Inhibicija GSK3 fosforilacijom na Ser389 kontroliše neuroinflamaciju
Oct 24, 2023
Abstract: Inhibicija glikogen sintaze kinaze 3 (GSK3) fosforilacijom Ser9 utiče na mnoge fiziološke procese, uključujući imuni odgovor. Međutim, posljedice inhibicije GSK3 alternativnom fosforilacijom Ser389 ostaju slabo okarakterisane. Ovdje smo ispitali neuroinflamaciju kod GSK3 Ser389 knock-in (KI) miševa, kod kojih je poremećena fosforilacija Ser389 GSK3. Broj aktiviranih mikroglija/infiltriranih makrofaga, astrocita i infiltriranih neutrofila bio je značajno veći kod ovih životinja u poređenju sa C57BL/6J divljim tipom (WT), što sugerira da neuspjeh da se inaktivira GSK3 fosforilacijom Ser389 dovodi do trajnog niskog stupnja neuroinflamacije. Štaviše, aktivacija glijalnih ćelija i moždana infiltracija imunih ćelija kao odgovor na lipopolisaharid (LPS) nisu uspjeli kod GSK3 Ser389 KI miševa. Takvi efekti su bili specifični za mozak, jer periferni imunitet nije bio na sličan način. Dodatno, fosforilacija kompleksa IkB kinaze (IKK) kao odgovor na LPS nije uspjela kod miševa GSK3 Ser389 KI, dok je STAT3 fosforilacija bila u potpunosti očuvana, što sugerira da je signalni put NF-κB specifično pod utjecajem ovog regulatornog puta GSK3. Sve u svemu, naši nalazi pokazuju da inaktivacija GSK3 fosforilacijom Ser389 kontrolira upalni odgovor mozga, što povećava potrebu za procjenom njegove uloge u napredovanju neuroinflamatornih patologija.
cistanche tubulosa—protuupalno
Ključne riječi: neuroinflamacija; mikroglija; astrociti; neutrofili; NF-κB signalizacija; protočna citometrija
Šta radi cistanche herb—Anti-upalni
Kliknite ovdje da pogledate Cistanche proizvode
【Tražite više】Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Uvod
Glikogen sintaza kinaza 3 (GSK3) je serin-treonin kinaza sa širokom specifičnošću. GSK3 reguliše različite procese kao što su upala, rast ćelija, diferencijacija ćelija i energetski metabolizam i uključen je u bolesti povezane sa starenjem kao što su dijabetes, Alchajmerova bolest i rak [1]. Obje izoforme GSK3, GSK3 i GSK3, su sveprisutno izražene, ali se njihove funkcije ne preklapaju u potpunosti [2]. GSK3 je konstitutivno aktivan, iako se njegova aktivnost može inhibirati sekvestracijom u citosolne komplekse, kao i fosforilacijom na ostacima Ser9 i Ser389 [3]. Akt-indukovana fosforilacija GSK3 na Ser9 je GSK3 regulatorni put prisutan u većini tipova ćelija, i to je podrazumevani put za ograničavanje aktivacije GSK3 i sprečavanje smrti ćelije. Nasuprot tome, otkrili smo da je fosforilacija Ser389 izazvana p38 MAPK ograničena na specifična tkiva kao što su mozak, timus i slezena [4] i da je moždana ekspresija fosfo-Ser389 GSK3 razvojno regulirana [5]. Fosforilacija GSK3 od strane Ser389 prvenstveno je pokrenuta odgovorom na dvolančane prekide DNK i ključno je omogućiti popravku DNK [6,7]. Dakle, dok je fosforilacija na Ser9 glavni put za inaktivaciju citoplazmatskog GSK3, fosforilacija Ser389 se koristi za inaktivaciju nuklearnog bazena GSK3 kako bi se povećalo preživljavanje tokom DNK DSB popravke [8]. Neuspjeh da se inaktivira GSK3 kroz fosforilaciju Ser389 kao odgovor na DSB dovodi do povećane ćelijske smrti nekroptozom [6,7]. Ovo je vrlo relevantno jer je nekroptotički tip smrti upalniji i pronađen je kod upalnih bolesti [9]. Međutim, za razliku od fosforilacije Ser9, implikacije fosforilacije GSK3 na Ser389 ostaju slabo okarakterisane. Brojne studije su podržale povezanost između GSK3 i upale. Dakle, aktivacija GSK3 upalnim stimulansima kao što su stres, infekcija ili trauma potiče proizvodnju proupalnih citokina kao što su IL-6, IL-1 i IFN, dok inhibicija GSK3 potiskuje sintezu proinflamatorni medijatori i povećava proizvodnju IL-10 od strane imunoloških ćelija [10]. GSK3 se može aktivirati lipopolisaharidom (LPS), jednim od glavnih imunostimulirajućih endotoksina gram-negativnih bakterija [11,12]. Nakon vezivanja