In vitro evaluacija P-gp-posredovanih interakcija lijek-lijek korištenjem RPTEC/TERT1 modela ljudskih bubrežnih stanica

edmund.chen@wecistanche.com

Uvod In vitro procjena inhibitornog potencijala P-glikoproteina (P-gp) je važno pitanje tokom procesa razvoja lijeka, jer omogućava predviđanje klinički relevantnih interakcija lijek-lijek (DDI) [1–3]. P-gp pripada superfamiliji transportera ATP-vezujućih kaseta (ABC) i kodiran je genom za višestruku rezistenciju na lijekove MDR1 (također poznat kao ABCB1). Poznato je da je ovaj membranski transporter pretjerano eksprimiran u tumorskim stanicama i da uzrokuje otpornost na mnoge lijekove protiv raka [4]. Nalazi se unutar svih fizioloških barijera, uključujući crijeva, jetru ibubrezi, P-gp štiti od ksenobiotika ograničavajući apsorpciju ovih supstrata iz probavnog trakta i olakšavajući njihov efuks u žuč i urin. Dakle, P-gp igra značajnu ulogu u farmakokinetici različitih terapijskih klasa [5-7]. Poznato je da su mnogi lijekovi kao što su agensi protiv raka, antifungici i kardiovaskularni lijekovi P-gp supstrati i/ili inhibitori, a mnogi od njih su uključeni u klinički relevantne interakcije [8-10]. Stoga, Američka agencija za hranu i lijekove (FDA) nalaže da se inhibitorni potencijal P-gp mora procijeniti u ranim fazama razvoja lijeka. In vitro testovi koji se provode u ovu svrhu obično se zasnivaju na studijama transporta lijekova korištenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju P-gp. Preciznije, FDA smjernice preporučuju određivanje in vitro vrijednosti polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) kako bi se procijenio rizik od kliničkih DDI-a koji su rezultat inhibicije P-gp. U tu svrhu provedena su mnoga eksperimentalna ispitivanja, a većina njih se fokusirala na interakcije lijekova koje se odnose na crijevnu apsorpciju koristeći Caco-2 ili MDCK-MDR1 modele [11–13]

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA

Poštobubrežnieliminacija je također uobičajen put eliminacije za različite klase lijekova, aktivna tubularna sekrecija preko ABC transportera također može igrati ključnu ulogu u ovim interakcijama [14]. Međutim, in vitro podaci obubrežniDDI posredovani P-gp-om su ograničeni. Ovo je dijelom zbog nedostatka razvoja i karakterizacije in vitro modela za predviđanjebubrežnitransport droge. Među različitim ljudskim ćelijskim linijama, čini se da model RPTEC/TERT1 obećava za procjenububrežniinterakcije lijekova. Ova ćelijska linija je izvedena od zdravog ljudskog donora i generirana je od ovekovečenih stanica proksimalnih tubula. Štaviše, ekspresija i funkcionalnost P-gp-a su demonstrirani korištenjem ovog modela, čime se potvrđuje njegova sposobnost predviđanjabubrežniefuksi lijekova [15, 16]. U tom kontekstu, ova studija je dizajnirana da istraži inhibitorni potencijal P-gp koristeći RPTEC/TERT1 model. Prvo je izvršen skrining test akumulacije rodamina 123 (R123) da bi se dobio profil inhibicije za svaki testirani lijek. Na osnovu ovog skrininga, četiri lijeka su zatim odabrana za procjenu njihovih koncentracijsko zavisnih efekata na intracelularnu akumulaciju dva lijeka P-gp supstrata: apiksabana i rivaroksabana

Ključne riječi:bubrežna ćelija, bubrežni model, bubrežni lijek, renalna eliminacija, bubrezi.

Materijali i metode

ReagensiApiksaban, [2H71 3C ] - api xa ban, ri va r oxa ban,[13C6]-rivaroksaban, nilotinib, krizotinib, erlotinib, aksitinib, idelalisib, varfarin i dabigatran eteksilat (kupljeni su od Alkirllisa Francuska). Verapamil, ketokonazol, simvastatin, amiodaron, rodamin 123, Hankov balansirani rastvor soli (HBSS) i HEPES rastvor su kupljeni od Sigma–Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Francuska).

