Utjecaj in vitro simulacije ljudske probave na sadržaj fenola i biološke aktivnosti vodenih ekstrakata turskih vrsta cistusa 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Da sumiramo

Vodeni ekstrakt C.salvifolius pokazao je bolju inhibitornu aktivnost digestivnih enzima od ekstrakata drugih vrsta. Dodatno, IN uzorci svih vodenih ekstrakata otkrili su niže aktivnosti inhibicije enzima u odnosu na ND uzorke.

2.4. AGEs inhibitorna aktivnost

Kao što je prikazano u tabeli 4, u svim vodenim ekstraktima primećena je inhibitorna aktivnost zavisna od koncentracije AGE. ND uzorci CCA, CPA i CSA pokazali su bolju inhibitornu aktivnost od referentnog jedinjenja kvercetina u koncentracijama 0,5 i 1mg/mL. Međutim, samo ekstrakt C.saluifolius pokazao je bolju inhibitornu aktivnost od kvercetina među IN uzorcima ekstrakata. Bioraspoloživi uzorci vodenih ekstrakata pokazali su niže inhibitorne aktivnosti AGE u odnosu na nesvarene uzorke. Prema rezultatima, ND uzorak vodenog ekstrakta C.salvifolius imao je najveću inhibitornu aktivnost AGE. Međutim, IN uzorak vodenog ekstrakta C.monspeliensis pokazao je najslabiji potencijal inhibicije AGE u testiranim koncentracijama.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

3. Diskusija

Slobodni radikali mogu napasti proteine, lipide ili DNK kako bi nabavili elektron, što rezultira raznim zdravstvenim problemima. Iz tog razloga, neophodno je uravnotežiti antioksidativni sistem organizma i slobodne radikale nastale oksidacijom. U slučaju narušavanja ove ravnoteže nastaje oksidativni stres [29]. Oksidativni stres je jedan od glavnih faktora koji rezultira različitim kroničnim poremećajima kao što su rak, dijabetes, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerova bolest, itd. Iako postoje samoantioksidativni sistemi u ljudskom tijelu za borbu protivoksidativnooštećenja tkiva i organa, ovi odbrambeni sistemi mogu izgubiti svoju efikasnost zbog različitih stanja kao što su prekomjerna konzumacija alkohola, pušenje, stres, hronična upotreba droga, zračenje, itd. [30]. Različiti naučni izvještaji ukazuju da sekundarni biljni metaboliti igraju značajnu ulogu u prevenciji oksidativnog stresa i njegovih štetnih efekata [13,14,31]Iako je bioraspoloživost važan parametar koji utiče na bioaktivnost ovih jedinjenja, nije uzeta u obzir u većina studija. Međutim, dobro je poznato da su sekundarni metaboliti podvrgnuti strukturnim transformacijama zbog različitih pH uslova, enzimske aktivnosti i telesne temperature u gastrointestinalnom sistemu. Osim toga, hemijske karakteristike sekundarnih metabolita kao nprmolekularnitežina, polaritet i stepen vezivanja za makromolekule u biljnom matriksu su takođe značajni faktori koji utiču na njihovu bioraspoloživost [13]. Shodno tome, apsorpcija jedinjenja ili njihovih metabolita u krvotok kada se jednom progutaju je neophodna da bi se izvršili njihov sistemski fiziološki efekat. Simulacijski modeli digestije in vitro mogu pružiti dokaze za procjenu mogućih karakteristika bioraspoloživosti supstanci. Dok je potvrda u ispitivanjima na ljudima neophodna da bi se potvrdilo bilo koje funkcionalno svojstvo, in vitro simulacijski modeli se široko koriste kao alternative in vivo studijama ili ispitivanjima na ljudima, koja su često etički diskutabilna, zahtijevaju velike resurse, skupa i dugotrajna [32].

