Ljudske TH17 ćelije uključuju Gasdermin E pore da oslobađaju IL-1 na aktivaciji NLRP3 inflamasoma

Pokazalo se da urođeni imuni odgovori mogu usvojiti adaptivna svojstva kao što je pamćenje. Ne zna se da li T stanice koriste urođene imunološke signalne puteve kako bi diverzificirale svoj repertoar efektorskih funkcija. Gasdermin E (GSDME) je molekul koji stvara pore u membrani za koji se pokazalo da izvršava piroptotičku ćelijsku smrt i tako služi kao potencijalna kontrolna tačka za rak. U ovoj studiji, pokazujemo da ljudske T ćelije eksprimiraju GSDME i, iznenađujuće, da je ova ekspresija povezana sa trajnom održivošću i prenamijenjena za oslobađanje alarmnog interleukina (IL)-1. Ovo svojstvo bilo je ograničeno na podskup humanih pomoćnih T ćelija tipa 17 sa specifičnošću za Candida albicans i regulirano intrinzičnim NLRP3 inflamazomom T stanica, i njegovim angažmanom proteolitičke kaskade uzastopnih kaspaza-8, kaspaza{{6 }}, i cijepanje GSDME nakon stimulacije receptora T ćelija i sazrijevanje kalpaina licenciranog sa kalcijumom pro-IL-1 oblika. Naši rezultati pokazuju da je formiranje pora GSDME u T ćelijama mehanizam nekonvencionalnog oslobađanja citokina. Ovaj nalaz diverzificira naše razumijevanje funkcionalnog repertoara i mehaničke opreme T ćelija i ima implikacije na antifungalni imunitet.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

T ćelije pomagači (TH ćelije) su važni pokretači efektorskih odgovora specifičnih za antigen putem njihove sekrecije različitih citokina. T ćelije pomoćnog tipa 17 (TH17 ćelije), posebno, prepoznate su po svojim antifungalnim funkcijama kroz lučenje njihovog citokina IL-17A, koji je reguliran faktorom transkripcije RAR-receptor siročeta (ROR)- t1. Oni su također glavni krivci u patogenezi autoimunih bolesti2. TH1Ranije je prepoznato da 7 ćelija pokazuje funkcionalnu heterogenost3. Pro- ili anti-inflamatorne funkcije se vrše putem diferencijalne koekspresije IL-17 sa interferonom (IFN)- ili IL-10, respektivno4–7. Sveukupno, ovo je oblikovalo koncept dualizma TH17 stanica i stimuliralo istraživanje signala i molekularnih ciljeva koji kontroliraju dihotomiju između dva funkcionalna ishoda TH17 stanica za terapijske primjene3,4,8,9. Međutim, duboko razumijevanje identiteta i mehaničke osnove sudbine patogenih naspram imunoregulatornih TH17 stanica ostaje nedostižno. Dodatni efektorski mehanizmi koji još nisu pronađeni koji prevazilaze proizvodnju IL-17 mogu također djelovati u TH17 ćelijama sa antifungalnim ili antibakterijskim ciljnim specifičnostima. IL-1 citokini, od kojih IL-1 i IL-1 predstavljaju najistaknutije članove, ispoljavaju duboke upalne efekte. Nakon oslobađanja iz ćelija koje predstavljaju antigen (APC), oni ne samo da indukuju brze urođene upalne odgovore, već i orkestriraju adaptivni imunitet promicanjem polarizacije TH17 ćelija i patogenosti T ćelija pri vezivanju na njihov zajednički IL-1R1 receptor4,10,11 . IL-1-nezavisna TH17 ćelija prajminga, koja je takođe prethodno opisana, rezultira proizvodnjom antiinflamatornih TH17 ćelija4. IL-1 iz urođenih ćelijskih izvora stoga služi kao faktor prebacivanja za dihotomiju protivupalnih sudbina TH17 ćelija. Za razliku od većine drugih citokina, IL-1 citokinima nedostaje signalni peptid i stoga se luče nekonvencionalnim, endoplazmatskim retikulumom (ER)–Golgi-jevim mehanizmom.

Pro-IL-1 zahtijeva enzimsko cijepanje prije oslobađanja u ekstracelularni prostor i angažmana njegovog receptora. NLRP3 inflamasom je multimerni citosolni proteinski kompleks koji okuplja mikrobnu infekciju i ćelijska oštećenja i regrutuje kaspazu-1 za naknadno pro-IL-1 cijepanje12. Izlazak IL-1 također zahtijeva cijepanje plina dermina D (GSDMD) posredovano kaspazom{{8} i formiranje pora u procesu koji se naziva piroptoza, upalni oblik ćelijske smrti13,14. IL-1 , s druge strane, smatra se da se obrađuje nezavisno od NLRP3 inflamasoma kroz regulatorne kontrolne tačke koje su još uvijek slabo shvaćene10. Uprkos ovim potpuno različitim putevima za sazrijevanje i oslobađanje IL-1 i IL-1, oba citokina zajednički proizvode ćelije urođenog imunološkog sistema, što ukazuje na postojanje još neidentificiranih koregulatorne rute. U ovoj studiji, pokazujemo da podskup ljudskih TH17 ćelija uključuje NLRP3-zavisnu signalnu kaskadu da indukuje formiranje pore na membrani pomoću GSDME, koji služi autokrinom oslobađanju proinflamatornog IL-1. Ovaj nalaz otkriva nekonvencionalan način sekrecije citokina od strane ljudskih T stanica i tako diverzificira funkcionalni i mehanički repertoar T stanica.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Rezultati

Proizvodnja IL-1 je karakteristika ljudskih TH ćelija

Da bismo istražili heterogenost podskupine ljudskih TH17 ćelija i otkrili različite funkcije i njihovu molekularnu kontrolu, izvršili smo jednoćelijsko RNA sekvenciranje (scRNA-seq) aktiviranih ljudskih TH17 ćelija, koje su izolovane ex vivo iz periferne krvi prema njihova jedinstvena ekspresija površinskih markera hemokinskih receptora15. Eksploratorna analiza pomoću uniformne višestruke aproksimacije i projekcije (UMAP) i Leidenskog grupisanja svih TH17 ćelija identifikovala je šest pojedinačnih klastera (slika 1a). Izrazita i rijetka (6%) populacija TH17 ćelija koje eksprimiraju IL1A je selektivno obogaćena klasterom 1 (slika 1a,b). Poređenje svih gena u klasteru 1 sa svim drugim klasterima otkrilo je da je IL1A značajno povećan (dopunska tabela 1). Ovo je bilo neočekivano s obzirom da se IL-1 ne smatra da pripada kanonskom repertoaru efektorskih citokina T ćelija, već umjesto toga predstavlja urođeni signal opasnosti16. IL1A, međutim, nije bio među najboljim diferencijalno eksprimiranim genima (DEG) u klasteru 1, što je zahtijevalo dublju strategiju pretraživanja kako bi se razotkrila njegova značajna povećana regulacija u subpopulaciji TH17 ćelija (dopunska slika 1). Na nivou proteina, TH17 ćelijski klonovi su se takođe segregirali u različite IL-1 + i IL-1 – T ćelijske klonove, podržavajući tako heterogenost ekspresije IL-1 proteina na nivou jedne ćelije unutar populacija ćelija TH17 (slika 1c). Da bismo uporedili ekspresiju IL1A od strane TH17 ćelija sa onom u drugim tipovima imunih ćelija, posebno o prethodno prijavljenim dobrovernim proizvođačima IL-1, ispitali smo više javnih scRNA-seq skupova podataka mononuklearnih ćelija ljudske periferne krvi (PBMC). Iznenađujuće, ovo nije otkrilo bilo kakvu ekspresiju IL1A u različitim tipovima imunoloških stanica PBMC u mirovanju, uključujući T ćelije, B ćelije, prirodne ćelije ubice (NK), NKT ćelije, monocite i dendritske ćelije (dodatna slika 2a,b). Čak ni monociti nisu pokazali nikakvu ekspresiju IL1A na nivou jedne ćelije, osim ako se na ove ćelije nije primenio specifični stimulus koji indukuje IL1A, posebno lipopolisaharid (LPS) (dopunska slika 2c,d), koji je razotkrio njihovu sposobnost proizvodnje IL1A i povezanost ekspresije IL1A s tekućim inflamatornim urođenim imunološkim odgovorom (dopunska slika 2e). Zanimljivo je da jednoćelijsko transkriptomsko poređenje DEG-ova između IL1A+ i IL1A– ćelija iz TH17 ćelija u odnosu na monocite nije pokazalo gotovo nikakvo preklapanje u koekspresiji gena (IL1A i CCL3), što je vrlo sugeriralo na drugačiji način regulacije IL1A u T. ćelije u odnosu na monocite (slika 1d). Uzeti zajedno, ovi rezultati otkrivaju postojanje posebne subpopulacije ćelija koje eksprimiraju IL-1 - unutar podskupa TH17 ćelija.