Cell Culture  RPTEC/TERT1 ćelije su dobijene iz American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Francuska) i kultivisane u hormonski definisanom mediju bez seruma koji se sastoji od Dulbeccovog modifikovanog Eagle's Medium F12 (ATCC) dopunjenog kompletom faktora rasta (ATCC) i 1 procentna mješavina antibiotika/antimikotika (penicilin-streptomicin, amfotericin B) na 37 stepeni i 5 posto CO 2. Za sve eksperimente, ćelije su zasijane u 96-ploče sa gustinom od 50,000 ćelija po jažici i korišteni su za rast nakon 14 dana kulture. Podloga je obnavljana svaka 2 dana i ćelije su korištene od prolaza 27 do prolaza 34. Caco{14}} ćelije su također kupljene od ATCC-a. Ćelije su održavane u mediju kulture koji se sastojao od Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, SAD) sa dodatkom 10% FBS, 1% neesencijalnih aminokiselina i 1% mješavine antibiotika/antimikotika (penicilin-streptomicin, amfotericin B). ) na 37 stepeni i 5 posto CO2. Caco-2 ćelije su zasijane u 96-ploče sa gustinom od 5 × 10 3 ćelija po jažici i korištene su za rast nakon 14 dana kulture. Ljudske proksimalne tubularne epitelne ćelije (HPTEC) su dobijene od BIOPREDIC-a (Rennes, Francuska) i kultivisane u DMEM/F12 uz dodatak hidrokortizona, EGF, insulina, transferina i natrijum selenita. Ćelije su zasijane u 96-ploče za kulturu obložene kolagenom u gustini od 6600 ćelija po jažici i korištene su za rast nakon 11 dana kulture.

Rhodamine 123 Accumulation Screening Assay  Inhibicijski potencijal P-gp određen je mjerenjem intracelularne akumulacije rodamina 123 u RPTEC/TERT1 stanicama u prisustvu i odsustvu različitih klasa lijekova. Među 14 testiranih lijekova, ciklosporin A (10 µM), ketokonazol (50 µM), verapamil (100 µM) i amiodaron (50 µM) korišteni su kao P-gp inhibitori. Apiksaban, rivaroksaban i dabigatran eteksilat – tri direktna oralna antikoagulansa (DOAC) – korišteni su kao P-gp supstrati (10 µM). Varfarin (50 µM) je korišten kao neinhibitor, a pet lijekova protiv raka uključujući nilotinib, krizotinib, erlotinib i idelalisib korišteno je bez poznavanja njihovog profila inhibicije u koncentraciji od 10 µM. Nekoliko stanja je reprodukovano sa Caco{14}} ćelijama, koje je FDA odobrila za studije transporta lijekova. Na ovaj način utvrđeno je intracelularno zadržavanje rodamina 123 u Caco{16}} ćelijama u prisustvu i odsustvu verapamila (100 µM), ciklosporina A (10 µM), nilotiniba (10 µM) i DOAC-a (10 µM). ). Ukratko, nakon 14 dana kulture u 96-pločama, ćelije su prethodno inkubirane 10 minuta na 37 stepeni sa svakim lijekom otopljenim u HBSS sa 10 mM HEPES (v/v). Zatim su ćelije inkubirane sa 10 µM rodamina 123 tokom 45 minuta na 37 stepeni. Konačno, nakon tri ispiranja u hladnom rastvoru HBSS/HEPES, ćelije su lizirane na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta u rastvoru natrijum dodecil sulfata (SDS) koji sadrži 1 procenat natrijum borata. Količina intracelularnog rodamina 123 je kvantifikovana pomoću Infnite M nanospektrofluorometra (Life Sciences, TECAN, Švajcarska), postavljajući talasne dužine na 485/535 nm. Podaci su izraženi kao procenti akumulacije rodamina 123 u kontrolnim ćelijama koje nisu bile izložene nijednom potencijalnom inhibitoru P-gp i proizvoljno postavljene na 100 posto akumulacije.