Cistanche može poboljšati imunitet

Nekoliko istraživača je također istraživalo antioksidativni potencijal ekstrakata pripremljenih iz različitih organa Cistus vrsta. Prema istraživanju literature, ovo je prva studija na Cistus vrstama u vezi sa bioraspoloživosti fenolnih supstanci i njihovom uticaju na antioksidativnu aktivnost primenom in vitro simulacionog modela digestije. Karas et al. [33] sugeriraju da 10 posto polifenolnih komponenti ostaje nesvareno u biljnom matriksu, a 90 posto njih je podvrgnuto varenju u želučanoj ili crijevnoj fazi (približno 48 posto i 52 posto, respektivno). Kao što je ranije spomenuto, in vitro postupak simulacije ljudske probave negativno je utjecao na sve količine fenola u vodenim ekstraktima. Tako su uočeni značajni gubici u fenolnom sadržaju bioraspoloživih uzoraka svih ekstrakata. Štaviše, ukupne koncentracije proantocijanidina u uzorcima IN bile su ispod granice detekcije u svim vodenim ekstraktima. Različite studije su također potaknule negativan utjecaj postupka digestije na fenolne spojeve u biljnim ekstraktima i time povezane bioaktivnosti. Na primjer, izvijestili smo o ukupnom sadržaju fenola u Salvia virgata Jacq. je također negativno utjecao na postupak varenja u našoj prethodnoj studiji. Osim toga, količine glavnih metabolita ekstrakta, tj. rutina i ružmarinske kiseline, imaju tendenciju pada [13]. Nasuprot tome, nekoliko studija je objavilo kontradiktorne rezultate. U studiji Celeb et al. [34], uočili su povećanje ukupnih količina fenolne kiseline, flavonoida i fenola u biodostupnim uzorcima metanolnog ekstrakta iz Hypericum perfoliatum L. Zapravo, glavni metaboliti, kvercitrin, hlorogena i galna kiselina, imali su omjere biodostupnosti preko 10 posto . Ove studije su pokazale da efekti postupka varenja mogu varirati u zavisnosti od biljnog materijala. Da bi se razjasnile ove razlike, neophodno je razmotriti mehanizam delovanja digestivnog sistema na fenolne supstance. Serra et al. [35] sugeriraju da se fenolna jedinjenja uglavnom nalaze u glikozidima, polimerima i esterskim oblicima u biljnom matriksu i da se hidroliziraju u probavnom sistemu prije apsorpcije. Različiti faktori mogu uticati na strukturne transformacije fenolnih jedinjenja u gastrointestinalnom traktu. Na primjer, spojevi veće molekularne težine, kao što su proantocijanidini ili procijanidini, moraju se hidrolizirati prije apsorpcije u crijevima. Struktura biljnog matriksa je takođe istaknuti faktor u bioraspoloživosti fenola; fenolna jedinjenja mogu se vezati za makromolekule u biljnom matriksu, kao što su vlakna, proteini i molekuli lipida. Dakle, samo oslobođene fenolne komponente iz matriksa mogu se apsorbirati iz gastrointestinalnog trakta. Štaviše, različite pH vrednosti i enzimsko delovanje crevne mikrobiote su među ostalim ključnim faktorima koji utiču na transformaciju hemijske strukture fenolnih jedinjenja [36]. U svjetlu ovih podataka, možemo pretpostaviti da različiti rezultati dobiveni iz sličnih vrsta eksperimentalnih studija mogu biti posljedica složenosti digestivnog sistema i sastava biljnog matriksa. Kao što je prikazano u Tabeli 3, bioraspoloživi uzorci ekstrakta Cistusa pokazali su slabiju antioksidativnu aktivnost od nesvarenih i post-želudačnih analoga zbog nižeg sadržaja fenola.

Štaviše, oba ekstrakta C. saluifolius pokazala su bolju antioksidativnu aktivnost u DPPH, CUPRAC, FRAP i TOAC testovima u poređenju sa drugim vrstama. Osim toga, oba ekstrakta C.paroiflorus pokazala su veću aktivnost uklanjanja radikala DMPD u odnosu na ekstrakte drugih vrsta. Kao što je prikazano u Tabeli 1, ukupni sadržaj fenola, flavonoida i fenolne kiseline u C. salviifolius bio je veći nego u ostalim uzorcima. Dakle, veći antioksidativni potencijal ekstrakta C. saloiifolius može biti povezan sa sadržajem fenola u njemu.

Štaviše, smanjenje antioksidativnih potencijala, inhibitorne aktivnosti na enzime povezane s ugljikohidratima i AGE bioraspoloživih uzoraka mogu biti povezani sa padom markerskih flavonoidnih glikozida. Međutim, ekstrakti Cistusa sadržavali su i druge fenolne supstance, kao što je prikazano na slici 1. Stoga je potrebna detaljna hromatografska analiza ekstrakata kako bi se pratio uticaj probave na biološku aktivnost.