Podskup TH17 ćelija koji proizvodi IL-1 - je pro-upalni

Da bismo istražili fiziološku važnost ekspresije IL1A u ljudskim TH17 ćelijama, izvršili smo nepristrasno transkriptomsko poređenje IL1A+ i IL1A– TH17 ćelija nakon scRNA-seq. Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) za gene koeksprimirane sa IL1A u TH17 ćelijama, kao i analiza obogaćivanja pomoću DEG, otkrila je upečatljivu povezanost IL1A s aktivacijom i proliferacijom T stanica nakon nepristranog ispitivanja svih dostupnih termina ontologije gena (GO) ( Slika 2a i Dodatna slika 3). Ovo otkriće dovodi u pitanje ranije dodijeljenu ulogu IL-1 u starenju i smrti ćelija u novom kontekstu T ćelija17. Analiza obogaćivanja je također otkrila jaku prezastupljenost za nekoliko GO pojmova koji se odnose na 'upalu', što sugerira da je ekspresija IL1A od strane TH17 stanica doprinijela patogenom identitetu T ćelija s ulogama u upalnim bolestima (slika 2a). Ova ideja je podržana povećanjem regulacije gena označenih GO terminom 'ćelijski odgovor na interleukin-1', s obzirom na prethodno prijavljeni proinflamatorni efekat prebacivanja IL-1 na ukupnu funkcionalnost TH17 ćelija4 i supresivni efekat autokrinog IL-1 na ekspresiji IL-10 (prošireni podaci, sl. 1a–c). Direktno poređenje IL1A+ naspram IL1A– TH17 ćelija u svim klasterima pokazalo je da IL1A+ TH17 ćelije pokazuju značajno pojačane proinflamatorne, ali smanjene antiinflamatorne potpise (slika 2b) 7. Nadalje, klaster 1, koji je obogaćen za IL17A ćelije, bio je TH značajno više proinflamatorni i manje antiinflamatorni od svih ostalih pet klastera, kao što pokazuje GSEA (slika 2b). Zanimljivo je da je masovno transkriptomsko poređenje podskupina ćelija protiv upale TH17 otkrilo da je IL1A čak među najvišom regulisanim genima u podskupu proinflamatornih TH17 ćelija (Slika 2c,d i Prošireni podaci, Slika 2). IL10 je, umjesto toga, bio jako smanjen, kao što se očekivalo prema prethodnim izvještajima4,7. Ova recipročna korelacija ekspresije IL-1 i IL-10 od strane TH17 ćelija je takođe uočena na nivou proteina pomoću protočne citometrije (slika 2e). Analiza obogaćivanja DEG-ovima pokazala je preveliku zastupljenost KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) puteva za autoimune bolesti kao što su 'reumatoidni artritis' i 'upalna bolest crijeva' (slika 2f), što je podržalo proinflamatornu prirodu ekspresije IL1TH17 podskup ćelija. Zapravo, pacijenti koji boluju od juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), visokoupalnog oblika reumatoidnog artritisa kod djece čija je patogeneza ranije bila povezana s urođenim IL-1 i IL-1 18,19, značajno su i snažno otkrili povećana ekspresija IL-1 od strane IL-17+ TH ćelija u poređenju sa IL-17+ TH ćelijama iz zdrave kontrolne krvi (slika 2g). Nije uočeno povećanje IFN-a unutar IL-17+ TH ćelija iz krvi pacijenata sa JIA u poređenju sa krvlju kontrolnog davaoca, uprkos prethodno objavljenoj povezanosti IFN-a sa patogenošću ćelija TH17 (Slika 2g, desni panel) 4. Nadalje, analiza sinovijalne tekućine koja se podudara s krvlju pokazala je vrlo visoke frekvencije IL-1 + TH ćelija, sugerirajući da T ćelije, osim urođenih ćelija, također mogu predstavljati relevantan ćelijski izvor IL-a povezanog sa bolešću{{74} } na mjestu upale.

Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem

IL-1 izraz je reguliran TH17 programom

Da bismo istražili da li je ekspresija IL-1 opće svojstvo T ćelija, obogatili smo pojedinačne podskupove TH stanica iz PBMC-a prema njihovoj diferencijalnoj ekspresiji hemokinskih receptora (prošireni podaci, slika 3) i uporedili njihov IL-1 sekrecija. IL-1 je specifično proizveden od podskupa TH17 ćelija, ali ne i od podskupa TH1 ćelija, podskupa TH2 ćelija ili regulatornih T ćelija (Treg ćelije) (sl. 3a–c). Zapanjujuće, nivo njegove sekrecije pri stimulaciji anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitijelima odgovara onom ljudskih monocita stimuliranih LPS-om i nigericinom, što ukazuje da ljudske TH17 ćelije, bez obzira na njihov adaptivni imunološki identitet, služe kao glavni izvor signala opasnosti IL. -1 (slika 3a). Intracelularna ekspresija IL-1 proteina je izostala u svježe izolovanim TH stanicama u mirovanju, ali se inducira na aktivaciju receptora T stanica (TCR), uz značajno obogaćivanje TH17 ćelija u poređenju sa TH1, TH2 i Treg ćelijama obogaćenim TH ćelijama (slika 3b ,c). Čini se da su ovi nalazi specifični za ljudski imuni sistem jer su prethodni izvještaji isključili proizvodnju IL-1 od strane T ćelija miša16. Jedinstvena povezanost IL-1 sa podskupom ćelija TH17 potaknula nas je da mehanički analiziramo regulaciju ovog citokina. Zanimljivo je da je ekspresija IL-1 smanjena specifičnom inhibicijom ROR-t, glavnog transkripcionog faktora TH17 ćelija (slika 3d,e) 1. Ovi podaci su u skladu sa prisustvom pretpostavljenih mjesta vezivanja za ROR-t i ROR- u regionima promotora i pojačivača IL1A (prošireni podaci, slika 4a,b). Sudbina određene podskupine TH ćelija određena je različitim polarizirajućim mikrookruženjem citokina tokom naivne stimulacije T ćelija. Uočili smo najveću intracelularnu ekspresiju i sekreciju IL-1 na naivnom prajmingu T ćelija u uslovima polarizacije ćelija TH17 (IL-1 i transformišući faktor rasta (TGF)-) (slika 3f,g). Međutim, pojedinačni tretmani samo sa IL-1 ili TGF- nisu doveli do značajne ekspresije IL-1 u naivnim T ćelijama, naglašavajući sinergistički efekat kombinatornih TH17 citokina koji primaju ćelije na de novo indukciju IL-1 (Dopunska slika 4). Za razliku od toga, TH1 (IL-12) i TH2 (IL-4) uslovi prajmiranja ćelija nisu značajno promijenili lučenje IL-1 u poređenju sa onim pod stimulacijom u odsustvu polarizirajućih citokina. Zajedno, ovi nalazi pokazuju da naivne T ćelije stiču sposobnost proizvodnje IL-1 kroz citokine koji polariziraju ćelije TH17. TH ćelije memorije su takođe pokazale značajnu dalju regulaciju njihovog efektorskog citokina IL-1 u IL-1 i TGF-mikrookruženjima (slika 3h).