DOAC test intracelularne akumulacije i određivanje IC50 Iz prethodnog testa skrininga za rodamin 123, četiri lijeka su odabrana za ispitivanje njihovih koncentracijsko zavisnih efekata na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana (10 µM) u RPTEC/TERT1 ćelijama. Ketokonazol, krizotinib i nilotinib odabrani su kao P-gp inhibitori, a varfarin kao neinhibitor. Ciklosporin A (10 µM) je korišten kao inhibitor transportera širokog spektra. Studije interakcija između DOAC-a i nilotiniba za određivanje vrijednosti IC50 reproducirane su u Caco-2 ćelijama kako bi se uporedila dva ćelijska modela. Sva jedinjenja su razblažena ili sama ili sa povezanim inhibitorom u HBSS transportnom puferu sa dodatkom 1 posto HEPES (v/v) i 1 posto DMSO (v/v). Pre inkubacije, svi rastvori su prethodno zagrejani na 37 stepeni i pH je podešen na 7,4. Za lijekove protiv raka krizotinib i nilotinib, zbog njihove slabe rastvorljivosti i citotoksičnog potencijala, koncentracije su se kretale od 0,1 do 25 µM. Za ketokonazol i varfarin, koncentracije su se kretale od 0,1 do 100 µM. Ukratko, nakon 14 dana kulture, svi lijekovi rastvoreni u HBSS sa 1 posto HEPES-a (v/v) su prethodno inkubirani 10 minuta na 37 stepeni. Zatim su ćelije inkubirane sa 10 µM apiksabana ili rivaroksabana 60 minuta na 37 stepeni. Konačno, nakon tri ispiranja u hladnom rastvoru HBSS/HEPES, ćelije su lizirane na sobnoj temperaturi tokom 45 minuta u 0,2 procentnom rastvoru Tritona X-100. Količina intracelularnog DOAC-a je zatim kvantifikovana tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS). Podaci su izraženi kao procentualno povećanje DOAC akumulacije, a DOAC intracelularna akumulacija je proizvoljno postavljena na 100 posto u kontrolnim ćelijama. Vrijednosti IC50 za inhibiciju aktivnosti P-gp, koje odgovaraju vrijednostima polumaksimalne efektivne koncentracije (EC50) za povećanje DOAC akumulacije, određene su iz neponderiranog nelinearnog regresijskog modeliranja povećane akumulacije s funkcijom 'nls()' u R softver, prema sljedećoj jednadžbi (jednad. 1):

Tečna hromatografija – analiza masenom spektrometrijomKvantifikacija apiksabana (m/z 460.19793) i rivaroksabana (m/z 436.07285) izvedena je korištenjem Ultimate U300{{18 }} Sistem tečne hromatografije (Dionex, Sunnyvale, Kalifornija, SAD) u kombinaciji sa Q-Exactive Plus masenim spektrometrom (ThermoFisher, Bremen, Nemačka). LC separacije su postignute korištenjem analitičke kolone Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) i protoka od 0,6 mL/min . Mobilna faza A je bila voda sa 0,1 posto mravlje kiseline (FA), a mobilna faza B je acetonitril sa 0,1 posto FA. Za rivaroksaban, gradijent je bio: 0–0.3 min, 10 posto B; 0,3–1 min, linearno od 10% do 70% B; 1–1,5 min, 70 posto B; 1,51 min, vratite se na početne uslove do 3 min. Za apiksaban, gradijent je bio: 0–0,3 min, 10 posto B; 0,3–0,7 min, linearno od 10 do 90 posto B; 0,7–1,5, 90 posto B; 1,51 min, vratite se na početne uslove do 3 min. Detekcija je izvršena u elektrosprej-pozitivnom praćenju paralelnih reakcija (PRM) u rezoluciji od 35,000 (na m/z 200). Interni standardi (IS) su bili [13C,2H7]-apiksaban (m/z 468,2452) za apiksaban i [13C6]-rivaroksaban (m/z 442,09297) za rivaroksaban. Za svaki lijek i njegov odgovarajući IS, praćeni su ciljni ion (za kvantifikaciju) i potvrđujući ion. Za rivaroksaban i njegov IS, ciljni jon je bio m/z 144,95125, a konfromantni joni su bili m/z 231,11280 i m/z 237,13298, respektivno. Za apiksaban i njegov IS, ciljni jon je bio m/z 199,08656, a konfrmirani joni su bili m/z 282,12387 i m/z 241,06062, respektivno.