Inhibicijski potencijal biljnih ekstrakata na probavne enzime nedavno je privukao više pažnje zbog zabrinutosti za sigurnost sintetičkih inhibitora. Stoga je inhibicijski učinak biljnih ekstrakata utvrđen u nekoliko studija, a ovaj učinak je općenito povezan sa fenolnim supstancama kao što su flavonoidi, fenolne kiseline, proantocijanidini itd. Sun et al. [37] sugeriraju da polifenolna jedinjenja pokazuju svoje inhibitorne efekte tako što se vezuju za gore navedene enzime uz pomoć hidrofobnih sila i nekovalentnih veza. Stoga je inhibicija enzima -amilaze i -glukozidaze polifenolima povezana s njihovim molekularnim strukturama. Iako je ovaj mehanizam interakcije proučavan korištenjem različitih tehnika kao što su kinetika inhibicije, gašenje fluorescencije pri molekularnom spajanju, itd., još uvijek nije donesen siguran zaključak [38]. Međutim, brojne studije su izvijestile da su inhibicije probavnih enzima biljnih ekstrakata direktno povezane s njihovim fenolnim sadržajem. Slične studije o inhibitornim aktivnostima enzima Cistus vrsta su također ranije objavljene. Sayah et al. [39] su istraživali inhibitorne aktivnosti -amilaze i a-glukozidaze 80% metanolnih i vodenih ekstrakata iz C. monspeliensis i C. saluifolius. Njihovi rezultati su u skladu sa ovom studijom, otkrivajući da vodeni ekstrakt C. salvijfolius pokazuje više -glukozidaze (IC50 ug/mL∶0.95±0.14) i o -amilaza (IC50 ug/mL∶217,1±0,15)inhibitorna aktivnost od vodenog ekstrakta C.monspeliensis (IC50 ug/mL∶14,58±1,26) i (ICsn ug/mL: 8±8,010,01:00,00) respektivno Stope inhibicije oba vodena ekstrakta na ovim enzimima bile su veće od referentnog jedinjenja akarboze (ICso ug/mL:18.01±2.00) Slično našoj studiji, oni su pronašli korelaciju sa stopama inhibicije enzima i ukupnim količine fenola i flavonoida. I ukupni fenolni i ukupni flavonoidni sadržaji vodenog ekstrakta C. salvijfolius (408,43±1,09 mg GAE i 140.00±1,15 RE, respektivno) bili su veći od C.monspeliensis vodenog ekstrakta (261,76 ±1,9 mg GAE). 78.00±1.15 RE respektivno). Orhan i dr. [40] su također istraživali potencijale inhibicije digestivnih enzima 80 posto vodenih i etanolnih ekstrakata iz listova C.laurifolius. Prema njihovim rezultatima, 80 posto etanolnog ekstrakta (71,7 posto ±0,6) pokazalo je jaku inhibitornu aktivnost amilaze u poređenju sa vodenim ekstraktom (39,3 posto ±2,2) pri koncentraciji od 1 mg/mL. Oni su predložili da fenolna jedinjenja, posebno flavonoidi, direktno utiču na lučenje insulina sprečavajući apoptozu beta ćelija i podržavajući antidijabetičku aktivnost. Ova hipoteza, u korelaciji s našim rezultatima, pokazuje da je ND uzorak vodenih ekstrakata C. salviifolius pokazao najveći ukupni sadržaj flavonoida i fenola i najveću inhibitornu aktivnost o-amilaze i o-glukozidaze. Kao što je dato u Tabeli 4, vodeni ekstrakt C. salviifolius pokazao je bolje inhibitorno djelovanje na probavne enzime od ostalih ekstrakata.

Dodatno, IN uzorci vodenih ekstrakata sadržavali su niže količine fenola i flavonoida od ND uzoraka i tako su otkrili niže inhibitorne aktivnosti enzima u ovom radu. Dok je postupak varenja negativno utjecao na fenolni sadržaj ekstrakata, oni su i dalje pokazivali značajnu inhibitornu aktivnost digestivnih enzima. U nekoliko studija, flavonoidni glikozidi su prijavljeni kao glavni metaboliti biljnih ekstrakata sa jakima-amilazei inhibicijski potencijali -glukozidaze [41-43]Dok mehanizam inhibicije fenolnih jedinjenja na probavne enzime još nije otkriven, studije odnosa strukture i aktivnosti su provedene na nekim fenolnim komponentama kao što su flavonoidi, fenolne kiseline, proantocijanidini i tanini. Studije odnosa strukture i aktivnosti o flavonoidima su pokazale da C2=C3 dvostruka veza C-prstena povećava potencijal inhibicije probavnih enzima takvih jedinjenja. Budući da ova veza povećava gustinu elektrona, povećava se jačina interakcije između flavonoida i enzima [44]. Osim toga, hidroksilne grupe na C-5 i C-7 olakšavaju inhibitorni potencijal flavonoida o-amilaze. Također je sugerirano da hidroksilacija skeleta flavonoida pozitivno utječe na njihovu a-amilazu i-enzim glukozidazeinhibitorni potencijali[45]. Kao što je ranije navedeno, svi markeri flavonoidi u ovoj studiji bili su flavonolni glikozidi koji nose ove strukturne zahtjeve opisane gore. Međutim, nakon in vitro postupka digestije, njihove povezane aktivnosti su značajno opadale u biodostupnim uzorcima vodenih ekstrakata.