Slika 1|Posebna podskupina ljudskih TH17 ćelija može eksprimirati IL-1.

Identitet podskupina TH ćelija takođe karakterišu različita svojstva migracije, koja su povezana sa diferencijalnom ekspresijom hemokinskih receptora20. Uočili smo da je ekspresija IL-1 obogaćena CCR6+ ali ne i CCR6– T ćelijama i smanjena je u CXCR3– T ćelijama u poređenju sa CXCR3+ T ćelijama, iako nije bilo razlike u Ekspresija IL-1 između CCR4+ i CCR4–T ćelija (slika 3i). Ovi podaci pokazuju da ćelije koje proizvode IL-1 - prikazuju obrazac migracije koji je prethodno dodijeljen ćelijama koje proizvode IL{11}15. Uzeti zajedno, ovi podaci dosljedno pokazuju da je IL-1 jedinstvena funkcija ljudskih TH17 ćelija.

Slika 2|IL-1 ćelije koje proizvode TH17 su proinflamatorne

Slika 3|Proizvodnja IL-1 od strane T ćelija je ograničena na sudbinu TH17 ćelija

Kalpain je preduslov za lučenje IL-1 ćelijama TH17

Da bismo istražili mehanizam lučenja IL-1, tretirali smo TH17 ćelije sa inhibitorom izvoza proteina brefeldinom A (BFA) i otkrili da na sekreciju IL-1 nije utjecalo, za razliku od konvencionalnih citokina, npr. kao IL-17A (Prošireni podaci, sl. 5a–c). Ovo podržava postojanje nekonvencionalnog ER–Golgijevog nezavisnog puta za lučenje IL-1 od strane T ćelija i u skladu je s prethodnim izvještajima za urođene tipove ćelija21,22. Jedinstveno svojstvo koje je ranije bilo pripisano IL-1 je njegova istovremena lokalizacija u citoplazmi i plazma membrani23. Otkrili smo, međutim, da ćelije TH17, za razliku od monocita, ne pokazuju IL-1 vezan za membranu (Prošireni podaci, slika 5d). Iako je cijepanje pro-IL-1 potrebno za generiranje bioaktivnog ekstracelularnog IL-1, poznato je da se IL-1 pasivno oslobađa nakon smrti stanice i da ispoljava svoj bioaktivni potencijal nakon vezivanja za IL{ {19}}RI u svom neiscijepljenom ili rascijepljenom obliku24. Da bismo utvrdili da li pro-IL-1 prolazi kroz unutarćelijsku obradu za kontrolirano oslobađanje od strane ljudskih T ćelija, procijenili smo pune i zrele oblike IL-1 u supernatantu aktiviranih TH17 ćelija. Kako bismo isključili bilo kakve kontaminirajuće monocite kao potencijalni izvor izlučenog IL-1, generirali smo klonove TH17 ćelija u periodu od 2 sedmice i restimulirali ih anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitijelima još 5 dana prije imunoblotiranja. U svih šest testiranih klonova TH17 ćelija, pronašli smo preferencijalno obogaćivanje cijepanog oblika IL-1 u supernatantima kulture (slika 4a). TH17 ćelijski lizati su, nasuprot tome, pokazali preferencijalno obogaćivanje neiscijepljenog pro-IL-1 oblika, kao što se i očekivalo (dopunska slika 5a). Ovi rezultati isključuju pasivno oslobađanje pro-IL-1 tokom nekroze ćelije kao zadanog izlaznog modaliteta IL-1 u T ćelijama i, umjesto toga, sugeriraju da ljudske TH17 ćelije moraju posjedovati molekularnu mašineriju za pro-IL{{ 46}} cijepanje kako bi se omogućilo kontrolirano ekstracelularno oslobađanje ovog moćnog bioaktivnog molekula od strane živih T stanica, za razliku od urođenih stanica (dopunska slika 5b). Ovo, međutim, ne isključuje dodatni doprinos nekroze T ćelija oslobađanju bioaktivnog pro-forme IL-1 (dopunska slika 5a). Pro-IL-1 obradu na različitim mjestima cijepanja može katalizirati nekoliko proteaza17,25,26. Kalpain je cisteinska proteaza zavisna od kalcijuma koja može dovesti do zrelog IL-1 p17 fragmenta26, koji smo ovdje identificirali. Otkrili smo aktivnost kalpaina u TH17 ćelijama. Povećava se pri aktivaciji sa anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitelima (slika 4b). Sekrecija IL-1 od strane TH17 ćelija zavisila je od intrinzične aktivnosti kalpaina T ćelija jer je farmakološka inhibicija kalpaina smanjila lučenje IL-1 aktiviranim ćelijama TH17 u ekstracelularni prostor na način koji zavisi od doze (slika 4c) . Shodno tome, inhibicija kalpaina je rezultirala intracelularnom akumulacijom pro-IL-1 (slika 4d). Da bismo potvrdili ovisnost lučenja IL-1 o kalpainu, također smo genetski izbacili kalpain u ljudskim TH17 ćelijama koristeći grupisane, pravilno raspoređene kratke palindromske ponavljanja (CRISPR)–Cas9. Ovo je otkrilo ulogu CAPN2, ali ne i CAPN1, u izlučivanju IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija (slika 4e). Nasuprot tome, LPS-/nigericinom indukovano lučenje IL-1 od strane monocita nije zavisilo od kalpaina (slika 4f). Ovi podaci su bili u skladu sa preferencijalnom ekspresijom CAPN2, ali ne i CAPN1, od strane podskupova ljudskih T ćelija, za razliku od dendritskih ćelija, koje su pokazale obrnuti obrazac ekspresije kalpain gena (dopunska slika 6). Sekrecija IL-1 u TH17 ćelijama povećana je zbog intracelularne akumulacije kalcijuma i inhibicije sarko-/ER Ca{94}} ATPaze sa tapsigarginom (slika 4g) i smanjena na ekstracelularnoj kelaciji kalcijuma sa (etilenbis(oksinitrid) )tetra-acetat (EGTA) (slika 4h), u skladu sa funkcijom kalpaina ovisnom o kalcijumu i lučenjem IL{100}} zavisnim od TCR26. Zajedno, ovi podaci su pokazali da je proteolitička aktivnost kalcijum zavisne proteaze kalpain preduvjet za nekonvencionalno lučenje IL{103}} od strane TCR-aktiviranih ljudskih TH17 ćelija.

