Imunostimulativna aktivnost polisaharida iz vode ekstrahiranih iz Cistanche Deserticola kao biljnog adjuvansa in vitro

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Ključna laboratorija za biološke resurse i genetičko inženjerstvo Xinjianga, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang, Kina,

2 Ključna laboratorija medicinske molekularne virusologije, Fakultet osnovnih medicinskih nauka, Šangajski medicinski fakultet, Univerzitet Fudan, Šangaj, Kina,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, Kina

Abstract

Bezbedan i efikasan adjuvans vakcine važan je u modernim vakcinama. Razni kineskibiljnih polisaharidamože aktivirati imuni sistem.Cistanche deserticola(CD) je tradicionalna kineska biljka i pomoćni kandidat. Evo, to smo i potvrdilipolisaharidi koji se ekstrahiraju vodomCD-a (WPCD) bi mogao modulirati imunološki odgovor in vitro i in vivo. Na način ovisan o dozi, WPCD je značajno promovirao sazrijevanje i funkciju dendritskih ćelija dobivenih iz mišje srži (BM-DC) kroz povećanje nivoa ekspresije MHC-a -II, CD86, CD80 i CD40, alogenska proliferacija T ćelija i prinosi IL-12 i TNF- preko toll-like receptor4 (TLR4), kao što su pokazali in vitro eksperimenti. Osim toga, njegova imunomodulatorna aktivnost je također uočena kod miševa. WPCD je efikasno poboljšao titre IgG, IgG1 i IgG2a i značajno povećao proliferaciju T i B ćelija, proizvodnju IFN- i IL-4 u CD4 plus T ćelijama i nivo ekspresije IFN- u CD8 plus T ćelije bolje od stipse. Nadalje, WPCD bi mogao značajno povećati nivoe ekspresije CD40 i CD80 na DC u slezeni i smanjiti Treg frekvenciju. Studija sugerira da su polisaharidi Cistanche deserticola siguran i efikasan adjuvans vakcine za izazivanje humoralnog imuniteta i ćelijskog imuniteta aktiviranjem DC-a putem TLR4 signalnog puta.

Click to Cistanche proizvodi od stabljike

Uvod

Vakcine su važne za kontrolu ili prevenciju bolesti. Novogenerisane vakcine koje se trenutno razvijaju su visoko pročišćene rekombinantneantigenisa većom sigurnošću, ali pročišćeni antigeni ne mogu stimulirati zadovoljavajućeimuni odgovoru poređenju sa atenuiranim ili inaktiviranim preparatima patogena. Uz pomoć adjuvansa, vakcine mogu izazvati perzistencijuimune reakcije[1,2]. Novi moćni adjuvansi su naširoko zabrinuti i za razvoj vakcine i za zdravlje ljudi. Do danas, različiti adjuvansi su identificirani i opsežno proučavani. Ovi adjuvansi daju vakcinama nekoliko prednosti, uključujući smanjenje potrebne količine antigena, minimiziranje broja imunizacija potrebnih za normalan imunološki odgovor i izazivanje brže, šire i jačeimune reakcije[3–5]. Iako su razvijeni mnogi moćni adjuvansi, kao što su lipopolisaharid (LPS) i Freundov kompletni adjuvans (FCA), oni nisu široko primijenjeni zbog svoje toksičnosti. Stoga je samo nekoliko adjuvansa, kao što je Alum, licencirano za kliničku upotrebu [6]. Sve u svemu, trebalo bi razviti efikasnije i sigurnije adjuvanse za promoviranje boljih profilaktičkih i terapijskih vakcina protiv zaraznih i neinfektivnih bolesti.

Sigurnost je važan faktor u razvoju adjuvansa. Kineski zeljasti sastojci uključuju hranjive tvari i važne aktivne kompozite, kao što su fenolni spojevi i polisaharidi, koji mogu djelovati kao snažni imunostimulansi [7-9]. Među njima, polisaharidi iz tradicionalnog kineskog bilja su široko istraženi zbog svojih imunostimulacijskih aktivnosti i niske toksičnosti. Na primjer, inulin je imunološki adjuvans bez toksičnosti drugih adjuvansa kao što je FCA. AdvaxTM delta inulin adjuvans je također uspješno poboljšao imunogenost vakcina [10,11]. Astragalus, također poznat kao Huangqi na kineskom i Radix Astragali na latinskom, široko je rasprostranjen širom svijeta. Polisaharid je jedan od njegovih glavnih aktivnih sastojaka odgovoran za imunomodulatorno djelovanje. Eksperimentalne studije su pokazale da polisaharid Astragalus ima jake imunomodulatorne efekte i in vitro i in vivo [12, 13]. Lycium barbarum polisaharidi kao adjuvansi vakcine također su pokazali dobra poboljšanja i stimulativne efekte [14, 15]. Ove studije sugerirale su da su kineski biljni polisaharidi idealni kandidati za razvoj adjuvansa.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, "Rou Cong Rong" na kineskom) je vrijedna tradicionalna kineska biljka i obično se smatra "pustinjskim ginsengom" zbog svojih vrhunskih toničkih efekata. Rasprostranjen je u sušnim ili polusušnim regijama u Xinjiangu. U Kini se njegova osušena mesnata stabljika koristila kao tonik hrana stotinama godina [16, 17]. Dugi niz godina, kuhani CD se koristio kao tonik za liječenje oštećenja uzrokovanih prenaprezanjem, što sugerira da je siguran za oralnu primjenu. Ova biljka je naširoko zabrinuta zbog svojih širokih ljekovitih funkcija. Nedavne fitokemijske i farmakološke studije pokazale su da su polisaharidi glavne biološki aktivne komponente i da imaju različite biološke efekte, uključujući imunomodulatorno djelovanje, antioksidativno djelovanje i protuupalno djelovanje [18-21]. Međutim, rijetko je prijavljivana aktivnost jačanja imuniteta polisaharida koji se ekstrahiraju vodom iz C. deserticola u Xinjiangu.