Generalno, inhibitorni potencijal biljnih ekstrakata na AGE je povezan sa nekoliko faktora, tj. njihovim fenolnim sadržajem, antioksidativnim potencijalima, sposobnostima heliranja metala, interakcijama proteina i aktivnostima blokiranja AGE receptora[13]. Kao što je prikazano u Tabeli 4, bioraspoloživi uzorci vodenih ekstrakata pokazali su niže aktivnosti inhibicije AGE u poređenju sa ND uzorcima jer je in vitro postupak digestije negativno uticao na sadržaj fenola u ekstraktima. Prema dosadašnjim rezultatima istraživanja, ND uzorak vodenog ekstrakta C.salvifolius imao je najveću inhibitornu aktivnost AGE kao i ukupni sadržaj fenola i flavonoida. Za usporedbu, IN uzorak vodenog ekstrakta C.monspeliensis pokazao je najslabiji potencijal inhibicije AGE, što se može pripisati njegovom najnižem ukupnom sadržaju flavonoida i fenola. Budući da su flavonoidi široko rasprostranjeni u biljnim ekstraktima, voću, povrću i pićima, nekoliko studija se intenziviralo o potencijalu inhibicije flavonoida na formacije AGE. Isti flavonoidi koji su dodijeljeni kao markerski fenoli u ovoj studiji također su prijavljeni kao jedinjenja markera u drugim studijama [46-48].

Slično inhibiciji digestivnih enzima, AGE inhibitorne aktivnosti flavonoida stimulisane su C2=C3 dvostrukom vezom i hidroksilacijom A i C prstenova. Međutim, vezivanje šećera za skelet flavonoida dovodi do smanjene inhibitorne aktivnosti [49]. S druge strane, Cervantes-Lauren et al. [50] sugeriraju da flavon-3- glikozida posjeduje veći potencijal inhibicije AGE od ostalih flavonoidnih glikozida. Ova hipoteza može biti objašnjenje za smanjenu inhibiciju AGE u biodostupnim uzorcima. Na primjer, kvercitrin i hiperozid nisu otkriveni u bioraspoloživim uzorcima vodenog ekstrakta C.monspeliensis, što je razlog niže aktivnosti IN uzoraka C.monspeliensis u odnosu na ekstrakte drugih vrsta. Iako kvercitrin nije otkriven u vodenom ekstraktu C. saloifolius, značajno veće količine hiperozida i salidrozida mogu biti uzrok njegove visoke aktivnosti inhibicije AGE. Općenito, uočena je pozitivna korelacija između sadržaja markera flavonoida u uzorcima i njihovih inhibitornih potencijala na AGE.

4. Materijal i metode

4.1. Hemikalije

Sve reference, enzimi i hemikalije korištene u eksperimentima su kupljene od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, SAD). U eksperimentima su korišteni materijali analitičke kvalitete.

4.2. Uzorci biljaka

Nadzemni dijelovi C.creticus i C.saloifolius sakupljeni su iz kampusa Univerziteta Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) tokom posljednje sedmice aprila 2018. Nadzemni dijelovi C.mon-speliensis i C.paroiflorus su sakupljeni u blizini AlacatI Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir u drugoj sedmici maja 2018. Nadzemni dijelovi C. laurifolius su sakupljeni sa ceste Kemer-Doganhisar, Konya, u prvoj sedmici juna 2018. Prof. dr. Erdem Yesilada je potvrdio autentičnost biljnog materijala. Uzorci vaučera za C.creticus (YEF18013), C.lauri-folios (YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroiforus(YEF18016) i C.salvifolus (YEF18014) pohranjeni su u Herbarijumu Herbarijuma Odeljenja za Pharmacogno Farmaceutski fakultet Univerziteta Yeditepe, Istanbul, Turska.

4.3.Procedura ekstrakcije

Odabrana je vodena ekstrakcija jer se najčešće koristi kao tehnika pripreme u tradicionalnoj medicini. Grubo osušeni na zraku i u prahu nadzemni dijeloviCistanchevrste (100 g) ekstrahovane su vrućom destilovanom vodom (80 stepeni, 1,5 l) pomoću uređaja za mućkanje 15 min. Zatim su vodeni ekstrakti filtrirani kroz filter papir i upareni do suva pod sniženim pritiskom. Nakon završene procedure liofilizacije, ekstrakti su rastvoreni u destilovanoj vodi za dalju obradu (nesvareni uzorak: ND) (prinos ekstrakta: 13,04 odsto za C.creticus, 15,7 odsto za C.laurifolius, 12,8 odsto za C.monspeliensis ,14,94 posto za C.parviflorus, 14,74 posto za C.salvifolius).