Sekrecija IL-1 stanica TH17 regulirana je aktivacijom NLRP3 inflamasoma

Uprkos suštinskoj ulozi kalpaina u sazrijevanju pro-IL-1, mehanizam koji je doveo do ekstracelularnog izlaza cijepanog IL-1 ostao je nepoznat i stoga je dalje razmatran. Ekstracelularno oslobađanje IL-1 od strane mijeloidnih ćelija je ranije bilo povezano sa aktivacijom inflamasoma NLRP3, neenzimskom aktivnošću kaspaze-1 i oslobađanjem IL-1 16,27. Testirali smo da li ljudske TH17 ćelije posjeduju molekularnu skelu inflamasoma NLRP3 i pronašli proteinsku ekspresiju NLRP3 i molekule adaptera, proteina nalik na tačku povezanu s apoptozom koji sadrži CARD (ASC), u ljudskim TH17 stanicama (prošireni podaci, slika 6a, b). Uočili smo tekuću aktivaciju inflamasoma u TCR-aktiviranim TH17 ćelijama identifikacijom ASC mrlja koristeći ImageStream tehnologiju (slika 5a,b) 28,29. Zapanjujuće, povećane frekvencije ASC mrlja bile su jedinstveno ograničene na podskup ćelija TH17 (slika 5b, lijevo). TH17 ćelije su se čak približile formiranju ASC-pečaka makrofaga stimulisanih LPS-om i ATP-om (slika 5b, desno). Podskupovi ćelija TH1 i TH2, nasuprot tome, prikazuju nivoe pozadinskih ASC tačaka (slika 5b, levo). Štaviše, formiranje ASC-pegica i NLRP3-pečaka je potpuno poništeno u prisustvu specifičnog inhibitora inflamasoma NLRP3 MCC950, što potvrđuje postojanje tekuće aktivacije inflamasoma NLRP3 u TH17 ćelijama (Slika 5b, lijevo i Prošireni podaci, Sl. 6c). Selektivno angažovanje NLRP3 inflamasoma od strane TH17 ćelija dalje je podržano snažnom indukcijom NLRP3 transkripata na stimulaciju T ćelija u prisustvu citokina koji polariziraju ćelije TH17 IL-1 i TGF- (slika 5c). Važno je da je izlučivanje IL-1 od strane TH17 ćelija značajno smanjeno specifičnom inhibicijom NLRP3 inflamasoma sa MCC950 (slika 5d), pokazujući na taj način kritičnu ulogu NLRP3 inflamasoma u izlučivanju IL-1 od strane ljudske ćelije TH17. Kaspaza-1 je kanonski efektorski protein u kompleksu inflamasoma NLRP330. Uočili smo ekspresiju pro-kapaze-1 u aktiviranim ljudskim TH17 ćelijama (slika 5e). Međutim, za razliku od nalaza u monocitima stimulisanim LPS-om i nigericinom, nije otkrivena cijepana kaspaza-1 u lizatima ljudskih TH17 ćelija (slika 5e). Ovo zapažanje je potkrijepljeno odsustvom kaspaze-1 FLICA bojenja u TH17 ćelijama koje su stimulirane u prisustvu ili odsustvu IL-1 koji promoviše citokinske stimulacije (prošireni podaci, slika 7a–e). Dalje smo isključili ekstracelularno oslobađanje kaspaze-1 ELISA-om nakon stimulacije TH17 ćelija sa anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitelima tokom 5 dana (slika 5f). Čak iu prisustvu IL{79}} stimulusa IL-1, sekrecija kaspaze-1 nije bila inducibilna i ostala je niska kao kod monocita u mirovanju (slika 5f). Farmakološka inhibicija kaspaze-1 sa Ac-YVAD-CMK nije smanjila lučenje IL-1 u prisustvu ili odsustvu IL-1 indukcije IL-1 . Umjesto toga, uočili smo blago povišeno lučenje IL-1 na inhibiciji kaspaze-1 (dodatna slika 7a,b). Važno je da TH17 ćelije nisu pokazale nikakvu promjenu u sekreciji IL-1 na CRISPR–Cas9-inženjerskom smanjenju ekspresije CASP1 (slika 5g). U skladu sa odsustvom bioaktivne kaspaze-1, nismo uočili nikakvo lučenje IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija. Ovo je bilo u suprotnosti sa slučajem kod monocita, koji su pokazali lučenje IL-1-zavisno od kaspaze{101}} na stimulaciju sa LPS-om i ATP-om (prošireni podaci, slika 7f). Nadalje, nikakav intracelularni IL-1 nije bio detektovan ili induciran IL-1 -polarizirajućim citokinima u TH17 ćelijama ili TH17 ćelijskim klonovima ili detektiran u aktiviranim TH17 ćelijama scRNA-seq analizom (Prošireni podaci, slika 7g,h, i). Ovo je bilo u suprotnosti sa nalazom za monocite, koji su koeksprimirali IL-1 i IL-1 na nivou jedne ćelije, u skladu s prethodno predloženim obrascem lučenja i navodne koregulacije oba IL-1 citokini (Prošireni podaci, slika 7g)16,27. Kumulativno, ovi podaci pokazuju da ljudske TH17 ćelije proizvode IL-1 nezavisno od kaspaze-1 i IL-1, za razliku od monocita i vjerovatno drugih urođenih imunih ćelija, uprkos jasnoj uključenosti NLRP3 inflamasoma.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IL-1a izlazi iz TH17 ćelija preko GSDME pora

Gasdermini pripadaju porodici nedavno identifikovanih efektorskih molekula za formiranje pora koji omogućavaju oslobađanje inflamatornih medijatora31. Naša analiza transkriptoma je otkrila selektivnu regulaciju ekspresije GSDME u proinflamatornoj IL-1 -stimuliranoj TH17 podskupini ćelija, ali ne i regulaciju bilo kojeg drugog člana porodice gastrina (slika 6a). Ovo je bilo iznenađujuće s obzirom na to da ekspresija GSDME nikada ranije nije prijavljena u primarnim T ćelijama. Nasuprot tome, GSDMD, za koji je poznato da je reguliran inflamazomom NLRP3 i da je meta kaspaze-1 (ref. 31), nije bio reguliran naviše, podržavajući ideju nekanonske signalizacije NLRP3 inflamasoma. Ranije je pokazano da GSDME formira pore na membrani u ćelijama urođene imunosti koje mogu poslužiti kao kanali za ekstracelularno oslobađanje alarmina i inicirati piroptotičku ćelijsku smrt slično GSDMD32. Da bismo testirali povezanost GSDME sa podskupom ćelija TH17, procenili smo da li citokini koji polariziraju ćelije TH17 koregulišu GSDME. Samo kombinacija TGF- sa IL-1 (TH17), ali ne i IL-12 (TH1) ili IL-4 (TH2), povećala je nivoe GSDME transkripta procijenjeno reverznom transkripcijom – kvantitativno PCR (RT–qPCR) (slika 6b). Ovo je potkrijepljeno postojanjem navodnih mjesta vezivanja za TH17 ćelijske faktore transkripcije ROR- i BATF (osnovni leucinski zipper transkripcijski faktor, sličan ATF-u) u promotorskim regijama GSDME (prošireni podaci, slika 8a,b)33. Ekspresija GSDMD, nasuprot tome, nije regulirana citokinima koji polariziraju T ćelije (dopunska slika 8). Ovaj rezultat nas je potaknuo da procijenimo ekspresiju GSDME na nivou proteina u ljudskim TH17 ćelijama. GSDME pro-forma je bila inducibilna na TCR aktivaciju. Indukcija GSDME proteina kao odgovor na ovaj adaptivni imunološki signal bila je neočekivana, ali je dodatno potkrijepljena postojanjem navodnih mjesta vezivanja TCR faktora transkripcije koji reagiraju na signalizaciju kao što su NFAT, FOS, JUN i RELA u GSDME promotorskim regijama (Prošireni podaci, slika 8a ,b). GSDME je eksprimiran već 24 h nakon poliklonalne stimulacije. Odcijepljeni GSDME koji formira pore na N-terminalnom dijelu bio je detektovan u kasnim vremenskim tačkama, 3-4 dana nakon TCR stimulacije TH17 ćelija (slika 6c). GSDMD pune dužine je istovremeno induciran na aktivaciju T ćelija. Nasuprot tome, nije uočeno cijepanje GSDMD, kao što je predviđeno iz odsustva sekrecije kaspaze-1 i IL-1, ostavljajući ulogu GSDMD u TH17 ćelijama otvorenom za dalju analizu (slika 6c). Zatim smo imali za cilj istražiti služe li pore GSDME kao kanali za ekstracelularno oslobađanje IL-1 u TH17 ćelijama. Stoga smo izbacili GSDME sa CRISPR-Cas9 tehnologijom i pratili otpuštanje IL-1 u supernatant tokom vremena pomoću ELISA-e. Odsustvo GSDME, ali ne i GSDMD, značajno inhibira oslobađanje IL-1 od strane TH17 ćelija (slika 6d). Ovo jasno pokazuje da formiranje pora GSDME služi kao mehanizam za nekonvencionalno oslobađanje IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija.