Rezultati

Rhodamine 123 Accumulation Screening AssaySkrining test akumulacije rodamina 123 je izveden u RPTEC/TERT1 ćelijama sa 14 lekova sa različitim profilima inhibicije (slika 1). Kao što se i očekivalo, intracelularna akumulacija rodamina 123 u prisustvu ciklosporina A, inhibitora širokog spektra, bila je među najvišima, sa povećanjem akumulacije od 75 posto u odnosu na kontrolne ćelije. Prisustvo verapamila, specifičnog inhibitora P-gp-a, dovelo je do povećanja akumulacije rodamina 123 od 57 posto, što pokazuje učešće P-gp-a. Na isti način, ketokonazol, opisan kao jak P-gp inhibitor, doveo je do većeg povećanja (66 posto) u intracelularnoj akumulaciji rodamina 123 u poređenju s verapamilom, potvrđujući njegov profil inhibicije. Suprotno tome, dodavanje amiodarona, okarakteriziranog kao umjereni inhibitor P-gp, izazvalo je povećanje akumulacije od 59 posto, što je slično onom uzrokovanom verapamilom. Uočeni su različiti profili inhibicije za agense protiv raka nilotinib, aksitinib, krizotinib, erlotinib i idelalisib. Dodavanje nilotiniba izazvalo je snažno povećanje akumulacije rodamina 123 (71 posto), što ukazuje na značajan inhibitorni potencijal, a zatim aksitiniba, koji je uzrokovao povećanje zadržavanja od 57 posto. S druge strane, krizotinib i erlotinib su pokazali umjerene do niske inhibitorne potencijale, uz povećanje akumulacije rodamina 123 od 23 posto, odnosno 16 posto. Idelalisib nije uticao na akumulaciju rodamina 123; isto je bilo i sa varfarinom, koji je bio

izabran kao neinhibitor. Među tri DOAC-a, apiksaban i rivaroksaban izazvali su blago povećanje u zadržavanju rodamina 123: 33 posto i 12 posto, respektivno. Zanimljivo je da je dabigatran eteksilat, prolijek dabigatrana i poznati supstrat P-gp, izazvao povećanje zadržavanja rodamina 123 za oko 50 posto, iako nije opisan kao potencijalni inhibitor P-gp. Konačno, dodavanje simvastatina izazvalo je samo neznatno povećanje akumulacije fluorescentnog supstrata (32 posto). Na osnovu ovog skrininga, četiri lijeka su odabrana kako bi se procijenili njihovi koncentracijski zavisni efekti na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana u okviru RPTEC/TERT1 modela. Ketokonazol je izabran kao uslov pozitivne kontrole za inhibiciju P-gp, a varfarin je odabran kao neinhibitor P-gp za stanje negativne kontrole. Nilotinib i krizotinib su odabrani kao jaki i umjereni inhibitori P-gp, respektivno. Nekoliko uslova je reproducirano sa referentnim modelom, Caco{15}}. Intracelularna akumulacija R123 u ćelijama određena je nakon kombinacije (ili ne) sa apiksabanom i rivaroksabanom (10 µM), nilotinibom (10 µM) i sa ciklosporinom A (10 µM) i verapamilom (100 µM) za kontrolne uslove za inhibiciju. (Sl. 2A). Kao što se očekivalo, verapamil i ciklosporin A izazvali su visoka povećanja u zadržavanju R123 od 297 posto, odnosno 275 posto. Na isti način, nilotinib je izazvao visoko povećanje intracelularne akumulacije R123 (229 posto), potvrđujući njegov inhibitorni potencijal. Kombinacija R123 sa DOAC-ima rezultirala je manjim povećanjem akumulacije R123 (40-44 posto) u poređenju s drugim lijekovima. Štaviše, intracelularna akumulacija rodamina 123 u odsustvu i prisustvu ciklosporina A ububrežniPrimarne ljudske ćelije su takođe istražene u ovoj studiji kako bi se proverila pouzdanost rezultata dobijenih sa RPTEC/TERT1 ćelijama (slika 2B). Ove analize su pokazale da je prisustvo ciklosporina A povećalo zadržavanje R123 za 71 posto. Ova vrijednost je bila bliska onoj dobijenoj pod istim uslovima sa RPTEC/TERT1 ćelijama (povećanje od 75 procenata sa ciklosporinom A). Stoga je aktivnost P-glikoproteina bila slična u RPTEC/TERT1 modelu i primarnim ljudskim ćelijama.