Dobro je poznato da su DC važne ćelije koje predstavljaju antigen (APC) koje daju signale potrebne za iniciranje imunoloških odgovora i modulaciju urođenih i adaptivnih ćelija. Neki adjuvansi koji poboljšavaju unos antigena od strane DC-a mogu povećati kostimulativne ili MHC molekule i poboljšati imunitet. Kada počne sazrevanje DC, proizvodi se više kostimulativnih molekula i citokina i DC pokazuju različite fenotipove [22, 23].

U ovoj studiji, prvo smo iskoristili da li WPCD može promovirati aktivaciju DC-a putem signalnog puta TLR4 in vivo. Budući da su DC bili veza između urođenog i adaptivnog imunološkog odgovora, pretpostavili smo da bi aktivacija DC-a stimulirana WPCD-om utjecala na ishod adaptivnog imuniteta. Ispitivali smo specifični imuni odgovor na ovalbumin (OVA) kod miševa tretiranih WPCD, uključujući titre IgG, IgG1 i IgG2a podklase, T- i B- proliferaciju i proizvodnju citokina. Istraživali smo da li tretman WPCD povećava aktivnost DC i Treg ćelija u slezeni ovih miševa. Naši nalazi su dokazali potencijalnu imunomodulatornu aktivnost prirodnih polisaharida iz C. deserticola i proširili opseg njegove primjene

materijali i metode

Životinje

Ženke miševa C57BL/6, BALB/c ili ICR stare osam do deset sedmica kupljene su od prve bolnice Medicinskog univerziteta Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Kina). Miševi su smješteni u uvjetima bez patogena u skladu sa smjernicama Komiteta za njegu i korištenje životinja (ACUC) Univerziteta Xinjiang za zdravlje i dobrobit životinja. Procedure eksperimenata na životinjama odobrene su od strane AUCC Univerziteta Xinjiang.

Ekstrakcija vodenih ekstrakata

C. deserticola je biljka u provinciji Xinjiang u Kini. Sirovi polisaharid je dobijen ekstrakcijom vode i taloženjem etanolom. Ukratko, 100 g osušene C. deserticola je samljeveno u prah, a zatim filtrirano. Prašak je refluksovan sa petroleterom na sobnoj temperaturi više puta, a zatim refluksovan sa bezvodnim etanolom 1 h da bi se uklonili obojeni sastojci i lipidi. Ostaci su ekstrahovani kipućom vodom tri puta i ekstrakti su spojeni, centrifugirani na 4000 rpm tokom 10 minuta, i refluksovani na 60˚C tokom 4 h. Četiri puta zapremine 95 posto etanola su dodane u otopinu da bi se istaložili sirovi polisaharidi. Sirovi polisaharidi su ponovo rastvoreni u destilovanoj vodi i tretirani Savage reagensom da bi se uklonili proteini. Ekstrakti su otopljeni u PBS-u i sterilizirani kroz 0.22- μm filter. Konačno, ukupan sadržaj šećera u WPCD iznosio je 59,58 posto, kao što pokazuje analiza fenol-sumporna kiselina [24].

Generacija DC-ova

BM-DC su generirani prema prethodno opisanoj metodi uz neznatne modifikacije [25]. DC-ovi koštane srži C57BL/6 miševa su isprani RPMI-1640 kompletnim medijumom (Gibco) sa dodatkom 10 posto fetalnog telećeg seruma (Hyclone). Sakupljene ćelije su ponovo suspendovane u medijumu RPMI-1640 sa 50 μM -merkaptoetanola (Sigma, St Louis, MO) i 20 ng/mL mišjeg GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) i inkubirane na 37˚ C u atmosferi od 5 posto CO2. Polovina podloge za kulturu je zamijenjena svježom podlogom koja je sadržavala GM-CSF svaka 1-2 dana. Ćelije su sakupljene 6. dana, tretirane različitim dozama WPCD, LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) tokom 24 h, a zatim procijenjene protočnom citometrijom.

