In vivo administracija crijevnih bakterijskih konzorcija replicira metabotipove urolitina A i B u modelu štakora koji ne proizvodi urolitinⅠ
Dec 25, 2023
Decenijama je konzumacija elagitanina (ET) ielaginske kiseline (EA) bila povezana sa brojnim biološkim efektima, uključujući antioksidativne, antikancerogene, antiinflamatorne, antibakterijske i anti-HIV aktivnosti replikacije.1 Međutim, apsorpcija i biodostupnost ET i EA su veoma loše. Prethodne studije na ljudima otkrile su da je izlučivanje EA i EA-O-glukuronida u urinu manje od 1% unosa.2,3 Ipak, dok je apsorpcija ET i EA niska, mikrobiota debelog crijeva ih dalje metabolizira u urolitine (Uros), koji su odgovorni, barem djelimično, za blagotvorne efekte hrane bogate ET i (ili) EA.1,4
Prvo, EA se oslobađa hidrolizom ET-esterskih veza pomoću enzima poznatog kao elagitanaza.5 EA se dalje razgrađuje, proizvodeći 6H-dibenzo[b,d]piran-6- jedan derivat koji se zove Uros. Ova kaskada reakcija počinje cijepanjem laktonskog prstena od strane enzima laktonaze, što rezultira luteinskom kiselinom, koja se zatim dekarboksilira u pentahidroksi-Uro (Uro-M5). Uzastopna dehidroksilacija pretvara je u tetrahidroksi-Uros(Uro-D, Uro-E i Uro-M6) i trihidroksi-Uros (Uro-C, UroM7 i Uro-G), da bi se konačno dobili dihidroksi-Uros (Uro-A andisoUro-A) i monohidroksi-Uro (Uro-B), pri čemu se potonji općenito detektuje kada se proizvodi i isoUro-A.1
Široke varijacije Uro metaboličkih profila otkrivene kod ljudi nakon konzumiranja hrane bogate ET ukazuju na interindividualne razlike u mikrobioti debelog crijeva odgovornoj za degradaciju ET.6–8 Brojne moguće interakcije između bakterija debelog crijeva i organizma domaćina mogu objasniti različite metaboličke sudbine ishrane (poli )fenola.6,9 Ova dvosmjerna interakcija između crijevne mikrobiote i (poli)fenola potaknula je naučnu zajednicu da grupiše populaciju na osnovu njihovihmetabolički fenotip (metalni tip) kako bi se objasnile razlike u efektima polifenola.10,11 Tačnije, prema metabolizmu ET i EA, pojedinci se mogu stratificirati u urometabotipove (UM) povezane sa sastavom i funkcionalnošću crijevnog mikrobioma.7,8,12
Tri ljudska UM-a (UM-A, UM-B i UM-0) povezana sa tri različita profila proizvodnje Uro-a opisana su u zapadnim i istočnim populacijama.13–15 U tom smislu, osobe metabotipa A (UM-A) proizvode nekoliko srednjih Uro, ali samo urolitin A(Uro-A), glavni apsorbirani Uro u ovom UM, na kraju mikrobiološkog kataboličkog puta. Pojedinci metabotipa B (UM-B) proizvode neki srednji Uros i tri konačna Urosa, tj. urolitin B (Uro-B), urolitin A (IsoUro-A) i Uro-A, koji su glavni apsorbirani Uros u UM-B. Stoga bi srednji Uros mogao djelovati prvenstveno u crijevima, dok bi završni mogli imati lokalno i sistemsko djelovanje.6 Nasuprot tome, pojedinci sa metalnim tipom 0 (UM-0) ne mogu proizvesti ove finalne Uros (samo Do sada je otkriven prekursor Urolithin-M5, koji se ne apsorbira u crijevima).