bakterijskog LPS-a za Toll-like receptore (TLR), GSK3 posreduje u oslobađanju inflamatornih citokina u ćelijama urođenog imunog sistema [13]. Štaviše, prijavljeno je da primjena inhibitora GSK3 miševima tretiranim smrtonosnom dozom LPS značajno povećava preživljavanje životinja [14]. Uprkos ovim proinflamatornim efektima povezanim sa GSK3, antiinflamatorni efekti su takođe dokumentovani [15,16]. Stoga je regulacija GSK3 ključna za održavanje ravnoteže između pro- i anti-inflamatornih citokina nakon aktivacije TLR [17]. Nuklearni faktor kB (NF-kB) posreduje u proizvodnji proinflamatornih citokina i jedan je od glavnih faktora transkripcije koje aktiviraju TLR. Nekoliko autora je potvrdilo da je GSK3 u stanju da aktivira NF-kB signalizaciju kroz fosforilaciju kompleksa IkB kinaze (IKK), koji fosforiliše IkB i oslobađa aktivni NF-kB. Drugi transkripcijski faktor koji fosforilira GSK3 je pretvarač signala i aktivator transkripcije-3 (STAT3), koji posreduje u neuroinflamaciji u kontekstu septičkog šoka [18]. STAT3 fosforilacija pomoću GSK3 rezultira nuklearnom translokacijom i aktivacijom. Osim toga, GSK3 inhibira protuupalne CREB i AP{85}} transkripcijske aktivnosti, pojačavajući ekspresiju proinflamatornih citokina [10,19]. Ćelije mikroglije su rezidentni makrofagi u CNS-u. Zajedno sa infiltriranim leukocitima, aktivacija mikroglije igra ključnu ulogu u neuroinflamaciji. Astrociti su također glijalne stanice s neuroimunim funkcijama jer pregovaraju s mikrogijom, leukocitima i endotelnim stanicama, modulirajući i urođeni i adaptivni imunološki odgovor [20]. Aktivacija mikroglije i astrocita kao odgovor na upalne stimuluse (glioza) karakteriziraju velike ćelijske promjene koje uključuju proliferaciju, hipertrofiju i oslobađanje citokina [21]. GSK3 je bio uključen u razvoj glioze kao odgovor na LPS ili prekomjernom ekspresijom neuralnog GSK3 [22]. Takođe postoje dokazi da glijalna reaktivnost i neuroinflamacija izazvana GSK3 mogu biti posredovani aktivacijom NF-kB puta u mozgu [19,23]. Nasuprot tome, inaktivacija GSK3 smanjuje glijalnu reaktivnost, ograničava neuroinflamatorni odgovor i povećava antiinflamatornu CREB aktivnost u neuralnim ćelijama [24]. Shodno tome, sugerirano je da GSK3 igra fundamentalnu ulogu u napredovanju neuroinflamatornih poremećaja, kao što su Alchajmerova bolest i multipla skleroza [25]. Fosforilacija je regulatorni mehanizam aktivnosti GSK3 sa velikim implikacijama na kontrolu imunološkog odgovora. Dakle, inhibicija GSK3 klasičnom fosforilacijom Ser9 pojačava proizvodnju protuupalnih medijatora i smanjuje otpuštanje proinflamatornih citokina [26], iako je također uključena u rješavanje upale u modelu eksperimentalnog kolitisa izazvanog trinitrobenzen sulfonskom kiselinom. [27]. U mozgu, defektna inhibicija GSK3 fosforilacijom Ser9 povezana je sa upalnim neuropatologijama kao što su Parkinsonova bolest [28] i šizofrenija [29]. Nasuprot tome, uprkos visokim nivoima fosfo-Ser389 GSK3 pronađenim u mozgu [4], ostaje nepoznato da li ovaj put za inaktivaciju GSK3 igra ulogu u podešavanju neuroinflamacije. Ovdje istražujemo moguću ulogu Ser389 posredovane fosforilacijom GSK3 inaktivacije u neuroinflamaciji koristeći GSK3 KI miševe u kojima je GSK3 Ser389 zamijenjen Ala kako bi se spriječila fosforilacija GSK3 na C-terminalnom dijelu [7,8]. Naši rezultati otkrivaju da neuspjeh neaktivnog GSK3 fosforilacijom na Ser389 u fiziološkim uvjetima dovodi do kronične neuroinflamacije niskog stupnja, kao i nedostatka odgovora na upalne stimuluse kao što je LPS. Čini se da je ova kronična upala specifična za mozak jer periferni imuni sistem uglavnom nije pogođen. Takođe smo pokazali da odsustvo fosfo-Ser389 GSK3 u mozgu GSK3 KI miševa reguliše NF-kB signalizaciju, što je centralni događaj u kontroli neuroinflamacije. Stoga, naši nalazi pružaju podršku uključivanju GSK3 inaktivacije fosforilacijom Ser389 u upalne neuropatologije.