Test unutarćelijske akumulacije DOAC: Određivanje omjera IC50 i I1/IC50 Provedene su studije intracelularne akumulacije kako bi se procijenio P-gp posredovan transport apiksabana i rivaroksabana pri konstantnoj koncentraciji od 10 µM u RPTEC/TERT1 stanicama in vitro i u prisustvu rastućih koncentracija nilotiniba, krizotiniba, ketokonazola i varfarin (slike 2, 3). Modeliranje povećane retencije apiksabana i rivaroksabana je procijenjeno da bi se odredile vrijednosti IC50. Kombinacija DOAC-a sa nilotinibom dovela je do najnižih vrijednosti IC50: 0,85 µM i 1,37 µM za rivaroksaban i apiksaban, respektivno (slike 4, 5). Kombinacija sa krizotinibom dala je IC50 vrijednosti od 10,1 µM i 12,2 µM za rivaroksaban i apiksaban, respektivno. Iznenađujuće, kombinacija DOAC-a sa keto konazolom nije proizvela najniže vrijednosti IC50 (16,5 µM i 16,9 µM za rivaroksaban i apiksaban, respektivno). Konačno, očekivano, kombinacija sa varfarinom, što je i bilo

izabran kao neinhibitor, nije uticao na intracelularno zadržavanje dva DOAC-a. Intracelularna akumulacija i apiksabana i rivaroksabana unutar Caco-2 ćelija u prisustvu rastućih koncentracija nilotiniba je stoga ispitana radi poređenja sa ćelijskim modelima. Zanimljivo, kao što je uočeno sa RPTEC/TERT1 modelom, vrijednost IC50 za rivaroksaban (4,16 µM) bila je niža od one dobijene za apiksaban (9,35 µM). Također je zanimljivo primijetiti da su vrijednosti IC50 uočene u Caco-2 ćelijama bile veće od onih dobijenih u RPTEC/TERT1 ćelijama za isti inhibitor. Klinički značaj DDI može se predvidjeti iz in vitro podataka. Prema smjernicama FDA, omjeri [I1]/IC50 su izračunati za svaku kombinaciju lijekova. Ovaj odnos omogućava da se koncentracije in vivo uporede sa onima za koje se zna da proizvode relevantan efekat in vitro. Za apiksaban u RPTEC/TERT1 ćelijama, odnosi su bili 3,1, 0,06 i 17,4 sa nilotinibom, krizotinibom i ketokonazolom (Tabela 1). U Caco-2 ćelijama, odnos [I1]/IC50 bio je 0,46 za interakciju između apiksabana i nilotiniba (Tabela 1). Za rivaroksaban, odnosi su bili nešto veći od onih dobijenih za apiksaban u RPTEC/TERT1 ćelijama: 5,1, 0,08 i 17,7, respektivno, za nilotinib, krizotinib i ketokonazol (Tabela 2). Na isti način, odnos [I1]/IC50 uočen za interakciju između rivaroksabana i nilotiniba u Caco-2 ćelijama bio je 1,03, što je više od onog dobijenog za apiksaban (Tabela 2).