Slika 4|Kalpain je preduvjet za oslobađanje odcijepljenog IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija

Slika 5|Nekonvencionalna aktivacija inflamasoma NLRP3 reguliše proizvodnju IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija

Kaspaza-8/3 GSDME kaskada cijepanja omogućava NLRP3-zavisno lučenje IL-1

Zatim smo istražili mogućnost mehaničkog preslušavanja između aktivacije inflamasoma NLRP3 i cijepanja GSDME u ljudskim TH17 stanicama. Nedavno je pokazano da kaspaza-3 cijepa GSDME, koji je zauzvrat meta NLRP3 inflamasomskog interaktora kaspaze-8 (ref. 34,35). Zaista, i pro-kapaza-8 i pro-kapaza-3 su otkrivene u TH17 ćelijama. Otkrili smo da se cijepanje obje kaspaze dogodilo na TCR stimulaciji i da je prethodilo cijepanju GSDME (slika 6e). Nasuprot tome, u monocitima stimulisanim nigericinom i LPS-om nisu otkriveni cijepani proizvodi kaspaze-8 i kaspaze-3 (slika 6e). Kako bismo ustanovili uzročnu ulogu ovih kaspaza u cijepanju GSDME i izlučivanju IL-1 od strane T ćelija, mi smo farmakološki blokirali aktivnost kaspaze-3 ili kaspaze{20}} inhibitorom Z-DEVD -FMK ili Z-IETD-FMK, respektivno. Inhibicija aktivnosti kaspaze{25}} sa Z-IETD-FMK poništila je cijepanje nizvodne ciljne kaspaze-3, u skladu s prethodnim izvještajima o drugim tipovima ćelija36. Oba tretmana su smanjila cijepanje GSDME, a istovremeno su ukinula sekreciju IL-1 (slika 6f–i i prošireni podaci, slika 9a,b). Umjesto toga, inhibicija kaspaze-1 nije uticala na cijepanje kaspaze-3 ili GSDME (dopunska slika 9). Ovi podaci jasno su pokazali da je osovina kaspaza-8–kaspaza-3–GSDME radila u ljudskim TH17 ćelijama na TCR aktivaciju i da je regulirala lučenje IL-1 u tim stanicama. Da bismo konačno uspostavili vezu između ove kaskade proteolitičkog cijepanja i inflamasoma NLRP3, primijenili smo MCC950 na stimulirane TH17 ćelije, što je zaista dovelo do značajnog smanjenja cijepanja kaspaze-3 i GSDME 5. dana (slika 6f,g i prošireni podaci slika 9c). Smanjenje cijepanja kaspaze-8 bilo je, međutim, manje izraženo u isto vrijeme analize, što je bilo u skladu sa ranijim vremenskim okvirom aktivacije (slika 6e,f). Ukratko, ciljana inhibicija svakog pojedinačnog molekularnog igrača uspostavila je NLRP3 inflamazom–kaspaznu-8– kaspazu-3–GSDME kaskadu kao proteolitički put uključen u ekstracelularno oslobađanje bioaktivnog IL-1 od strane ljudi TH17 ćelije.

Slika 6|NLRP3–casp8/3 kaskada cijepanja dovodi do GSDME pora za oslobađanje IL-1

TH17 ćelije su otporne na piroptozu uprkos GSDME porama

Formiranje pora gasdermina je ranije bilo povezano sa piroptotskom smrću ćelija u različitim tipovima ćelija13,14,37. Pronašli smo ekspresiju cijepane jedinice N-GSDME koja stvara pore u plazma membrani, ali ne i u citosolu, što podržava funkciju formiranja pora GSDME u T ćelijama (slika 7a). Iznenađujuće, transkriptomsko poređenje GSDME-netaknutih i CRISPR-Cas9 genom uređenih, GSDME-deficitarnih ljudskih TH17 ćelija od strane GSEA isključilo je razlike u različitim oblicima ćelijske smrti; međutim, posebno je otkriveno da su zahvaćeni procesi i putevi u TH17 ćelijama sa nedostatkom GSDME uglavnom povezani sa genima koji kontrolišu transmembranski transport, u skladu sa kanalima koji formiraju pore formiranim od N-GSDME (Slika 7b i Dodatna slika 10) . Transkriptomsko poređenje pojedinačnih ćelija TH17 odabranih za prisustvo u odnosu na odsustvo ekspresije GSDME podržalo je održivost TH17 ćelija koje eksprimiraju GSDME putem obogaćivanja skupa gena za proliferaciju (slika 7c). Konačno smo potvrdili otpornost ljudskih TH17 ćelija koje eksprimiraju GSDME na piroptozu demonstrirajući odsustvo bilo kakve razlike u oslobađanju laktat dehidrogenaze (LDH) među CRISPR-Cas9 genom uređenim, GSDME-deficijentnim i GSDME-intaktnim TH17 ćelijama na TCR stimulaciji (sl. 7d). Zatim smo uporedili IL-1 + i IL-1 – TH17 ćelije s obzirom na njihovu vitalnost i potencijal proliferacije, jer TH17 ćelije nisu pokazivale nikakvu površinsku ekspresiju IL-1 za razliku od IL{{36 }}koji proizvode ćelije drugih ćelijskih linija, kao što su monociti (Prošireni podaci, slika 5d). Ovo poređenje IL-1 + i IL-1 – TH17 ćelija zahtijevalo je uspostavljanje domaćeg testa sekrecije IL{41}}, omogućavajući izolaciju IL-1 + -održivih TH17 ćelija hvatanjem izlučenih autokrini IL-1 na površinu ćelije nakon stimulacije forbol-12-miristat-13-acetatom (PMA) i jonomicinom. Nije uočena razlika u efikasnosti kloniranja TH17 ćelija koje su deponovane kao pojedinačne ćelije nakon sortiranja na prisustvo ili odsustvo površinskog IL-1 (dopunska slika 11). Ovaj nalaz je isključio razlike u vitalnosti i ekspanziji IL-1 + i IL-1 – TH17 ćelija na nivou jedne ćelije. Dalje smo ponovo klonirali TH17 klonove koji su pregledani, na osnovu različitih stepena intracelularne ekspresije IL-1, i pratili njihovu odgovarajuću efikasnost kloniranja. Ako je oslobađanje IL-1 omogućeno za GSDME povezano s piroptotskom smrću stanica, tada je inverzna korelacija između ekspresije IL-1 u klonovima T ćelija i učestalosti rasta klonova na njihovom pojedinačnom rekloniranju (efikasnost kloniranja) bila očekivati. Međutim, efikasnost rekloniranja T ćelija bila je nezavisna od nivoa ekspresije IL-1 u TH17 ćelijskim klonovima i umjesto toga bila je slična onoj kod kontrolnih klonova T ćelija, odabranih na osnovu različitih nivoa ekspresije IFN-a u odsustvu IL-1 koekspresija (slika 7e). Važno je da su IL-1 + TH17 klonovi ćelija nastavili da ponovo eksprimiraju IL-1 u ponavljajućim ciklusima TCR restimulacije (slika 7f). Stoga je isključen gubitak ćelija koje proizvode IL-1 - povezane sa smrću ćelije iz njihove populacije klonskih T ćelija nakon restimulacije. Posebno, ovaj nalaz ukazuje na memoriju citokina T ćelija za inducibilni IL-1. Izvršili smo transkriptomsko poređenje između masovnih IL-1 + i IL-1 – TH17 ćelija i uočili još veće obogaćivanje za proliferacijske genske setove u IL-1 + u poređenju sa IL-1 – TH17 ćelijom klonovi (slika 7g). Transkriptomsko poređenje IL1A+ u odnosu na ćelije IL1A– TH17 potvrdilo je transkriptomsko obogaćivanje za proliferaciju. To je bio slučaj i za poređenje Leidenskog klastera 1, koji je bio obogaćen za TH17 ćelije koje eksprimiraju IL1A i inflamatorne signature, sa svim ostalim klasterima (slika 7h). IL-1 + TH17 ćelije su pokazale veću ekspresiju Ki67 prema protočnoj citometrijskoj analizi nego njihove IL-1 – kolege nakon 5 d poliklonske stimulacije (slika 7i), što opet podržava ideju da u ljudskim ćelijama TH17 IL{ {96}} izlaz nije povezan sa smrću ćelije, za razliku od urođenih ćelija. Kumulativno, ovi podaci isključuju povezanost proizvodnje IL-1 sa (piroptotskom) ćelijskom smrću čak i na nivou jedne ćelije i pokazuju da ljudske T ćelije imaju citokinsku memoriju za proizvodnju IL-1 pri ponavljanoj restimulaciji TCR-a .

