL; Tsao, LT; Hsu, MF; Lin, CN Blokada protein kinaze C je uključena u inhibiciju stvaranja neutrofilnog superoksid aniona pomoću ciklometara filina. Naunyn. Schmiedeberg Arch. Pharm. 1997, 355, 551–558. [CrossRef]

12. Ko, FN; Cheng, ZJ; Lin, CN; Teng, CM Scavenger i antioksidativna svojstva prenilflavona izolovanih iz Artocarpus heterophyllus. Slobodni Radic. Biol. Med. 1998, 25, 160–168. [CrossRef]

13. Jantan, I.; Yasin, YH; Jamil, S.; Sirat, H.; Basar, N. Efekat preniliranih flavonoida i halkona izolovanih iz vrsta Artocarpus na agregaciju trombocita u ljudskoj punoj krvi. J. Nat. Med. 2010, 64, 365–369. [CrossRef]

14. Huang, CH; Li, HJ; Wu, NL; Hsiao, CY; Lin, CN; Chang, HH; Hung, CF Fotoprotektivni efekti cikloheterofilina protiv UVA-induciranih oštećenja i oksidativnog stresa u ljudskim dermalnim fibroblastima. PLOS ONE 2016, 11, e0161767. [CrossRef]

15. Shim, JH Anti-aging efekti cikloheterofilina u UVA-ozračenim dermalnim fibroblastima. Kor. J. Pharmacogn. 2019, 50, 285–290.

16. Tomita, Y.; Seiji, M. Mehanizam inaktivacije tirozinaze u melanomu miša. J. Dermatol. 1977, 4, 245–249. [CrossRef]

17. Panzella, L.; Ebato, A.; Napolitano, A.; Koike, K. Kasne faze melanogeneze: Istraživanje hemijskih aspekata i mogućnosti primjene. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1753. [CrossRef]

18. Talwar, HS; Griffiths, CE; Fisher, GJ; Hamilton, TA; Voorhees, JJ Smanjeni prokolageni tipa I i tipa III u fotooštećenoj koži odrasle osobe. J. Invest. Dermatol. 1995, 105, 285–290. [CrossRef]

19. Kim, J.; Lee, CW; Kim, EK; Lee, SJ; Park, NH; Kim, HS; Kim, HK; Char, K.; Jang, YP; Kim, JW Inhibicijski efekat ekstrakta Gynura procumbens na ekspresiju matriks-metaloproteinaze izazvane UV-B u ljudskim dermalnim fibroblastima. J. Enthnopharmacol. 2011, 137, 427–433. [CrossRef]

20. Kirkwood, TB Razumijevanje čudne nauke o starenju. Cell 2005, 120, 437–447. [CrossRef]

21. Jones, DL; Rando, TA Novi modeli i paradigme za starenje matičnih ćelija. Nat. Cell Biol. 2011, 13, 506–512. [CrossRef] [PubMed]

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501