Detekcija sazrevanja DC i aktivacije T ćelija in vitro

In vitro efekat sazrevanja WPCD na BM-DC je procenjen na osnovu rezultata fenotipske analize FAC-a. Dana 7, BM–DCs iz C57BL/6 su inducirani u prisustvu GM-CSF i zatim tretirani različitim koncentracijama WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0.05, 0,1 i 0,2 mg/mL) tokom 12 h u tri primjerka. LPS (100 ng/mL) je korišten kao pozitivna kontrola. Nakon što su BM-DC isprani u PBS-u i korišten je Fc Block (BD Biosciences, CA) za sprječavanje nespecifičnog vezivanja antitijela, ćelije su obojene u PBS korištenjem odgovarajućeg FITC-, PE- ili APC-konjugiranog CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 i MHC-II antitela (BD) tokom 20 minuta na 37˚C. Obojene ćelije su otkrivene pomoću FAC Calibura (BD). Analiza podataka obavljena je softverom FlowJo (Tree Star).

U eksperimentu sazrevanja DCS in vitro, supernatanti ćelijske kulture su takođe sakupljeni za analizu IL-12 i TNF- pomoću kompleta za analizu citokina (Boster, Wuhan, Kina) prema uputstvima proizvođača. Apsorbancija na 450 nm je izmjerena pomoću ELISA čitača ploča (Bio-Rad, SAD). Količine citokina u uzorcima izračunate su standardnim krivuljama rekombinantnih citokina prema linearnoj metodi regresije.

Da bi se ispitala njihova alogena stimulativna aktivnost, izveden je eksperiment miješane limfocitne reakcije (MLR) prema prethodnoj metodi [26] MTT (Sigma, St Louis, MO) testom. Ukratko, BM-DCs iz C57BL/6 miševa koji su korišteni kao stimulatorne ćelije su pronađeni 7. dana u RPMI-1640 mediju plus GM-CSF i tretirani različitim koncentracijama WPCD tokom 12 h na 37˚C. Ćelije su isprane i ponovo suspendovane u RPMI-1640 mediju prije postavljanja u ploču 24-jažice. Suspenzija singleplenocita kao ćelije odgovora izolovana je od BALB/c miševa. BM-DC su pomiješani sa splenocitima u omjeru 1:5 i 1:10. Ćelije su kultivisane na 37˚C u atmosferi od 5% CO2 tri dana u tri primerka. LPS tretman je korišten kao pozitivna kontrola. Kulture su naknadno dodane sa 20 μL MTT-a za konačnu 4-h kultivaciju. Za analizu proliferacije T ćelija izmjerene su apsorbancije na mjernoj talasnoj dužini (490 nm) i referentnoj talasnoj dužini (650 nm). Svi uzorci su mjereni u odnosu na pozadinu kontrole.

Tretman inhibitorom TLR4 in vitro

BM-DC su prethodno tretirani sa 5 μM TAK-242 (inhibitor TLR4, Medchemexpress Inc.USA) tokom 1 h, a zatim su kultivisani sa različitim koncentracijama WPCD (100 i 200 ug/mL) tokom 12 sati u prisustvu ili odsustvu Golgi Stop u tri primjerka. U pozitivnoj kontroli je dodan LPS. Ćelije i supernatanti su detektovani pomoću FAC-a za analizu površinskih markera CD86i CD40 i ELISA za analizu citokina TNF-a i IL-12, respektivno.

Protokol imunizacije

Test akutne toksičnosti. U testu oralne akutne toksičnosti u ovoj studiji, korišteno je 40 zdravih odraslih ICR miševa. ICR miševi su držani na gladovanju (hrana, ali ne i voda preko noći) prije doziranja. WPCD je oralno davan u dozama od 0, 50, 500 ili 5000 mg/kg tjelesne težine svakoj životinji tokom 7 dana. U kontrolnu grupu uključeni su miševi tretirani fiziološkim rastvorom i alumom. Životinje su posmatrane svakodnevno tokom 14 uzastopnih dana. Miševi su pojedinačno promatrani kako bi se zabilježila smrtnost i klinički znakovi. Osim toga, tijekom eksperimenta mjerene su tjelesne težine i njihova potrošnja hrane i vode. 14. dana, indeks slezine ili timusa izračunat je kao (težina slezene ili timusa/tjelesna težina) × 10.