4.4. Metoda simulacije ljudske probave in vitro

Simulacijski model probave kod ljudi primijenjen je na uzorke Cistus in vitro, slijedeći metodu koju su ranije detaljno opisali Celeb i svi.[34]. Prvo, 1 g NaCl i 1,6 g pepsina su rastvoreni u 500 mL destilovane vode da bi se dobio simulirani rastvor želudačne tečnosti. (SGF). Kasnije je pH rastvora SGF doveden na 2 sa HCl (5 M); 17,5 mL ovog rastvora je pomešano sa 2,5 mL biljnih uzoraka i ova smeša je smeštena u vodeno kupatilo za mućkanje na 37 stepeni tokom 2 h do imitiraju peristaltičke pokrete probavnog sistema. Nakon 2 h, uzorci su stavljeni u ledeno kupatilo da bi se deaktivirale enzimske reakcije; 2 mL uzoraka je ostavljeno kao "post-želudačni"(P) uzorak za dalje eksperimente. Celulozna dijalizna membrana napunjena odgovarajućom količinom NaHCO3(1 M, pH7) nalazi se u hladnim rastvorima uzoraka; tako je oponašana gastrointestinalna apsorpcija. Zatim je 4,5 mL rastvora žučne kiseline/pankreatina pomešano sa rastvorima i smeša je inkubirana još 2 h na 37 stepeni. Konačno, tekućina unutar membrane za dijalizu je uzeta kao "biodostupni" uzorak (IN). Nakon završetka procedure, svi uzorci su sačuvani na -20 stepenu za dalje eksperimente. 4.5. In vitro procjena fenolnog profila

4.5.1. Analiza ukupnog sadržaja fenola

Spektrofotometrijsko određivanje ukupnog fenolnog sadržaja uzoraka provedeno je u 96- šabloni ploče bunara prema metodi koju su ranije detaljno opisali Barak et al.【32】; 75 uL NagCO3 (20 posto u H2O) dodano je u 20 μL svježe pripremljenog uzorka i referentnih otopina. Zatim je 100 μL Folin-Ciocalteu reagensa pomiješano sa smjesom. Nakon perioda inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku, mjerena je apsorpcija na 690 nm. Galna kiselina je korištena kao referentna otopina u različitim koncentracijama za uspostavljanje kalibracione krive, a ukupni sadržaj fenola je izražen kao ekvivalent galne kiseline (GAE).

4.5.2. Analiza ukupnog sadržaja flavonoida

Spektrofotometrijskim određivanjem ukupnog sadržaja flavonoida u uzorcima upravljano je u 96- šablonu ploče bunara u skladu sa prethodno objašnjenom metodom od strane Bardakci et al.[51]; 150 uL 75 posto etanola, 10 uL aluminijum hlorida. , i 10 uL 1M natrijum acetat trihidrata je kombinovano sa 50 μL uzorka i referentnih rastvora, odvojeno. Zatim su ove smjese inkubirane na temperaturi tamne sobe 30 min. Nakon perioda inkubacije, apsorbancija je izračunata na 405 nm.kvercetinkorišćen je kao referentni rastvor pri različitim koncentracijama za uspostavljanje kalibracione krive, a ukupni sadržaji flavonoida su predstavljeni kao ekvivalenti kvercetina (QE). 4.5.3. Analiza ukupnog sadržaja fenolne kiseline

Ukupni sadržaj fenolne kiseline u uzorcima mjeren je spektrofotometrijski prema proceduri koju su ranije izvijestili Barak et al. [52]. Prvo, odgovarajuće količine natrijum nitrita i natrijum molibdata su rastvorene u destilovanoj vodi da bi se dobio Arnow reagens. Zatim je odvojeno 1 ml uzoraka kombinovan sa 1 mL Arnow reagensa, 1 mL 0.1 M HCl i 1 mL 1M NaOH. Nakon toga, zapremina smeše je podešena na 10 mL destilovanom vodom, a apsorbancija je očitana odmah na 490 nm. Kafeinska kiselina je korištena kao referentna otopina u različitim koncentracijama da bi se dobila kalibracijska kriva, a ukupni sadržaj fenolne kiseline je dat kao ekvivalenti kofeinske kiseline (CAE).

4.5.4. Analiza ukupnog sadržaja proantocijanidina

Spektrofotometrijsko određivanje ukupnog sadržaja proantocijanidina u uzorcima sprovedeno je u šablonu ploče sa 96-jažicom prema metodi Baraka et al. [1] Ukratko, 25 uL rastvora uzorka pomešano je sa 150 μL 4% vanilina i 75 μL rastvora HCl (32%), respektivno. Nakon 15 minuta inkubacije na temperaturi tamne sobe, apsorbancija je podešena na 492 nm. Katehin hidrat je korišten kao referentna otopina u različitim koncentracijama da bi se dobila kalibracijska kriva. Metanol je korišten kao kontrolni rastvor. Ukupni sadržaj proantocijanidina u uzorcima je iskazan kao katehin ekvivalenti (CE).