Uočene su razlike u Uroprofilima između UM i duž debelog crijeva, pokazujući dominantnu proizvodnju Uro u distalnom kolonu.16–19 Zanimljivo je da je postotak UM-0 kod zdravih dobrovoljaca u Španiji i Kine približno 10% i mogao bi biti čak i veći u populaciju SAD-a.13–15 Bakterijski rodovi Gordonibacter i Ellagibacter su identifikovani kao sposobni da metaboliziraju EA u neke Uros.20–23Međutim, otkriveno je da neki međuprodukti (na primjer, Uro-D, Uro-E, Uro- M7 i Uro-G) i konačni Uros (Uro-A i Uro-B) se ne proizvode u čistim kulturama ovih bakterija, što implicira potrebu da druge bakterije dovrše set Uros-a koji konfiguriraju i UM-A i UM-B . Nedavno su identifikovani konzorcijumi crijevnih bakterija koji su uključeni u metabolizam EA da bi dobili metabotipove koji proizvode Uro (UM-A i UM-B) in vitro.24
Bakterijski konzorcijumi koji sadrže rodove Gordonibacter plusEnterocloster i Ellagibacter plus Enterocloster proizveli su in vitro urolitine povezane sa UM-A i UM-B, respektivno.25 Međutim, sposobnost ovih bakterijskih konzorcija da repliciraju ljudske Uro profile povezane sa UM-A i UM-B u vivo je još uvijek nepoznato. Nadalje, sigurnost konzumiranja ovih bakterija koje proizvode Uro kao novih probiotika još uvijek je neizvjesna, jer nije prethodno testirana na životinjama ili ljudima. U ovoj studiji, gore navedeni bakterijski konzorcijumi su procijenjeni u pogledu njihovog kapaciteta da koloniziraju crijevo pacova koji ne proizvode Uro (UM-0-) i pretvore ih u Uroproducente koji oponašaju UM-A i UM-B, respektivno. Procijenjena je i sigurnost ovih bakterijskih konzorcija. Osim toga, razvijene su dvije nove kvantitativne PCR (qPCR) procedure u realnom vremenu za otkrivanje i kvantifikaciju Ellagibacter i Enterocloster u uzorcima fekalija.
materijali i metode
Hemikalije i reagensi
Uros su hemijski sintetizovani i pročišćeni od strane VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Španija). EA je kupljen od Sigma-Aldrich (St Louis, MO, SAD). Fosfatni pufer fiziološki rastvor (PBS) dobijen je od FisherScientific-a (SAD), dok su metanol, etanol i mravlja kiselina iz Panreac Química (Barselona, Španija). Rastvarači za tečnu hromatografiju-masenu spektrometriju (LC-MS) su nabavljeni od JT Bakera (Deventer, Holandija). UltrapureMillipore voda (Bedford, MA, SAD) je korištena u cijeloj studiji. Sve hemikalije i reagensi su bili analitičke čistoće.
Priprema bakterijskih konzorcija
Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T, i Enterocloster pričvrstili CEBASS4A9, svi su izolovani i identifikovani u našoj laboratoriji (CEBAS-CSIC, Španija), kultivisani su u ANALIZACIJI 5. -Chalgren anaerobni medij (WAM, Oxoid) epruvete na 37 stepeni tokom 48 h u Concept 400 anaerobnoj komori (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Južni Vels, UK) i resuspendovane u PBS sa dodatkom 10% glicerola i 0,05% L-cyan hidroklorida Química, Barselona, Španija). Nakon anaerobne inkubacije, pripremljeni su konzorcijumi.24,25 Ukratko, "bakterijski konzorcij A" je sadržavao G. urolithinfaciens i sojevi E. bolteae; "bakterijski konzorcij B" sadržavao je kulture E. isourolithinifaciens i E. bolteae; i "kontrolni koktel" sadržavao je sterilni PBS sa 10% glicerola i 0,05% L-cistein hidrohlorida. Prije primjene, svi kokteli su raspoređeni u alikvote od 3,5 mL i držani na -80 stepeni.