Diskusija

Brojne studije sprovedene poslednjih decenija su prijavile značajnu ulogu P-gp u farmakokinetici lekova [17–19]. S obzirom na sve veći regulatorni interes za interakcije lijekova posredovane P-gp, in vitro testovi za ispitivanje inhibitornog potencijala lijekova su važan aspekt razvoja lijekova i kliničke prakse. U tu svrhu, provedeni su mnogi in vitro testovi, a većina povezanih podataka o predviđenoj crijevnoj apsorpciji generirana je iz ćelijskih linija Caco-2 i MDCK-MDR1 [20–22]. Međutim, malo je podataka dostupno o aktivnoj tubularnoj sekreciji lijekova, koja također igra ključnu ulogu u dispoziciji lijekova i ovisi o prisutnosti ABC transportera. Ovo zapažanje je jasno povezano s nedostatkom okarakteriziranihbubrežnićelijske linije za predviđanje lijekabubrežniefux. Ovaj cilj zahtijeva in vitrobubrežnimodel koji blisko oponaša fiziološku barijeru. Ljudska ćelijska linija RPTEC/TERT1, koja eksprimira nekoliko ABC transportera (posebno P-gp), čini se da je dobra alternativa, kao što je pokazano u prethodnoj studiji [16]. U ovom kontekstu, ovaj rad je istraživao primjenu RPTEC/TERT1 modela za procjenu inhibitornog potencijala P-gp. Koliko nam je poznato, ovaj rad je prvi koji pruža podatke iz studija inhibicije P-gp pomoću ljudskihbubrežnićelije.

In vitro testovi za određivanje inhibitornog potencijala P-gp se obično zasnivaju na upotrebi specifičnog referentnog P-gp supstrata, kao što je digoksin ili rodamin 123 [23-25]. Zbog svoje lakoće upotrebe, fluorescentne sonde su pogodne za analize visoke propusnosti. Štaviše, rodamin 123 je široko primenjen za detekciju aktivnosti P-gp u širokom spektru studija [26-28]. Na ovaj način, u ovoj studiji su izvedeni testovi akumulacije rodamina 123 u RPTEC/TERT1 ćelijama da bi se identifikovali profili inhibicije 14 lekova. Među ovim lijekovima, ciklosporin A, ketokonazol i verapamil odabrani su kao jaki inhibitori P-gp. Ovi inhibitori su opsežno okarakterisani zbog njihovog značajnog inhibitornog potencijala P-gp, što dovodi do modulacije transporta i digoksina i rodamina 123 [27, 29, 30]. Kao što se i očekivalo, ovi lijekovi su izazvali najveće zadržavanje rodamina 123 u RPTEC/TERT1 stanicama. Nasuprot tome, nije uočeno povećanje zadržavanja R123 kod varfarina, koji je korišten kao negativna kontrola, što potvrđuje pouzdanost RPTEC/TERT1 modela. Zanimljivo je da su među svim testiranim lijekovima DOAC – uključujući dabigatran eteksilat, apiksaban i rivaroksaban – izazvali izrazito povećanje u zadržavanju R123, iako ranije nisu bili okarakterisani kao inhibitori, već samo kao supstrati P-gp [31, 32]. Ovo zapažanje može biti posljedica postojanja takozvane "kompetitivne" inhibicije, gdje lijekovi mogu stupiti u interakciju sa istim mjestima vezivanja na P-gp. Najdobro karakterizirana mjesta za P-gp su H mjesto (za vezivanje Hoechsta 33342) i R mjesto (za vezivanje rodamina 123). Međutim, više drugih nepoznatih mjesta vezivanja lijeka moglo bi igrati ulogu u ovim interakcijama, što bi moglo objasniti različite efekte DOAC-a na akumulaciju R123 [33, 34]. Inhibicija P-gp uočena za dati lijek stoga ovisi o supstratu koji se koristi tokom in vitro studija [28, 35]. Upotreba različitih supstrata P-gp koji stupaju u interakciju s različitim mjestima vezivanja lijeka treba stoga uzeti u obzir da bi se precizno opisala navodna inhibitorna moć lijekova na P-gp. Također je zanimljivo primijetiti da je nekoliko uslova iz skrininga na rodaminu 123 također obavljeno u Caco{44}} ćelijama kako bi se uporedile ćelije RPTEC/TERT1 sa referentnim modelom u studijama transporta lijekova. Kao što se očekivalo, ciklosporin A, verapamil i nilotinib izazvali su najveće povećanje u zadržavanju rodamina. Isti profili inhibicije su uočeni i sa Caco-2 i RPTEC/TERT1 ćelijama. Međutim, povećanja u zadržavanju rodamina 123 izazvana interakcijama u Caco{49}} modelu bila su veća od onih uočenih u RPTEC/TERT1 ćelijama, što ukazuje na potencijalnu razliku u ekspresiji P-glikoproteina između modela. Stoga, u sadašnjem U studiji je korištena druga metoda za procjenu i potvrdu potencijalne inhibicije P-gp lijekovima.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREZNU DIJALIZU