Detekcija imunomodulatorne aktivnosti WPCD in vivo. Da bi se ispitalo da li WPCD ima imunomodulatornu aktivnost, ovalbumin (OVA) (Sigma) je korišten kao model antigena, a ženke ICR miševa su nasumično podijeljene u 7 grupa (negativna kontrolna grupa (0.9 posto NaCl i WPCD 400 ug) i pozitivna kontrola (stipsa 200 ug sa OVA)). Miševi su davani supkutano dva puta sa 10 ug OVA samog ili WPCD sa OVA prema dozi od 20, 100 ili 400 ug sa 2-nedeljnim intervalom. Uzorci krvi i slezena su uzeti nakon dopunske vakcinacije kako bi se otkrili titri IgG, podklase IgG, proliferacija splenocita i citokini, površinski markeri DC-a i Treg frekvencija

Detekcija OVA-specifičnih antitijela

OVA-specifični IgG titri i podklase ispitani su ELISA-om prema prethodnoj metodi [27]. ELISA ploče (Nunc, Thermo Fisher Scientific) su obložene preko noći, a zatim blokirane. Uzorci seruma su serijski razrijeđeni za analizu titra IgG ili detekciju IgG1 i IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Ploče su zatim inkubirane sa PBST-om koji sadrži HRP-konjugirane anti-mišje IgG, IgG1 i IgG2a 1 h na 37˚C. Kolorimetrijska reakcija je razvijena s tetrametilbenzidinom (TMB), a zatim su mjerene apsorbancije na 450 nm/655 nm i izražene kao jedinice optičke gustoće (OD).

Detekcija proliferacije splenocita i citokina

Proliferacija splenocita određena je MTT testom. 21. dana nakon prve vakcinacije dobijena je jedna suspenzija splenocita. Ćelije su kultivisane u RPMI-1640 mediju u 96-pločama sa jažicom prema koncentraciji od 1×106 ćelija/jažici u tri primerka. Kulture su stimulirane sa OVA (konačna koncentracija 10 ug/mL), ConA (konačna koncentracija 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) i LPS (konačna koncentracija 100 ng/mL) 48 h na 37˚C . Ćelije su kultivisane 48 h i 20 μL (5 mg/mL) MTT (Sigma, St Louis, MO) je dodato u svaku jažicu i inkubirano još 4 h. Nakon dodavanja 50 μL DMSO u svaku jažicu kako bi se zaustavio razvoj boje (Sigma), ploče su očitane na 570 nm pomoću čitača mikrotitarskih ploča (Bio-Rad, Kalifornija, SAD). Proliferacija splenocita je izražena kao indeks stimulacije (SI), koji je bio odnos OD570 nm stimulisane i nestimulisane jažice.

Prinosi IL-4 i IFN- u T ćelijama mjereni su intracelularnim bojenjem citokina prema objavljenom protokolu sa manjim modifikacijama [27, 28]. Pojedinačna suspenzija splenocita pripremljena je 21. dana nakon prve vakcinacije. Nakon lize crvenih krvnih zrnaca, splenocit (2×106 ćelija/mL) je inkubiran sa OVA (10 ug/mL) za 4-h stimulacije i dodan je Golgi stop (BD) za 12 h inkubacije, PMA kao pozitivna kontrola. Ćelije su sakupljene, isprane sa PBS, obojene sa CD4-FITC/CD8-FITC, te fiksirane i permeabilizirane sa Cyto fix/Cytoperm kitom (BD) prema uputstvima proizvođača. Intracelularno bojenje citokina izvršeno je odgovarajućom koncentracijom IL-4-PE ili IFN- -APC antitijela na 4˚C tokom 20 min. Obojene ćelije su otkrivene pomoću FAC-a. Analiza podataka je obavljena u FlowJo.

Procjena sazrevanja DC i Treg ćelija u slezeni

Za analizu sazrijevanja DC-a iz splenocita kod miševa, izvršeno je bojenje površine ćelije sa CD11c-PE, CD40-FITC i CD80-APC antitijelima. Trećeg dana nakon prve vakcinacije dobijena je pojedinačna suspenzija splenocita (1×106 ćelija/mL) i ćelije su podvrgnute dvostrukom bojenju. Intenzitet fluorescencije je izmjeren FACs Calibur, a izmjereni podaci analizirani su pomoću FlowJo.

Da bi se uočilo da li WPCD može smanjiti frekvenciju CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg ćelija. Pojedinačna suspenzija splenocita je pripremljena 7. dana nakon druge vakcinacije. Splenocit (2×106 ćelija/mL) je podvrgnut površinskom bojenju CD4-APC antitijela, nakon čega je uslijedilo bojenje nuklearnim citokinom odgovarajućim CD25-FITC i Foxp3-PE antitijelima sa regulatorni komplet za bojenje T-ćelija miša (eBios ciences) prema uputama proizvođača. Učestalost CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg ćelija je testirana na FAC-ovima. Analiza podataka je obavljena u FlowJo.