Životinje, dijeta i eksperimentalni dizajn
Eksperimentalni protokol (referenca 624/2020) odobrila je lokalna vlada, Odbor za bioetiku španjolskog Nacionalnog istraživačkog vijeća (Madrid, Španjolska) i Etički odbor za eksperimentiranje na životinjama sa Univerziteta Mursija (Španija). Eksperimenti su slijedili preporuke Europske unije u pogledu eksperimentiranja na životinjama (Direktiva 2010/63/EU Evropskog parlamenta i Vijeća o zaštiti životinja koje se koriste u naučne svrhe). Wistar pacovi (n=18; 9 ženki i 9 mužjaka) težine 240 ± 31 g dobijeni su iz Enviga (Barselona, Španija). Ovaj model štakora odabran je na osnovu njegove nemogućnosti da proizvede Uros uočeno u našim preliminarnim studijama u kojima su testirani uzorci fekalija različitih modela štakora. Tri grupe (A, B i C) su formirane slučajnim dodjeljivanjem po 6 životinja (3 ženke i 3 mužjaka štakora). ) po grupi (slika 1).
Svaka grupa pacova bila je smeštena u dva različita kaveza, podeljena po polu, u prostoriji sa temperaturom kontrolisanom okolinom (22±2 stepena) sa 55 ± 10% relativne vlažnosti i kontrolisanim ciklusom svetlost-mrak (12 h). Pacovi su primali standardnu ishranu (Teklad, Barcelona, Španija) koja je sadržavala (%/100 g svježe težine) 14,3% proteina (kukuruzni gluten), 48% ugljikohidrata (srijeda pšenice, mljevena pšenica, mljeveni kukuruz) i 4% masti (sojino ulje). ), 2,9 kcal g-1 energetske gustine i 4,1% sirovih vlakana, sa dodatkom EA praha Čistoće veće ili jednako od 95% (3,6 mg na 100 g hranljive hrane). EA je homogeno pomiješan sa mljevenim standardnim krmivom, ponovo peletiran i liofiliziran. Dijeta obogaćena EA čuva se dalje od vlage i svjetlosti. Doza EA koja se dajepacova u ishrani iznosilo je približno 0.72 mg po štakoru dnevno (EA1× dijeta), ljudska ekvivalentna doza od 41 mg dnevno −1,26 Sve grupe su hranjene hranom EA 1× i vodom iz slavine ad libitum tokom eksperimenta ( 5 sedmica). Budući da je EA otkriven u uzorcima fekalija bio nizak tokom prve sedmice, dodato je nešto dodatnog EA u narednim danima. U sedmici 3, životinjama je oralno davana dodatna doza od 1,5 mgEA po štakoru dnevno rastvorenom u vodi putem sonde (ukupno=EA 3× dijeta), koja je davana samo 1 sedmicu. Konačno, u sedmici 4, ≈5 g oraha po štakoru dnevno (još jedan izvor EA) dodano je EA 1× ishrani i zadržano je do kraja studije kako bi se procijenio uticaj EA koji sadrži matriks hrane na sposobnost bakterija. za proizvodnju Uroša. Težina, unos hrane i vode mjerili su se svaki dan. Grupa A je primila 500 µL bakterijskog koktela A, Grupa B je primila 500 µL bakterijskog koktela B, a Grupa C (kontrolna) je primila 500 µL PBS-a. Oralna gavaža je vršena svaka 2 dana tokom prve dve nedelje i svaki dan tokom sledeće 2 nedelje. U posljednjoj sedmici (28. do 32. dan), životinje su nastavile s istom ishranom dopunjenom EA i orasima, ali bez oralne primjene bakterija. Na kraju studije, životinje su žrtvovane pomoću CO2 komore.