Na osnovu testa akumulacije rodamina 123, izabrana su četiri lijeka da bi se odredili njihovi koncentracijski zavisni efekti na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana. Pokazalo se da P-gp igra glavnu ulogu u efuksu apiksabana i rivaroksabana [32, 36]. Stoga su procijenjene vrijednosti IC50 nilotiniba, krizotiniba i ketokonazola, pri čemu su DOAC odabrani kao lijekovi za "žrtvu". Koliko nam je poznato, ova studija je prva koja je izvela studije unutarćelijske akumulacije s DOAC-ima kod ljudibubrežnićelije. Vrijednosti IC50 dobivene za nilotinib i krizotinib bile su u skladu sa njihovim profilima inhibicije dobivenim testom akumulacije rodamina 123. Nilotinib, koji je izazvao snažno povećanje zadržavanja R123, pokazao je najnižu vrijednost IC50 za dva DOAC-a, potvrđujući njegov visok potencijal inhibicije. Ovaj rezultat je također u skladu s prethodnom studijom koja je pokazala povećanje intracelularne akumulacije [3 H]-paklitaksela u MDR1-transficiranim stanicama ovisno o koncentraciji, što sugerira da ima inhibitorni profil [37]. Za krizotinib, R123 test je pokazao umjeren inhibitorni potencijal, s manjim povećanjem zadržavanja R123 od onog uzrokovanog nilotinibom. Ovo zapažanje je podržano prethodnom studijom u kojoj je krizotinib povećao intracelularnu akumulaciju R123 i doksorubicina u MDR1-transficiranim ćelijama [38]. Ovaj rezultat je takođe u skladu sa vrednostima IC50 određenim sa DOAC, koje su bile veće od odgovarajućih vrednosti za nilotinib, potvrđujući njegov umereni profil inhibicije. Međutim, zanimljivo je primijetiti da koncentracija od 10 µM nilotiniba ili krizotiniba nije izazvala isto povećanje u zadržavanju rodamina 123 i DOAC-a. U skriningu na rodamin, nilotinib je povećao zadržavanje supstrata za oko 71 posto, dok je za DOAC bio oko 40 posto. Nasuprot tome, krizotinib je izazvao malo povećanje u zadržavanju rodamina (23 posto), ali veće povećanje u zadržavanju DOAC-a (oko 50 posto) pri istoj koncentraciji. Kao što je ranije diskutovano, ovo zapažanje bi se moglo objasniti razlikama u mjestima vezivanja na P-gp. Poznato je da mnogi lijekovi stupaju u interakciju i nadmeću se sa H vezujućim mjestom, a ne sa R ​​vezujućim mjestom (koje se vezuje rodamin 123), i obrnuto [39]. Zanimljivo je da je ketokonazol, za koji se zna da je jak P-gp inhibitor, izazvao nešto manje povećanje u zadržavanju rodamina 123 nego nilotinib (66 posto naspram 71 posto, respektivno). Ipak, slična vrijednost je uočena i sa Caco-2 ćelijama, gdje je prisustvo ketokonazola izazvalo povećanje akumulacije R123 za 60% [40]. Intracelularna akumulacija DOAC-a za određivanje vrednosti IC50 takođe je pokazala veće vrednosti u poređenju sa nilotinibom i krizotinibom. Zanimljivo je da je većina IC50 vrijednosti pronađenih u LLC-PK1 ili Caco{36}} modelima koji koriste digoksin kao P-gp supstrat bila između 3 i 4 µM za ketokonazol [41, 42]. Ove vrijednosti su prilično različite od onih koje su pronađene u ovoj studiji (16,5 µM i 16,9 µM sa apiksabanom i rivaroksabanom, respektivno). Ovo zapažanje potvrđuje da su izbori supstrata i korišćenog modela presudni uticaj pri određivanju inhibitornog potencijala P-gp. Pored toga, nedavna studija je objavila da nivoi ekspresije ABC transportera u in-vitro ćelijskim modelima imaju uticaj na testove transporta leka i stoga na procenu DDI-a koji se odnose na P-gp [43]. Zaista, određivanje IC50 vrijednosti za verapamil korištenjem rivaroksabana kao P-gp supstrata otkrilo je heterogenost između MDCKMDR1 i Caco{53}} modela ćelija, sa vrijednostima IC50 od 6,94 µM odnosno 21,2 µM [43]. Nadalje, u ovoj studiji u Caco{61}} ćelijama istražen je i koncentracijski ovisan efekat nilotiniba na intracelularnu akumulaciju apiksabana i rivaroksabana. Zanimljivo je da su vrijednosti IC50 za nilotinib bile značajno veće u Caco-2 ćelijama nego u RPTEC/TERT1 ćelijama. Ovo zapažanje se može objasniti razlikom u ekspresiji P-gp između ovih modela. Osim toga, poznato je da distribucija P-gp zavisi od tkiva koje se razmatra. Fallon et al. pokazao da je nivo P-gp viši ububregnego u tkivu jetre kod ljudi [45]. S druge strane, čini se da je nivo ekspresije P-gp viši u crijevima nego u crijevimabubregtkiva [46]. Upotreba ljudskih ćelija kao što je RPTEC/TERT1 model, koje ne eksprimiraju prekomjerno transportere, mogla bi stoga pružiti dodatne podatke. Ovi podaci se mogu koristiti i imputirati u fiziološki zasnovanom farmakokinetičkom modeliranju (PBPK) integracijom nekoliko parametara, kao što je količina P-gp u tkivu ili in vitro modelu ili IC50 vrijednosti.