4.6. Testovi aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala 4.6.1. Analiza aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala DPPH

Aktivnost čišćenja DPPH radikala uzoraka određena je u šablonu ploče sa 96-bunarićima slijedeći metodu modificiranu od strane Celeb et al.[53]. U početku je svježe pripremljeno 150 uM otopine DPPH. Zatim je 200 μL rastvora DPPH pomešano sa 25 μL rastvora uzoraka. Zatim je ova smjesa inkubirana na temperaturi tamne sobe 50 min. Apsorbancija je izračunata na 540 nm. Butilirani hidroksitoluen (BHT) je korišten kao referentna otopina u različitim koncentracijama. Metanol je korišten kao kontrolni rastvor. Aktivnost uzoraka predstavljena je kao EC50, što odgovara koncentraciji koja pokazuje 50 posto aktivnosti.

4.6.2. Analiza aktivnosti uklanjanja radikala DMPD

Aktivnost uklanjanja radikala DMPD plus (N,N-dimetil-p-fenilendiamin) uzoraka je sprovedena u šablonu ploče sa 96-jažicom prema metodi koju su ranije opisali Inan et al. [13]. Prvo, 10{{10}} mM DMPD plus rastvor, 0,05 M FeCl; Rastvor 6H2O i 0,01 M acetatni pufer su svježe pripremljeni. Zatim, 1 mL rastvora DMPD, 100 mL acetatnog pufera i 0,2 mL FeCl; 6H2O rastvor je pomešan, a kasnije je 15 μL rastvora uzoraka kombinovano sa 210 μL ove smeše. Nakon perioda inkubacije na temperaturi tamne prostorije od 50 minuta, mjerena je apsorpcija na 492 nm. Trolox je korišten kao referentna otopina u različitim koncentracijama da bi se dobila kalibracijska kriva. Koncentracije rastvora uzoraka bile su 1 mg/mL. Aktivnosti uklanjanja radikala DMPD uzoraka su navedene kao Trolox ekvivalenti (TE). 4.7. Testovi aktivnosti smanjenja metala

4.7.1. Test snage antioksidansa za smanjenje feriksa (FRAP)

Određivanje FRAP aktivnosti uzoraka obavljeno je u šablonu ploče sa 96 jažica prema proceduri koju su ranije izvijestili Bardakci et al.[54]. Na početku eksperimenta, FRAP reagens je formiran miješanjem acetatnog pufera, feri-tripiridiltriazina i FeCl; 6H2O rješenja. Nakon toga, FRAP reagens je stavljen u pećnicu na 37 stepeni na 30min. Zatim je 10 uL rastvora uzorka kombinovano sa 30 uL destilovane vode i 260 μL FRAP reagensa, respektivno. Nakon vremena inkubacije na 37 stepeni u trajanju od 30 minuta, apsorbanca je podešena na 593 nm. Standardna kriva je napravljena korištenjem različitih molariteta otopine željeznog sulfata (0.25-2 mM) za procjenu rezultata. BHT je korišten kao referentna otopina u različitim koncentracijama. FRAP aktivnosti uzoraka prikazane su kao mM FeSO4 u 1 g suhog ekstrakta.

4.7.2. Test za smanjenje antioksidativnog kapaciteta Cupric (CUPRAC)

CUPRAC aktivnost uzoraka određena je u šablonu ploče sa 96-jažicom slijedeći metodu modificiranu od strane Celeb et al. 【31】; 85 μL CuSO4 (10 mM), rastvora neokupraina i amonijum acetata i 51 uL destilovane vode odvojeno je dodato u 43 uL rastvora uzoraka. Nakon perioda inkubacije (20 min) na 50 stepeni u vodenom kupatilu, mjerena je apsorpcija na 450 nm. Askorbinska kiselina je korištena kao referentna otopina u različitim koncentracijama da bi se dobila kalibracijska kriva. CUPRAC aktivnosti uzoraka predstavljene su kao ekvivalenti askorbinske kiseline (AAE). 4.8. Test ukupne antioksidativne aktivnosti (TOAC) Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti uzoraka izvedeno je u šablonu ploče sa 96-jažicom slijedeći proceduru Celeb et al. [55]. Najprije je pomiješana određena količina monobaznog natrijum fosfata, amonijum molibdat tetrahidrata i sumporne kiseline da bi se dobila otopina TOAC. Zatim je 300 μL rastvora TOAC dodano u 30 μL rastvora uzoraka. Nakon perioda inkubacije na 95 stepeni u vodenom kupatilu od 90 min, apsorbanca je određena na 690 nm. Askorbinska kiselina je korištena kao referentna otopina u različitim koncentracijama da bi se dobila kalibracijska kriva. TOAC aktivnosti uzoraka su predstavljene kao ekvivalenti askorbinske kiseline (AAE). 4.9. Procjena indeksa bioraspoloživosti