Procedure uzorkovanja
Uzorci fekalija su prikupljeni tokom studije za Uro analizu pomoću UPLC-ESI-QTOF-MS/MS i crijevne mikrobiote sekvenciranjem 16S rRNA gena i qPCR. Krv je vađena u različitim vremenskim tačkama (početna linija, 28. dan i kraj studije) za hematološke i biohemijske analize seruma. Uzorci krvi su uzeti iz repne vene (≈500 µL) i sakupljeni u epruvete koje sadrže heparin na početnoj liniji i 28. i 32. dana (slika 1). Odvajanje plazme je izvršeno odmah centrifugiranjem na 3000 g tokom 10 minuta na 4 stepena i zamrznuto na - 80 stepeni do daljeg određivanja serobiohemijskih varijabli. Jetra, bubrezi i slezena su sakupljeni, izvagani i pregledani kako bi se otkrile bilo kakve morfološke razlike pri žrtvovanju.
Dizajn i optimizacija prajmera i sonde za kvantifikaciju Ellagibactera i Enterocloster pomoću qPCR
Sekvence 16S rRNA gena Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T i E. bolted CEBAS S4A9 dobijene su iz GenBank baze podataka (EMBL baza podataka). Sekvence su usklađene sa filogenetski bliskim bakterijskim generisanjem pomoću softvera za analizu molekularne evolucione genetike (MEGA 11) i pregledane za regione očuvanih i varijabilnih sekvenci da bi se dizajnirali prajmeri i sonde za otkrivanje i kvantifikaciju Ellagibaktera i Enteroklostera (Tabela 1). Prajmer i sonda su dizajnirani i validirani pomoću alata Primer Questand Oligo Analyzer, respektivno (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgija). TaqMan sonda je označena na 5′ i 3′ krajevima sa6-karboksi-fluoresceinskom grupom (6FAM) i uređaj za gašenje kupina (BBQ). qPCR je izveden korišćenjem sistema za detekciju sekvenci ABI 7500. Konačne koncentracije svakog prajmera i sonde bile su 300 i 375 nM za Ellagibacter i 200 i 500 nM za Enterocloster. Proveden je konvencionalni qPCR protokol za amplifikaciju DNK Ellagibactera iEnterocloster, respektivno. Profil porasta za Ellagibacteramplifikaciju bio je 1 ciklus na 95 stepeni u trajanju od 5 minuta, nakon čega je usledilo 45 ciklusa od 95 stepeni tokom 15 s, 50 stepeni za 40 s i 72 stepena za 31 s. Na kraju, dodat je 1 ciklus na 72 stepena u trajanju od 5 minuta. . Ramping profil za Enterocloster amplifikacije bio je 1 ciklus na 95 stepeni tokom 5 minuta, nakon čega je usledilo 40 ciklusa od 95 stepeni tokom 15 s, 65 stepeni za 40 s i 72 stepena za 31 s. Na kraju je dodat 1 ciklus na 72 stepena u trajanju od 5 minuta.
Ekstrakcija fekalne DNK i mikrobne analize crijeva
Ekstrakcija DNK iz fekalnih uzoraka izvedena je NucleoSpin® kompletom za prečišćavanje DNK tkiva (Macherey-Nagel, Njemačka), prema uputama proizvođača uz određene modifikacije. DNK je kvantificirana fluorimetrijom (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK), a čistoća je mjerena iz omjera apsorbancije na talasnoj dužini od 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher, SUK ). Sastav crijevne mikrobiote određen je sekvenciranjem varijabilnih regija V3 i V4 gena 16S rRNA prema Illumina protokolima (Illumina Inc., San Diego, CA, SAD) s dužinom očitavanja od 2 × 300 bp uparenog kraja (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Metagenomsko sekvenciranje je obavljeno na platformi MiSeq-Illumina (FISABIO sequencingservice, Španija). Obrada podataka, uklanjanje himernih sekvenci, poravnanje sekvence i grupisanje sekvenci gena 16S rRNA izvedeni su kako je opisano na drugom mestu da bi se dobila taksonomska klasifikacija.8,27 Amplifikacija DNK Gordonibacter je postignuta u ABI 7500 qPCR sistemu kao što je prethodno opisano.19,28 The Enterokloster-Ellagibacloster- Specifični prajmeri i sonde dizajnirane u ovoj studiji korišćene su prema gore opisanom qPCR protokolu. Za kvantifikaciju korištene su standardne krive genomske DNK Gordonibacter, Enterocloster i Ellagibacter. Svi uzorci fekalija analizirani su u tri primjerka.