Iako su vrijednosti IC50 pronađene za ketokonazol u modelu RPTEC/TERT1 bile veće od onih uočenih u literaturi, omjer [I1]/IC50 – potvrđen kao prediktor potencijalnih klinički relevantnih DDI za oralno primijenjene lijekove – pokazao je visoke vrijednosti koje su bile iznad praga od 0,1 koji je definirala FDA. Ovaj rezultat je u skladu s kliničkom studijom koja je pokazala dvostruko povećanje izloženosti apiksabanu uz istovremenu primjenu ketokonazola [44]. Uzeti zajedno, svi ovi rezultati pokazuju da je RPTEC/TERT1 model obećavajući alat za procjenu inhibitornog potencijala P-gp.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOL U BUBREZIMA/BUBREZIMA

Zaključak

Naša studija je pokazala da je primjena RPTEC/TERT1 modela pogodna za procjenu inhibitornih potencijala P-gp različitih klasa lijekova. Analiza akumulacije rodamina 123 omogućila je da se izvrši početni skrining na lijekove. Međutim, P-gp inhibitorni potencijali lijekova koji ne stupaju u interakciju s R mjestom P-gp također se moraju istražiti korištenjem dodatnih supstrata kako bi se potvrdila predviđanja. Vrijednosti IC50 određene iz intracelularne akumulacije apiksabana i rivaroksabana su u skladu sa profilima inhibicije uočenim sa rodaminom 123. Štaviše, upotreba ketokonazola i varfarina kao jakog inhibitora i neinhibitora P-gp, respektivno, potvrdila je pouzdanost modela RPTEC/TER1 kada se koristi za dobijanje in vitro podataka o inhibitornim potencijalima lekova prema P-gp. Konačno, poređenje rezultata dobijenih korištenjem RPTEC/TERT1 modela sa onima dobijenim korištenjem Caco-2 ćelija je naglasilo važnost provođenja in vitro studija na različitim ćelijskim modelima kako bi se potvrdio inhibitorni profil za dati lijek.