IL-1 izveden iz T ćelija doprinosi odbrani domaćina protiv gljivica

Naš nalaz da ljudske TH17 ćelije proizvode urođeni signal opasnosti IL-1 i prenamjenjuju urođenu signalnu mašineriju za njegovo ekstracelularno oslobađanje zamagljuje razliku između adaptivnih i urođenih imunoloških odgovora i na taj način proširuje ukupni funkcionalni repertoar T ćelija. Kritična karakteristika koja ostaje karakteristična za adaptivne memorijske odgovore je specifičnost antigena obdarena TCR-om. Stoga smo istražili da li je sposobnost ljudskih TH17 ćelija da proizvode IL-1 ograničena na specifične specifičnosti antigena. Ranije se pokazalo da su ćelije TH17 visoko obogaćene ćelijama specifičnim za antigene C. albicans i Staphylococcus aureus15. Zanimljivo je da smo uočili značajno veću ekspresiju i sekreciju IL-1 kod C. albicans-specifičnih nego kod S. aureus-specifičnih TH17 klonova ćelija (slika 8a). Zatim smo istražili da li će naivne T ćelije koje prepoznaju C. albicans umjesto S. aureus biti pripremljene njihovim srodnim antigenom da selektivno proizvode IL-1. Naivne (CD45RA+ CCR7+) TH ćelije su kultivisane sa autolognim monocitima pulsiranim toplotno inaktiviranim antigenima C. albicans ili S. aureus ili poliklonalno stimulisane anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitelima, a zatim klonirane 7. dana sa alogenim hranidbenim ćelijama. Svi klonovi su restimulisani 14. dana sa anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitelima tokom 5 dana za ELISA supernatanta. Zapanjujuće, otkrili smo da je C. albicans, ali ne S. aureus ili poliklonalna TCR aktivacija, inducirala de novo proizvodnju IL-1 u ljudskim diferenciranim TH17 ćelijama (slika 8b). Naš kombinovani pristup ex vivo opoziva i in vitro prajminga stoga utvrđuje da je sposobnost proizvodnje IL-1 ograničena na T ćelije sa TCR specifičnošću za C. albicans. Konačno smo testirali da li je karakteristična sposobnost TH17 ćelija specifičnih za C. albicans da proizvode IL-1 povezana sa fiziološkom ulogom u odbrani domaćina od gljivica. Za ovo smo kokultivirali ljudske monocite sa supernatantima iz humanih TH17 ćelija nakon njihove poliklonalne restimulacije sa anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitelima tokom 5 dana. Primetili smo značajno povećanu fagocitozu FITC-obeležene C. albicans od strane monocita korišćenjem protočne citometrije. Važno je da je povećana fagocitoza C. albicans supernatantima TH17 ćelija zavisila od IL-1, što je pokazano značajnim ukidanjem fagocitoze C. albicans ako su supernatanti ćelija TH17 bili lišeni IL-1 nakon imunoapsorpcije ili CRISPR-a {46}}ciljano smanjenje IL-1 u ćelijama TH17 (slika 8c). In vitro snimanje živih ćelija dodatno je potvrdilo povećano usvajanje i eliminaciju C. albicans od strane monocita u prisustvu IL-1 -koji sadrži supernatante TH17 ćelija (slika 8d, video podaci). Uzeti zajedno, ovi nalazi snažno sugeriraju da TH17 ćelije uklanjaju infekcije C. albicans ne samo svojom proizvodnjom IL-17, kao što se ranije mislilo38, već i, u značajnoj mjeri, putem sposobnosti jedinstvene podskupine TH17 ćelija da proizvodi IL-1 . Kumulativno, nalazi koji identifikuju formiranje GSDME pora u T ćelijama kao izlaznu strategiju za proinflamatorni IL-1 i regulaciju GSDME preko NLRP3 osi inflamazom–kapaza-8–kaspaza-3 otkrivaju novu način sekrecije citokina T ćelija koji je povezan sa proinflamatornom podgrupom TH17 ćelija sa antifungalnim TCR specifičnostima. Ovo pruža nove terapeutske ciljeve za modulaciju ljudskih TH17 ćelija koje su relevantne za antifungalnu odbranu domaćina i mogu takođe učestvovati u patogenezi hroničnih upalnih bolesti.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Diskusija