Ekstrakcija, detekcija i kvantifikacija urolitina u uzorcima fekalija
Uzorci fekalija ({{0}}.2–0.5 g) ekstrahovani su, u omjeru 1:10, sa rastvorom MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), zakiseljeno sa0.1% HCl, i homogenizovano vrtložnim mešanjem tokom 2 min i mućkanjem na 1500 o/min na sobnoj temperaturi 10 min u blok grejaču. Suspenzija je centrifugirana na 14 000g na 4 stepena 10 minuta, a supernatant je filtriran kroz 0,22 µm PVDF membranski filter (Millipore Corp., Bedford, MA) i razrijeđen 3x sa MeOH (0,1% mravlja kiselina). ) prije ubrizgavanja u UPLC-ESI-QTOF-MS sistem. UPLC sistem (Agilent 1290Infinity) spojen sa kvadrupolnim LC/MS sistemom (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Njemačka) uparen je sa kvadrupolnim sistemom za vrijeme leta (QTOF) (Agilent Technologies, Waldbronn, Njemačka) korišten je za analizu metabolita izmeta korištenjem metode gradijenta elucije kao i prethodno .29,30 Ukratko, odvajanje je izvršeno u koloni aPoroshell 120 EC-C18 reverzne faze, koristeći vodu i acetonitril, oba zakiseljena sa 0,1% mravlje kiseline, kao mobilne faze. Brzina protoka je bila 0,4 mL min−1, a zapremina injekcije je bila 5 µL. Za obradu podataka korišten je softver MassHunter Qualitative Analysis (verzija B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Njemačka). Svi metaboliti su identificirani direktnim poređenjem sa standardima i potvrđeni njihovom molekularnom masom. Kalibracione krive su dobijene za EA i različite Uros sa dobrom linearnošću (R2 > 0,99).
Hematologija i klinička hemija
Hematološke varijable su određene u hepariniziranoj krvi pomoću automatskog hematološkog analizatora sa specifičnim softverom za uzorke krvi pacova (AVDIA 120, Siemens, Minhen, Njemačka). Analizirane varijable bile su srednji korpuskularni volumen (MCV), srednji korpuskularni hemoglobin (MCH), srednja koncentracija korpuskularnog hemoglobina (MCHC), distribucija eritrocita (RDW), srednji volumen trombocita (MPV), trombocitni krit (PCT), širina distribucije trombocita (PDW) , srednja trombocitna komponenta (MPC), srednja masa trombocita (MPM), broj trombocita (PLT), sadržaj retikulocitnog hemoglobina (CHr) i srednji korpuskularni volumen retikulocita (MCVr). Biohemijske varijable plazme, kalcij (Ca) i fosfor (P) analizirani su pomoću Olympus AU400 hemijskog i toksikološkog analizatora (Beckman Coulter, Kalifornija, SAD). Biohemijske varijable bile su ukupni proteini (PROT), albumin (ALBU), globulin (GLOB), kreatinin (CREA), glukoza (GLUC), holesterol (CHOL), trigliceridi (TRIGL), alkalna fosfataza (ALP), gama-glutamil transpeptidaza ( GGT), aspartat aminotransferazu (AST) i alanin aminotransferazu (ALT). Konačno, nivoi tiroksina (T4) su analizirani pomoću IMMULITE® 1000 imunotest sistema (Siemens).