Indeks bioraspoloživosti (BAvI) je izračunat prema teorijskoj jednačini koju su opisali Inan i saradnici.[13]: BAVI=CIN/CND "Indeks bioraspoloživosti" (BAvI) je opisan kao omjer broja fenola. u bioraspoloživom uzorku (IN) prema onom u nesvarenom uzorku (ND). 4.10. Kvantifikacija markerskih flavonoida pomoću HPTLC

Kvantitativno određivanje koncentracija salidrozida, hiperozida i kvercitrina u svim simulacijskim uzorcima (ND, PG, IN) vodenih ekstrakata iz vrste Cistus provedeno je visokoučinkovitom tankoslojnom hromatografijom (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Švicarska) slijedeći metodu koju su potvrdili Guzelmeric et al.[16]. Hiperozid, salidrozid i kvercitrin pripremljeni su u koncentracijama od 25,50 i 100 ug/mL, a koncentracije svježe pripremljenih otopina uzoraka su podešene na 10 mg/mL. Ovi rastvori su primenjeni na normalne faze staklenih ploča od silika gela (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Nemačka) sa određenim zapreminama (1-5 μL standardnih rastvora i 5 uL rastvora uzoraka) korišćenjem špriceva od 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, Švajcarska）.Procedura nanošenja je obavljena aplikatorom uzorka Linomat 5. Proces razvoja je obavljen u automatizovanoj razvojnoj komori (ADC 2) i etil acetat: dihlorometan. octena kiselina. mravlja kiselina: voda (10:25:10 :10:10:10me) odabrana je kao mobilna faza.Potom su ploče derivatizovane reagensom prirodnog proizvoda (NPR)(1g difenilborne kiseline 2-aminoetilesterina 200mL etil acetata) u uređaju za uranjanje (CAMAG).hiperozidi kvercitrin su analizirani spektrofotometrijski na 260 nm, količina salidrozida je izmjerena na 330 nm UV skenerom. Rf vrijednosti standarda određene su kao hiperozid （≈0.35）, kvercitrin （≈0.45）, tilirozid （≈0.65）. Utvrđeno je da su koeficijenti korelacije (r2) ×0.9 za kvantifikaciju markerskih flavonoida.

4.11.Inhibitorna aktivnost na enzime povezane sa dijabetesom

4.11.1. -Inhibicijska aktivnost glukozidaze

Inhibicijska aktivnost glukozidaze nesvarenih i biodostupnih uzoraka dobijenih iz vodenih ekstrakata Cistus vrsta ispitana je metodom koju su ranije objasnili Balan et al. [56]. Prvo, odgovarajuće količine mononatrijum fosfata i dinatrijum fosfata su pomešane sa nabavkom 100mM fosfatnog pufera (pH7). enzim o--glukozidaze je otopljen u fosfatnom puferu da se dobije rastvor a-glukozidaze (0.2U/mL). Zatim je spojeno 170 uL fosfatnog pufera, 20 μL rastvora -glukozidaze i 20 uL rastvora uzoraka i inkubirano u pećnici na 37 stepeni 15 minuta. Nakon toga, 20 μL 2,5 mM rastvora p-nitrofenil- -D-glukopiranozida u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH7,0) je dodato u smjesu, a drugi period inkubacije je izvršen na 37 stepena 15 min. Zatim je u smjesu dodano 80 μL 0,2 M rastvora natrijum karbonata da bi se reakcija prekinula. Apsorpcija je izmjerena na 405 nm. Kao referenca korištena je otopina kvercetina u različitim koncentracijama. Rezultati su procijenjeni kao postotak inhibitorne aktivnosti u 1 mg/mL i 0,5 mg/mL koncentracijama ND i IN uzoraka vodenih ekstrakata Cistus vrsta. 4.11.2. -Inhibitorna aktivnost amilaze Inhibicijska aktivnost o-amilaze nesvarenih i biodostupnih uzoraka dobijenih iz vodenih ekstrakata Cistus vrsta određena je slijedeći proceduru koju su prethodno detaljno opisali Balan et al.[56]. Spektrofotometrijsko određivanje aktivnosti inhibicije a-amilaze uzoraka je izvršeno primjenom DNS (3,5-dinitrosalicilna kiselina) reagensa. Kako je navedeno u metodi, maltoza nastaje konverzijom škroba, a žuta boja alkalnog DNS-a pretvara se u narandžasto-crvenu zbog maltoze proizvedene iz škroba. Tako je 96 mM rastvor DNS pripremljen od mešavine rastvora natrijum-kalijum tartarata (otopljenog u 2 M NaOH) i određene količine DNS (rastvorenog u destilovanoj vodi). Zatim je pripremljen 20 mM natrijum fosfatni pufer sa 6,7 ​​mM NaCl (kofaktor enzima u-amilaze) na 20 stepeni (pH:6,9). enzim a-amilaze (1U/mL) i skrob (10 mg/mL) su rastvoreni u ovom puferu. Nakon toga, 50 μL natrijum fosfatnog pufera i 10 μL rastvora enzima a-amilaze pomešano je sa 20 μL rastvora uzorka. Ova mešavina je inkubirana na 37 stepeni 45 min. Nakon perioda inkubacije, u smjesu je dodato 20 μL rastvora škroba. Drugi period inkubacije je započeo na 37 stepeni u trajanju od 45 minuta. Ista procedura je primenjena na uzorke bez dodavanja rastvora enzima w-amilaze pod nazivom "pozadina uzorka". Kontrolna grupa je proučavana istim postupkom u odsustvu rastvora uzoraka. Apsorpcija je izmjerena na 540 nm. Akarboza je korištena kao referentna otopina u različitim koncentracijama. Rezultati su prikazani kao postotak inhibitorne aktivnosti u koncentracijama od 1 mg/mL i 0,5 mg/mL uzoraka ND i IN iz vodenih ekstrakata Cistus vrsta. 4.11.3.Aktivnost inhibicije AGE Inhibicijska aktivnost AGE nesvarenih i biodostupnih uzoraka iz vodenih ekstrakata Cistus vrsta određena je metodom koju su opisali Starow-icz et al. [57]. Prije bilo kakvog procesa, 1 mg/mL i 0,5 mg/mL koncentracije ND i IN uzoraka su svježe pripremljene. Zatim je 1 mL otopine goveđeg serumskog albumina (BSA) koncentracije 10 mg/mL dodan u 1 mL otopine ND i IN uzoraka. Kontrolni uzorci su pripremljeni bez dodavanja rastvora ND i IN uzoraka, a slijepi uzorci pripremljeni su bez dodavanja 0,5 M glukoze. Zatim su svi pripremljeni uzorci inkubirani 40 h u vodenom kupatilu na 55 stepeni. Nakon završetka perioda inkubacije, Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX multimodni čitač mikroploča je korišćen u opsegu ekscitacije 370 nm/440 nm emisije za izračunavanje intenziteta fluorescencije. Kvercetin je korišten kao referentna otopina u različitim koncentracijama.