Statistička analiza

Testovi jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) (Tukeyjev test višestrukog poređenja) su urađeni kako bi se analizirale razlike između više eksperimentalnih grupa. Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ±SD. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Rezultati

WPCD je promovirao sazrijevanje i funkciju BM-DC in vitro

Adaptivni imunitet je određen aktivacijom DC-a, uključujući tipove kostimulacijskih molekula i citokina [29, 30]. U početku smo istraživali da li WPCD može promovirati ekspresiju kostimulacijskih molekula. Prema različitim dozama WPCD, davani su BM-DC iz C57BL/6. Analizirani su nivoi ekspresije CD11c, CD86, CD80, CD40 i MHC-II u ćelijama (slika 1). Ćelije zatvorene sa SSC i FSC su pokazale da tretman različitim dozama WPCD nije promijenio morfologiju BM-DC (podaci nisu prikazani). Nivoi ekspresije CD86, CD80 i CD40 su značajno povećani na način koji zavisi od doze u poređenju sa netretiranom grupom i dostigli su plato pod dozom od 20 ug/mL WPCD, ali je razlika bila nije značajno u poređenju sa LPS grupom (slike 1A-1C). Nivo ekspresije MHC-II značajno je povećan do svoje maksimalne vrijednosti pod dozom od 50 ug/mL (slika 1D). Rezultati analize ćelijskih površinskih markera pokazali su da DC tretirani LPS ili WPCD pokazuju značajno povećane nivoe ekspresije CD86, CD80, CD40 i MHC-II i promoviraju fenotipsko sazrijevanje.

Neki adjuvansi mogu povećati kostimulativne molekule na DC ili direktno inducirati lučenje citokina. IL-12 i TNF- su glavni citokini za aktiviranje Th1 imunološkog odgovora. Analizirali smo prinose citokina u BM–DC nakon tretmana WPCD. Nakon što su BM–DC tretirani različitim sadržajem WPCD tokom 12 h, supernatant je sakupljen da bi se otkrio sadržaj IL-12 i TNF- pomoću ELISA kompleta. WPCD bi mogao ovisno o dozi povećati proizvodnju IL-12 (slika 2A) i TNF- (slika 2B). Rezultati su pokazali da WPCD može izazvati funkcionalno sazrijevanje DC-a

U imunološkom odgovoru potrebno je funkcionalno aktivirati DC. Zatim je viši nivo alogene proliferacije T ćelija izazvan potpuno zrelim DC. Stoga je MLR istraživao funkcionalni odgovor DC-a na WPCD. Alostimulatorna sposobnost DC-a izazvanih WPCD, slično LPS-u, dramatično je poboljšana na način ovisan o dozi u naznačenom omjeru (Slika 2C i 2D). Rezultati su pokazali da je WPCD poboljšao prezentaciju antigena i optimizirao T-ćelijski odgovor pomoću MLR in vitro.

WPCD je promovirao sazrijevanje DC-a putem TLR4 puta

Iz gornjih rezultata moglo bi se zaključiti da su BM-DC aktivirani WPCD ukazivali na slične ekspresije površinskih molekula DC kao i LPS (TLR4 ligand). Stoga smo pretpostavili da se BM-DC aktiviraju WPCD putem TLR4 puta. Nakon što su BM-DC prethodno tretirani sa TAK-242 (TLR4 inhibitor) i zajedno kultivisani sa WPCD i LPS tokom 12 sati, ekspresija CD40, CD86, TNF-a ili IL{{12 }} su otkriveni pomoću FAC-a ili ELISA-e. Kao što je prikazano na slikama 3A i 3B, tretman TAK-242 rezultirao je značajno smanjenom ekspresijom CD40 i CD86 izazvanom LPS-om ili WPCD, i proizvodnjom citokina IL-12 ili TNF-a je također značajno smanjen (slike 3C i 3D). Rezultati su pokazali da WPCD može aktivirati DC sazrijevanje kroz TLR4 put.

WPCD pojačava humoralni i ćelijski imunitet

U svrhu poređenja, procijenili smo efekte WPCD na izazivanje humoralnog imunološkog odgovora kod OVA imuniziranih miševa. Prije vakcinacije i 14., 21., 35. i 49. dana nakon prve vakcinacije, uzeta je krv za otkrivanje IgG titra i IgG podklasa seruma pomoću ELISA. Odgovor IgG antitijela na OVA povećavao se s povećanjem doze primjene WPCD (100 i 400 ug) na način ovisan o dozi (slika 4). Optimalna koncentracija bila je 100 ug/mL WPCD i povećala je IgG odgovore za dva puta u poređenju sa samo OVA 21, 35. i 49. dana (slika 4A). Značajno povećanje nivoa OVA-specifičnih IgG1 i IgG2a antitela ispod 20 i 100 ug davanja WPCD dobijeno je u poređenju sa OVA grupom u serumu 35. dana (slika 4B). U međuvremenu, Alum je promovisao samo nivoe ekspresije OVA-specifičnih IgG i IgG1 antitela kod imunizovanih miševa. Sam WPCD nije pokrenuo OVA-specifična antitijela. Gore navedeni rezultati očigledno ukazuju da je WPCD generirao veće titre antitijela i uravnoteženije Th1/Th2 odgovore od Alum.