Statistička analiza
Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Statistička analiza je obavljena sa softverom SPSS verzija 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), a razlike sa < 0.05 smatraju statistički značajnim. Normalnost podataka je procijenjena Shapiro-Wilk testom. Poređenja između različitih grupa tretmana vršena su korištenjem ponovljene mjerene analize varijanse (RM ANOVA) sa Tukeyjevim ili Dunnettovim T3 post hoc testom, ovisno o tome da li su podaci pratili normalnu ili nenormalnu distribuciju, respektivno. Razlike između muškaraca i žena istražene su korištenjem uparenog Studentovog t-testa, ili Wilcoxon signedrank testa kada su podaci bili normalno ili nenormalno raspoređeni, respektivno. Hi-kvadrat linearna diskriminantna analiza effectize (LEfSe) je korištena za otkrivanje diferencijalnih bakterijskih karakteristika između grupa. Pirsonova korelacija je korištena za analizu mogućih asocijacija između varijabli u normalno raspoređenim podacima, dok je Spearmanova korelacija primijenjena u nenormalno raspoređenim podacima. Grafički prikazi podataka su izvedeni korištenjem Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA).
Prirodni biljni lijek za ublažavanje zatvora-Cistanche
Cistanche je rod parazitskih biljaka koji pripada porodici Orobanchaceae. Ove biljke su poznate po svojim lekovitim svojstvima i vekovima se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM). Cistanche vrste se pretežno nalaze u sušnim i pustinjskim regijama Kine, Mongolije i drugih dijelova Centralne Azije. Biljke cistanche karakteriziraju mesnate, žućkaste stabljike i visoko su cijenjene zbog svojih potencijalnih zdravstvenih koristi. U TKM-u se vjeruje da Cistanche ima tonik i da se obično koristi za ishranu bubrega, povećanje vitalnosti i podršku seksualne funkcije. Takođe se koristi za rešavanje problema starenja, umora i opšteg dobrobiti. Iako Cistanche ima dugu istoriju upotrebe u tradicionalnoj medicini, naučna istraživanja o njegovoj efikasnosti i bezbednosti su u toku i ograničena. Međutim, sadrži različite bioaktivne spojeve kao što su feniletanoidni glikozidi, iridoidi, lignani i polisaharidi, koji mogu doprinijeti njegovim ljekovitim učincima.
Wecistanche'scistanche prah, cistanche tablete, cistanche kapsule,i drugi proizvodi se razvijaju koristećipustinjacistanchekao sirovine, a sve to ima dobar učinak na ublažavanje opstipacije. Specifičan mehanizam je sljedeći: Vjeruje se da Cistanche ima potencijalne prednosti za ublažavanje opstipacije na osnovu njegove tradicionalne upotrebe i određenih spojeva koje sadrži. Iako su naučna istraživanja posebno o djelovanju Cistanchea na zatvor ograničena, smatra se da ima više mehanizama koji mogu doprinijeti njegovom potencijalu za ublažavanje opstipacije. Laksativan efekat:Cistanchese dugo koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini kao lijek za zatvor. Vjeruje se da ima blagi laksativni učinak, koji može pomoći u poticanju pražnjenja crijeva i izazvati zatvor. Ovaj efekat se može pripisati različitim jedinjenjima koja se nalaze u Cistancheu, kao što su feniletanoidni glikozidi i polisaharidi. Vlaženje crijeva: Na osnovu tradicionalne upotrebe, smatra se da Cistanche ima hidratantna svojstva, posebno usmjerena na crijeva. Promoviranje hidratacije i podmazivanja crijeva može pomoći u omekšavanju alata i olakšati lakši prolaz, čime se ublažava zatvor. Protuupalni učinak: Zatvor ponekad može biti povezan s upalom u probavnom traktu. Cistanche sadrži određene spojeve, uključujući feniletanoidne glikozide i lignane, za koje se vjeruje da imaju protuupalna svojstva. Smanjenjem upale u crijevima, može pomoći u poboljšanju pravilnosti pražnjenja crijeva i ublažavanju zatvora.