4.12.Statistička analiza

Svi eksperimenti su izvedeni nezavisno tri različita puta. Softverski program GraphPad Prism (verzija 6.1) korišten je za određivanje parametarske ili neparametarske distribucije podataka. Jednosmjerna ANOVA Tukeyova sekcija višestrukih poređenja korištena je za procjenu TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH i DMPD testova. S druge strane, rezultati eksperimenata inhibicije o-amilaze, -glukozidaze i AGE ispitani su dvosmjernom ANOVA Sidakovom analizom višestrukih poređenja. Značajni rezultati su prikazani sa str<0.05. 5.="">

U ovoj studiji, vodeni ekstrakti svih vrsta Cistus zabilježenih u turskoj flori ispitani su na njihov fenolni profil i in vitro antioksidativni i antidijabetički potencijal. Budući da je dekocija ili infuzija uobičajen oblik u tradicionalnoj medicini, korištenje vodenih ekstrakata za procjenu aktivnosti u eksperimentalnim studijama je posebno važno. S druge strane, hidrofilni sastojci u vodenom ekstraktu su podvrgnuti nizu metaboličkih transformacija u gastrointestinalnom sistemu kada se jednom progutaju. Stoga za ispravnu procjenu aktivnosti tradicionalnih formulacija, također treba istražiti aktivnosti bioraspoloživih metabolita.

Ovo je prva studija koja ispituje posljedice in vitro metode simulacije ljudske probave na turske vrste Cistus. Osim toga, u ovoj studiji po prvi put je proučavan inhibicijski potencijal vrsta Turkish Cistus na AGE. Nadalje, salidrozid, hiperozid i kvercitrin su dodijeljeni markerimaflavonoidi, a promjene u njihovim koncentracijama praćene su u postupku in vitro digestije. Dok su na sadržaj fenola i antidijabetičko i antioksidativno djelovanje ekstrakata negativno utjecali postupci gastrointestinalne probave, oni su i dalje pokazivali značajnu bioaktivnost. Prema rezultatima, ekstrakt C.saloifolius je otkriven kao najsnažnija biljka u pogledu sadržaja fenola i antioksidativnog i antidijabetičkog djelovanja. Zaključno, nadzemni dijelovi turskih vrsta Cistus imaju bogat sadržaj fenola i potencijalno antioksidativno i antidijabetičko djelovanje. Iako je metoda in vitro simulacije probave korištena za procjenu bioraspoloživosti, ona možda neće u potpunosti oponašati metaboličke puteve koji se javljaju u organizmu. Stoga su potrebne daljnje in vivo i kliničke studije kako bi se detaljno procijenila bioraspoloživost fenolnih jedinjenja i njihov doprinos prijavljenim farmakološkim efektima.

Ovaj članak je preuzet iz Molecules 2021, 26, 5322