Proliferacija splenocita je još jedan pokazatelj ćelijskog imuniteta. ConA stimuliše T-ćelije, a LPS stimuliše proliferaciju B-ćelija. 21. dana nakon prve vakcinacije dobijena je suspenzija pojedinačne splenocite i stimulirana sa OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptidom, ConA (5 ug/mL) i LPS (5 ug/mL) tokom 48 h. Zatim je MTT metodom mjerena proliferacija T ćelija. WPCD bi mogao značajno promovirati proliferaciju splenocita stimulisanu OVA-antigenom, Con A-mitogenom i LPS mitogenom kod miševa imuniziranih OVA i WPCD (slika 5), ​​a optimalna koncentracija WPCD bila je 100 ug/mL. Ovi podaci su pokazali da WPCD kao pomoćno sredstvo za vakcinu kod miševa imuniziranih OVA može djelotvornije inducirati aktivaciju T-ćelija i B ćelija od stipse.

Svi testirani WCPD adjuvansi formulisani sa OVA vakcinama generisali su podjednako jak humoralni i ćelijski imunitet (slike 4 i 5). Na osnovu ovih podataka, da bismo dalje procijenili utjecaje WPCD na OVA-specifični T helper (Th) ćelijski odgovor, dalje smo analizirali ekspresiju citokina u CD8 plus i CD4 plus T ćelijama pomoću protočne citometrije (slika 6). Dana 21. nakon prve vakcinacije, izolovan je jedan splenocit miševa, a zatim je kultivisan sa OVA (10 ug/mL). Prinos IL-4 u CD4 plus T ćelijama u grupi primijenjenoj sa 100 ug OVA/WPCD bio je značajno veći nego u OVA/Alum grupi i OVA grupi i sličan onom u PMA (slika 6A). Štaviše, prinos IFN-a u CD8 plus i CD4 plus T ćelijama je takođe značajno povećan kod miševa kojima je davan OVA/WPCD (20, 100 i 400 ug) (Slike 6B i 6C). U poređenju sa Alum adjuvansom, WPCD je pokazao bolju sposobnost induciranja lučenja IL-4 i IFN-a iz T ćelija.

WPCD je stimulirao sazrijevanje DC-a i smanjuje Treg frekvenciju in vivo

DCS je prepoznat kao najmoćniji APC uključen u iniciranje primarnih imunoloških odgovora. Dakle, 3. dana nakon prve vakcinacije, također smo istraživali efekte WPCD na CD40 i CD80 na DC u slezeni kod miševa (Slike 7A i 7B). Miševi u grupi 100-ug OVA/WPCD proizveli su značajno više nivoe CD40 i CD80 na DC od onih u OVA/Alum grupi. Ovi podaci su pokazali da WPCD može aktivirati DC i inducirati sazrijevanje DC kod miševa. Treg ćelije mogu uravnotežiti toleranciju i imunološki odgovor. Da bi se dalje istražilo kako je WPCD modulirao imuni odgovor, Treg ćelije u slezeni kod miševa su obojene mišjim kompletom za bojenje T ćelija regulatora. Dana 21. nakon prve vakcinacije, uočena je smanjena učestalost CD25 plus Foxp3 plus Treg ćelija u ukupnim CD4 plus T ćelijama (slika 7C). U poređenju sa OVA i OVA/Alum grupama, WPCD grupa je pokazala značajno smanjenu Treg frekvenciju.

Procjena sigurnosti WPCD kod miševa

Da bismo procijenili oralnu akutnu toksičnost, izvršili smo test akutne toksičnosti. Miševi kojima je oralno davana doza od 5000 mg/kg tjelesne težine nisu pokazala abnormalno ponašanje ili nuspojave i nije pronađena smrtnost u testu procjene toksičnosti. Nije zabeležena značajna razlika u povećanju telesne težine, indeksu timusa i indeksu slezine među različitim grupama miševa kojima su davane različite doze WPCD i nije bilo značajne razlike (Tabela 1). Nije zabilježen mortalitet nakon 14 dana. Stoga je LD50 vrijednost WPCD bila više od 5000 mg po kg tjelesne težine.