Ukratko, naši nalazi otkrivaju prethodno nepoznati biološki put i modalitet sekrecije citokina u ljudskim T stanicama koji diverzificiraju ukupnu funkcionalnost populacije T stanica. Otkrili smo da je ekspresija IL-1 bila jedinstveno ograničena na sudbinu ćelije TH17, o čemu svjedoči njegova koekspresija sa IL-17A, regulacija pomoću ROR-t, indukcija pomoću TH17 citokina koji primaju ćelije IL{{ 6}} i TGF- i svojim profilom ekspresije receptora hemokina povezanih sa TH17 ćelijama. Ovi nalazi su u skladu s postojanjem vezivnih mjesta za ROR-t i ROR- u IL1Α pojačivaču i promotorskim regijama kao što je opisano u ovoj studiji i sa ranije prijavljenim ROR-t-vezujućim mjestima u NLRP3 promotorskoj regiji39. Nadalje smo primijetili da TH17 citokini koji primaju ćelije povećavaju ekspresiju NLRP3 i GSDME. Shodno tome, glavni regulatori sudbine TH17 ćelije, kao što su ROR- i BATF, kao i višestruki TCR-inducibilni transkripcioni faktori, pokazali su pretpostavljena mesta vezivanja u regionima pojačivača GSDME. TH17 ćelijska polarizacija je stoga promovirala ne samo ekspresiju IL-1 već i njegov vanćelijski izlazak (Prošireni podaci, slika 10, grafički sažetak). Neočekivano, otkrili smo da je inflamasom NLRP3 aktivan i prenamijenjen za oslobađanje IL-1 umjesto IL-1 u TCR-aktiviranim ćelijama TH17. Za razliku od urođenih ćelija, T ćelije nisu specijalizovane za urođeno detektovanje opasnosti, za koje se zna da pokreće sklapanje NLRP3 komponenti inflamasoma. Međutim, ranije je pokazano da povišenje citoplazmatskog Ca2+ zaobilazi urođenu signalizaciju opasnosti za aktivaciju inflamasoma NLRP316,40. Ovo je u skladu s našim otkrićem da je aktivacija TCR, koja je praćena protokom kalcija, preduvjet za oslobađanje IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija. Primijetili smo da su TH17 ćelije uključile alternativnu NLRP3 nizvodnu signalnu kaskadu putem angažmana kaspaze-8. Ovo je moglo biti olakšano odsustvom cijepanja kaspaze{41}} jer je ranije demonstrirano kompetitivno regrutiranje kaspaze-1 naspram kaspaze-8 inflamasoma34,41. Također smo pronašli pro-kapazu-1 i necijepljeni GSDMD u ljudskim TH17 ćelijama, ali nema dokaza za njihovo cijepanje koje je regulirano NLRP3 inflamazomom ili za proizvodnju IL-1. Ekspresija njihovih prekursora postavlja pitanje da li bi klasična signalizacija inflamasoma NLRP3 i oslobađanje IL-1 također mogli djelovati u ljudskim ćelijama TH17 ako se primjene alternativni stimulansi koji se tek trebaju identificirati. Ovo implicira da protivregulatorni mehanizmi zavisni od kaspaze-8- naspram kaspaze{59} mogu kontrolirati dihotomiju proizvodnje IL-1 naspram IL-1 od strane T stanica, konsolidirajući prethodno predložene uloge za NLRP3 inflamazom u oslobađanju IL-1 u ljudskim TH1 ćelijama42 i mišjim TH17 ćelijama43. Intrigantno zapažanje naše studije je identifikacija ekspresije GSDME i cijepanja u T ćelijama. Ovo je otkrilo da se nekonvencionalna sekrecija citokina preko membranskih pora može dogoditi u T stanicama. Nekoliko funkcija koje su nedavno dodijeljene GSDME-u povezane su s piroptozom i naknadnim povećanjem smrti tumorskih stanica i inflamatornim mikrookruženjem 32,44. Iznenađujuće, otkrili smo da TH17 ćelije koje eksprimiraju GSDME umjesto toga pokazuju očuvanu vitalnost i kontinuiranu proliferaciju na ponavljajućoj TCR stimulaciji u poređenju sa T ćelijama s nedostatkom GSDME. Isti rezultati su uočeni za IL-1 + u poređenju sa IL-1 – T ćelijama. Ovi nalazi su bili neočekivani, s obzirom na to da se proizvodnja IL-1 do sada smatrala obilježjem starenja, a time i ćelija zaustavljenih u replikaciji ili umiranja45. Ovo evocira ideju da signal opasnosti IL-1 može biti dio citokinske memorije povezane s T ćelijama koja je re-ekscibilna pri prepoznavanju srodnog antigena46. Nadalje, pore GSDME mogu služiti fiziološkoj funkciji da omoguće TH17 ćelijama da oslobode dodatne još uvijek neidentificirane molekule izvan IL-1 koje su definirane njihovom veličinom ili nabojem47. Ovo bi bilo u skladu sa rezultatima našeg nepristrasnog transkriptomskog poređenja GSDME-intaktnih ili CRISPR-Cas9-projektovanih, GSDME-deficijentnih TH17 ćelija, koje su otkrile višestruku ulogu GSDME u transmembranskom transportu, ali ne i smrt ćelije. Mehanizam kojim se održava održivost i dugoročna memorija IL-1 citokina u T ćelijama sa GSDME porama, ostaje da se istraži u budućnosti. Dostupnost IL-1 iz različitih ćelijskih izvora, posebno iz urođenih APC-a, postavlja pitanje o relativnom doprinosu IL-1 izvedenog iz T ćelija ljudskom zdravlju i bolesti. Iako IL-1 + T ćelije čine samo mali podskup unutar T ćelijske loze, njihova sposobnost da proizvode IL-1 bila je kvantitativno uporediva sa onim LPS-stimuliranih monocita, podržavajući novi koncept da T ćelije mogu služiti kao relevantan izvor inflamatornog IL-1 . Naši nalazi iz transkriptomskih i funkcionalnih analiza otkrivaju da je IL-1 povezan s proinflamatornom sudbinom TH17 ćelija. IL{102}} subpopulacija ljudskih TH17 ćelija pokazala je transkriptomske potpise povećane upalne patogenosti i povezanosti s kroničnim upalnim bolestima. Značajno pojačana ekspresija IL{104}} cirkulirajućim TH17 ćelijama pacijenata sa JIA i njihova obilna lokalizacija u upaljenoj sinovijalnoj tekućini podržava ovaj patogeni potencijal IL{106}} podskupine TH17 ćelija. Ostaje da se utvrdi stroga uzročna veza između IL-1 -ćelija koje proizvode TH17 i patogeneze JIA, a relativni uticaj IL-1 + TH17 ćelija treba potvrditi u budućim kliničkim ispitivanjima. Zapanjujuće zapažanje je da je proizvodnja IL-1 od strane T ćelija čvrsto povezana kroz njihovu TCR specifičnost. Iako je proizvodnja IL-1 iz urođenih ćelijskih izvora pokrenuta nespecifičnim stresnim stimulansima16, otkrili smo da je proizvodnja IL-1 od strane ljudskih TH17 ćelija povezana sa TCR specifičnošću za C. albicans. Umjesto toga, TH17 ćelije specifične za S. aureus pokazale su značajno smanjenu proizvodnju IL{120}}. Ovi nalazi su u skladu s diferencijalnim zahtjevom IL-1 za stvaranje C. albicans- ali ne i S. aureus-specifičnih TH17 ćelija, kao što je ranije objavljeno4 i, shodno tome, sa kritičnom ulogom IL{{126} } za indukciju IL-1 ekspresije, kao što je ovdje navedeno. Osim toga, otkrili smo da lučenje IL-1 ovisi o TCR stimulaciji i signalima kalcijuma, naglašavajući njegovu čvrstu povezanost sa specifičnom adaptivnom imunološkom signalizacijom putem TCR-a. Poznato je da su ćelije TH17 protagonisti u uklanjanju infekcija C. albicans kroz njihovo lučenje IL-17, što je primjer disbioze C. albicans u uvjetima genetskog ili terapijskog nedostatka IL-1738. Otkrili smo da je ćelijski proizvod TH17 IL-1 uključen u klirens C. albicans jer njegovo odsustvo u supernatantima TH17 ćelija značajno smanjuje fagocitozu C. albicans monocita. Ovo sugerira da se efektorske funkcije antifungalnih TH17 ćelija ne vrše samo kroz IL-17A/F, kao što je prethodno sugerirano, već i kroz IL-1 na način specifičan za TCR. Stoga će se u budućnosti morati testirati da li aberantna regulacija molekularnog puta koji dovodi do proizvodnje IL-1 od strane TH17 ćelija može predisponirati kompromitovanu odbranu domaćina protiv gljivica. Kumulativno, naši nalazi otvaraju put za sistematsko istraživanje doprinosa IL{142}}ćelija koje proizvode TH17 u različitim inflamatornim bolestima i odbrani domaćina od gljivica. TCR–NLRP3 inflamazom–kapaza-8–kaspaza-3–GSDME osovina ne samo da predstavlja prethodno zanemareni način imunološkog signaliziranja i instrukcija sudbine u TH stanicama, već također pruža molekularne mete da ili poremete patogenu TH17 ćeliju identitet ili da ga iskoristi za odbranu domaćina.

Slika 7|TH17 ćelije su otporne na piroptozu uprkos GSDME porama plazma membrane.

Slika 8|TCR specifičnost kontrolira proizvodnju IL-1 doprinoseći uklanjanju C. albicans

Reference

1. Ivanov, II i dr. Nuklearni receptor siroče RORgammat usmjerava program diferencijacije proinflamatornih IL-17+ T pomoćnih ćelija. Cell 126, 1121–1133 (2006).

2. Zwicky, P., Unger, S. & Becher, B. Ciljanje interleukina-17 kod hronične upalne bolesti: klinička perspektiva. J. Exp. Med. 217, e20191123 (2020).

3. Stockinger, B. & Omenetti, S. Dihotomna priroda T helper 17 ćelija. Nat. Rev. Immunol. 17, 535–544 (2017).

4. Zielinski, CE et al. Ljudske ćelije TH17 izazvane patogenom proizvode IFN-gama ili IL-10 i regulišu ih IL-1beta. Nature 484, 514–518 (2012).

5. Ghoreschi, K. et al. Stvaranje patogenih ćelija TH17 u odsustvu TGF-beta signalizacije. Nature 467, 967–971 (2010).

6. Noster, R. et al. Disregulacija proinflamatornih naspram antiinflamatornih funkcija ljudskih TH17 ćelija u autoinflamatornom Schnitzlerovom sindromu. J. Allergy Clin. Immunol. 138, 1161–1169.e1166 (2016).

7. Aschenbrenner, D. et al. Imunoregulatorni i program rezidencije tkiva moduliran c-MAF u ljudskim TH17 ćelijama. Nat. Immunol. 19, 1126–1136 (2018).

8. Wu, C. et al. Indukcija patogenih TH17 ćelija inducibilnom kinazom SGK1 koja osjeća sol. Nature 496, 513–517 (2013).

9. Matthias, J. et al. Sol stvara antiinflamatorne Th17 ćelije, ali pojačava patogenost u proinflamatornim citokinskim mikrookruženjem. J. Clin. Invest. 130, 4587–4600 (2020).

10. Cavalli, G. et al. Interleukin 1alfa: sveobuhvatan pregled uloge IL-1alfa u patogenezi i liječenju autoimunih i upalnih bolesti. Autoimmun. Rev. 20, 102763 (2021).

11. Acosta-Rodriguez, EV, Napolitani, G., Lanzavecchia, A. & Sallusto, F. Interleukini 1beta i 6, ali ne transformirajući faktor rasta-beta, ključni su za diferencijaciju interleukina 17-koji proizvode humane T pomoćne ćelije . Nat. Immunol. 8, 942–949 (2007).

12. Latz, E., Xiao, TS & Stutz, A. Aktivacija i regulacija inflamasoma. Nat. Rev. Immunol. 13, 397–411 (2013).

13. Shi, J. et al. Cijepanje GSDMD inflamatornim kaspazama određuje piroptotičku ćelijsku smrt. Nature 526, 660–665 (2015).

14. Liu, X. et al. Gasni dermin D aktiviran inflamazomom izaziva piroptozu formiranjem membranskih pora. Nature 535, 153–158 (2016).

15. Acosta-Rodriguez, EV et al. Površinski fenotip i antigenska specifičnost humanih interleukina 17-koji proizvode T pomoćne memorijske ćelije. Nat. Immunol. 8, 639–646 (2007).

16. Gross, O. et al. Aktivatori inflamasoma induciraju lučenje interleukina- 1alfa putem različitih puteva s različitim zahtjevima za proteaznu funkciju kaspaze-1. Imunitet 36, 388–400 (2012).

17. Malik, A. & Kanneganti, TD Funkcija i regulacija IL-1alfa kod inflamatornih bolesti i raka. Immunol. Rev. 281, 124–137 (2018).

18. Cimaz, R. Sistemski juvenilni idiopatski artritis. Autoimmun. Rev. 15, 931–934 (2016).

19. Fong, KY, Boey, ML, Koh, WH & Feng, PH Koncentracije citokina u sinovijalnoj tečnosti i plazmi pacijenata sa reumatoidnim artritisom: korelacija sa koštanim erozijama. Clin. Exp. Reumatol. 12, 55–58 (1994).

20. Eyerich, S. & Zielinski, CE Definiranje podskupova Th-ćelija na klasičan i tkivno-specifičan način: primjeri sa kože. EUR. J. Immunol. 44, 3475–3483 (2014).

21. Monteleone, M., Stow, JL & Schroder, K. Mehanizmi nekonvencionalne sekrecije citokina porodice IL-1. Cytokine 74, 213–218 (2015).

22. Keller, M., Ruegg, A., Werner, S. & Beer, HD Active kaspaza-1 je regulator nekonvencionalne sekrecije proteina. Cell 132, 818–831 (2008).

23. Kurt-Jones, EA, Beller, DI, Mizel, SB & Unanue, ER Identifikacija interleukina 1 povezanog sa membranom u makrofagima. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 1204–1208 (1985).

24. Mosley, B. et al. Interleukin-1 receptor veže prekursor humanog interleukina-1 alfa, ali ne i interleukin-1 beta prekursor. J. Biol. Chem. 262, 2941–2944 (1987).

25. Carruth, LM, Demczuk, S. & Mizel, SB Učešće proteaze slične kalpainu u procesuiranju mišjeg interleukina 1alfa prekursora. J. Biol. Chem. 266, 12162–12167 (1991).

26. Kobayashi, Y. et al. Identifikacija neutralne proteaze aktivirane kalcijem kao enzima za obradu humanog interleukina 1 alfa. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 5548–5552 (1990).

27. Fettelschoss, A. et al. Aktivacija inflamasoma i IL-1beta ciljaju IL-1alfa za izlučivanje za razliku od površinske ekspresije. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, 18055–18060 (2011).

28. Franklin, BS, Latz, E. & Schmidt, FI Intra- i ekstracelularne funkcije ASC mrlja. Immunol. Rev. 281, 74–87 (2018).

29. Nagar, A., DeMarco, RA & Harton, JA Karakterizacija i procjena aktivnosti inflamazoma i kaspaze-1: detekcija i procjena inflamazomskih mrlja i aktivacije kaspaze-1 zasnovana na slikovnom citometru. J. Immunol. 202, 1003–1015 (2019).

30. Rathinam, VA & Fitzgerald, KA Inflamasomski kompleksi: mehanizmi u nastajanju i efektorske funkcije. Cell 165, 792–800 (2016).

31. Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. Glavni um je porodica proteina koja izvršava ćelijsku smrt i upalu. Nat. Rev. Immunol. 20, 143–157 (2020).

32. Zhang, Z. et al. Gasdermin E suzbija rast tumora aktiviranjem antitumorskog imuniteta. Nature 579, 415–420 (2020).

33. Schraml, BU et al. AP-1 faktor transkripcije BATF kontrolira diferencijaciju TH17. Nature 460, 405–409 (2009).

34. Antonopoulos, C. et al. Kaspaza-8 kao efektor i regulator signalizacije NLRP3 inflamasoma. J. Biol. Chem. 290, 20167–20184 (2015).

35. Vajjhala, PR et al. Adapter za inflamazom ASC inducira filamente domene efektora smrti prokapaze-8. J. Biol. Chem. 290, 29217–29230 (2015).

36. Stennicke, HR et al. Pro-kaspaza-3 je glavna fiziološka meta kaspaze-8. J. Biol. Chem. 273, 27084–27090 (1998).

37. Deng, W. et al. Streptokokni pirogeni egzotoksin B cijepa GSDMA i pokreće piroptozu. Nature 602, 496–502 (2022).

38. Puel, A. et al. Hronična mukokutana kandidijaza kod ljudi sa urođenim greškama interleukina{1}} imuniteta. Science 332, 65–68 (2011).

39. Billon, C., Murray, MH, Avdagić, A. & Burris, TP RORgamma reguliše NLRP3 inflamasom. J. Biol. Chem. 294, 10–19 (2019).

40. Lee, GS et al. Receptor koji osjeća kalcij reguliše inflamasom NLRP3 preko Ca2+ i cAMP. Nature 492, 123–127 (2012).

41. Gao, Y. et al. Transkripcijski profil identifikuje kaspazu-1 kao intrinzični regulator Th17 diferencijacije T ćelija. J. Exp. Med. 217, e20190476 (2020).

42. Arbore, G. et al. Imunitet T pomoćnika 1 zahtijeva aktivnost NLRP3 inflamasoma vođenu komplementom u CD4+ T ćelijama. Science 352, aad1210 (2016).

43. Martin, BN et al. Intrinzični ASC T ćelija kritički promoviše TH17-posredovani eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis. Nat. Immunol. 17, 583–592 (2016).

44. Wang, Y. et al. Hemoterapijski lijekovi indukuju piroptozu kroz kaspazu-3 cijepanje mozga. Nature 547, 99–103 (2017).

45. Wiggins, KA et al. Cepanje IL-1 inflamatornim kaspazama nekanonskog inflamasoma kontroliše sekretorni fenotip povezan sa starenjem. Aging Cell 18, e12946–e12946 (2019).

46. ​​Helmstetter, C. et al. Pojedinačne T pomoćne ćelije imaju kvantitativnu memoriju citokina. Imunitet 42, 108–122 (2015).

47. Xia, S. et al. Struktura pora Gasdermin D otkriva preferencijalno oslobađanje zrelog interleukina-1. Nature 593, 607–611 (2021).