Da bi se ispitalo da li WPCD ima negativne efekte na rast miševa, prije i nakon potkožne vakcinacije, određena je tjelesna težina za svakog miša (Tabela 2). U naknadnom posmatranju miševa, nuspojave ili abnormalno ponašanje nisu uočeni. Osim toga, tjelesna težina miševa kojima je davan WPCD i miševa kojima je davan fiziološki rastvor ili OVA/Alum nije pokazala značajnu razliku. Ovi rezultati posmatranja su pokazali da je primena WPCD bila bezbedna.

Diskusija

Adjuvansi su ključne komponente u vakcinama [31]. Zbog napretka u genomici i proteomici, sve više i više rekombinantnih i sintetičkih molekula cjepiva se identificira. Stoga je potrebno više pomoćnih sredstava i formulacija. Neki moćni adjuvansi općenito su povezani s povećanom toksičnošću, na primjer, FCA. Stoga je neophodno pronaći sigurnu formulaciju koja sadrži različite sinergističke komponente koje će na kraju dovesti do željenog imunološkog odgovora. Polisaharidi iz kineskih biljaka su netoksični i ne pokazuju značajne nuspojave [32,28]. Za određenu vakcinu potreban je siguran adjuvans.

Cistanche deserticola je važna tonik biljka i široko postoji u sušnim zemljama i toplim pustinjama na sjeverozapadu Kine. Cistanche deserticola je široko zabrinuta zbog svojih bioaktivnosti uključujući imunomodulatorno, antioksidativno, antibakterijsko i antitumorsko djelovanje [20,21]. Određeni napredak je postignut u strukturnoj karakterizaciji i imunološkoj aktivnosti Cistanche deserticola, koja je dobar kandidat za razvoj adjuvansa. Eksperimentalno smo procijenili adjuvantne efekte i mehanizam WPCD in vitro i in vivo. Subkutana primjena WPCD značajno je promovirala humoralne i ćelijske imune odgovore povećanjem serumskih antitijela i proliferacije limfocita, pojačavajući ekspresiju citokina, povećavajući DC sazrijevanje i smanjujući učestalost CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Treg ćelija.

DCS su ključni APC za primanje naivnih T ćelija. Aktivacija DC je važna za adjuvanse. DCS, posebno DC izvedeni iz mišje srži, često se koriste za procjenu pomoćnih sredstava i vakcina. Protočna citometrija može razlikovati ćelije koje su aktivirane nakon hvatanja antigena iz okolnih ćelija. U FCM analizi, stepen agregacije stimulisanih ćelija je indirektni pokazatelj procene bezbednosti imunomodulatora [3]. Dakle, podaci o aktivnosti WPCD adjuvansa u DC in vitro mogu pružiti vrijedne informacije za životinjske modele. Na osnovu BM-DC modela, nivoi ekspresije MHC-II, CD86, CD80 i CD40, produkcija citokina i alogenska proliferacija T ćelija su detektovani u optimalnom opsegu koncentracija WPCD. Nivoi ekspresije MHC-II, CD86, CD80 i CD40 su povećani u BM-DC, a prinosi TNF-a i IL-12 su povećani na način koji zavisi od doze. Uočena je alogena proliferacija T ćelija. Morfologija BM-DC nije promijenjena. Induciranjem aktivacije BM-DCs i izlučivanja upalnih citokina in vitro, WPCD adjuvans može značajno povećati količinu antigena i količinu APC i stimulirati T stanice da luče IFN-, što doprinosi povećanju imunomodulatorne aktivnosti.

Različiti kineski zeljasti polisaharidi su sposobni da aktiviraju imuni sistem i poseduju odlične adjuvantne sposobnosti kroz stimulisanje sazrevanja DC putem TLR4 puta [33,28]. Dakle, pretpostavljamo da TLR4 učestvuje u signalnom putu sazrevanja DC-a izazvanog WPCD. Kao što se i očekivalo, tretmani inhibitorima TLR4 doveli su do značajnog smanjenja TNF-a i IL-12. Nadalje, inhibicija TLR4 puta je također ometala ekspresiju CD 40 i CD80 na DC, što ukazuje da je sazrijevanje DC ovisilo o TLR4. Stoga je očigledno da TLR4 učestvuje u sazrevanju DC-a izazvanog WPCD.

Optimalna doza adjuvansa i formulacije cjepiva empirijski je određena u mnogim eksperimentima. Kako bismo istražili odnos doza-odgovor WPCD adjuvansa i OVA antigena kod miševa, odabrali smo različite doze WPCD na osnovu prethodno prijavljenih podataka iz BM-DC in vitro za supkutanu primjenu ICR miševa dvaput. Otkrili smo da je WPCD značajno povećao prinos OVA-specifičnih antitijela i inducirao uravnotežen Th1/Th2 imuni odgovor uz povećanje nivoa IgG1 i IgG2a. Naročito je nivo IgG2a bio viši od onog tretiranog Alumom u optimalnoj dozi. Stoga je WPCD rezultirao višim nivoima specifičnih antitijela i većom efikasnošću s nižim injekcijama.

Nove vakcine zahtijevaju indukciju snažnih ćelijskih odgovora, koji uključuju antitijela, T pomoćne (Th) ćelije i citotoksične T limfocite (CTL). Terapeutska vakcina ima za cilj da izazove jači odgovor T-ćelija. Idealan adjuvans povećava snagu vakcine i promoviše ćelijski posredovani imunitet bez izazivanja toksičnih efekata [34]. Među zapažanjima na modelima imuniziranih miševa, WPCD je doveo do povećanja OVA-specifične i nespecifične proliferacije splenocita u poređenju sa Alumom. Neki adjuvansi povećavaju regulaciju citokina i imunološkog sistema. Na primjer, saponini mogu stimulirati ćelijski posredovane imunološke odgovore na antigen koji normalno indukuje samo antitijela. Odabrali smo IL-4 i IFN- kao indikatore za indirektnu procjenu nivoa imuniteta kod miševa. WPCD bi mogao izazvati više lučenja IL-4 i IFN-a od stipse. Stoga su uočeni snažni odgovori T-ćelija pomagača i izlučivanje citokina kao rezultat WPCD vakcinacije, što sugerira da bi WPCD mogao efikasnije stimulirati limfocite da luče citokine tipa Th1- i citokina tipa Th{13}} nego Alum.

Adjuvansi koji utiču na prezentaciju antigena mogu uticati na složene imunološke procese. Treg ćelije mogu modulirati Th1 i Th2 odgovore [35]. Odgovarajuća doza WPCD može promovirati sazrijevanje DC kod miševa povećanjem nivoa ekspresije CD80 i CD40 i pojačavanjem sposobnosti prezentacije OVA antigena u ranom imunološkom odgovoru. Eksperimentalni rezultati aktivacije DCS i Treg frekvencije pokazali su da je WPCD inducirao sazrijevanje DC i smanjio Treg frekvenciju u slezeni kod miševa. Ovi rezultati su dokazali da je WPCD poboljšao efikasnost OVA vakcina povećanjem ciljanja ćelija koje predstavljaju antigen i promocijom specifične aktivacije T-ćelija.

U razvoju adjuvansa, teško je selektivno izazvati odgovarajući imunološki odgovor protiv odgovarajuće infekcije. Odgovarajući adjuvans treba da ima niske nuspojave i toksičnost za ljude ili životinje. Stoga, treba uzeti u obzir sigurnost WPCD, uključujući trenutne i dugoročne nuspojave. U ovoj studiji smo istraživali akutnu toksičnost WPCD i negativan efekat WPCD na performanse rasta miševa tokom 110 dana. Rezultati akutne toksičnosti WPCD pokazali su da tjelesna težina, indeks timusa ili indeks slezine nemaju značajnu razliku. Vrijednost LD50 WPCD bila je više od 5000 mg po kg tjelesne težine. Tokom eksperimentalnog naknadnog promatranja miševa, nije pronađena nuspojava ili abnormalno ponašanje kod miševa. Ovi rezultati su pokazali da je WPCD siguran.

U zaključku, u ovoj studiji, WPCD, sirovi polisaharid ekstrahovan iz C. deserticola iz Xinjianga, pokazao je neka svojstva pomoćnih sredstava. Na primjer, WPCD je poboljšao i Th1 i Th2 odgovore aktiviranjem DC-a, povećavajući odgovore antitijela, poboljšavajući proizvodnju citokina. Štaviše, istražili smo mehanizam efikasnosti WPCD analizirajući sazrevanje i funkciju DC-a putem TLR4 puta in vitro. Kod miševa tretiranih samo sa WPCD, nije uočena očigledna nuspojava. Dakle, WPCD je imao veću imunostimulirajuću aktivnost u ćelijskim i humoralnim imunim odgovorima. Adjuvansi su mješavina nekoliko spojeva. Mješavina nekoliko sirovih ekstrakata može imati veće blagotvorne učinke od jednog ekstrakta biljke. Neophodno je sistematski istraživati ​​ekstrakte WPCD, testirati njihovu efikasnost i sigurnost, te razjasniti mehanizme njihovog djelovanja.

Popratne informacije

S1 fajl. ARRIVE Checklist. (DOCX)

Priznanja

Uz posebnu zahvalnost Bing Wang-u i Daocheng Wu-u na pružanju dobrih ideja u eksperimentima.

Prilozi autora

Konceptualizacija: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Kurs podataka: Xiumei Yang, Yu Yang. Formalna analiza: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Pribavljanje sredstava: Ailian Zhang. Administracija projekta: Ailian Zhang.

Resursi: Ailian Zhang, Gan Zhao. Pisanje – originalni nacrt: Ailian Zhang.

Pisanje – recenzija i uređivanje: Ailian Zhang, Daocheng Wu.