2. Rezultati
2.1. Neuspjeh da se inaktivira GSK3 fosforilacijom Ser389 dovodi do povećane bazalne neuroinflamacije
Inaktivacija GSK3 fosforilacijom na Ser9 je povezana sa anti-inflamatornim stadijem u mozgu [30]. Iako je inaktivacija GSK3 fosforilacijom na Ser389 važna za smanjenje neuronske smrti uzrokovane prekidima dvostrukih lanaca DNK u mozgu, nijedna studija nije istraživala može li ovaj put također regulirati neuroinflamatorni odgovor. Stoga smo koristili prethodno opisane GSK3 Ser389 KI miševe, u kojima je Ser389 zamijenjen sa Ala, da spriječimo fosforilaciju Ser389. Ispitivali smo rezidentne i infiltrirane imune ćelije u cijelom mozgu (osim malog mozga i olfaktornih lukovica) od WT i GSK3 Ser389 KI miševa mehaničkom disocijacijom tkiva i Percoll gradijentom, slijedeći prethodno optimizirani protokol za dobivanje uravnotežene mješavine rezidentnih i infiltriranih stanica. u mozgu, uključujući mikrogliju/makrofage, astrocite, infiltrirane neutrofile i limfocite [31]. Ćelije su zatim analizirane protočnom citometrijom koristeći standardne markere (Slika S1 u Dodatnim materijalima) [31–33]. Aktivirani i mirni mikroglija/makrofagi su identifikovani kao CD11b+CD45high i CD11b+CD45low, respektivno, dok je limfocitna populacija označena kao CD45+CD11b− [32,34]. Neutrofili su okarakterisani kao CD45+Ly6G+ ćelije; a astrociti su definisani unutar CD45− populacije ekspresijom antigena na površini ćelije-2 (ACSA-2). Ovaj marker se koristi za detekciju astrocita u razvoju i odraslih [35]. Povećana regulacija ACSA-2 je uočena u reaktivnim astrocitima povezanim s upalnim stanjima, kao što je autoimuna demijelinizacija [36]. Prethodno smo otkrili da se broj ACSA-2+ astrocita u mozgu miševa povećava nakon tretmana LPS, što dalje ukazuje da nivo ekspresije ACSA-2 korelira sa aktivacijom astrocita kao odgovorom na upalne stimuluse [31]. Iako se ACSA-2 također može eksprimirati u maloj subpopulaciji mikroglije i makrofaga [35], ove ćelije su unutar CD45+ populacije. Analiza protočne citometrije izolata moždanih ćelija kod miševa u fiziološkim uslovima otkrila je značajno povećanje frakcije aktiviranih mikroglija/makrofaga kod GSK3 Ser389 KI miševa u poređenju sa WT miševima (Slika 1a). Nasuprot tome, postotak mikroglije u mirovanju smanjio se u mozgu GSK3 Ser389 KI miševa (slika 1b). Pored toga, došlo je do značajnog povećanja prisustva ACSA-2+ astrocita (tj. aktiviranih astrocita) kod GSK3 Ser389 KI miševa (Slika 1c). Što se tiče infiltracije imunoloških stanica u mozgu, postojala je jasna akumulacija neutrofila u mozgu GSK3 Ser389 KI miševa u odnosu na WT miševe (Slika 1d), što dalje pokazuje prisutnost tekućeg upalnog odgovora u mozgu GSK3 Ser389 KI miševa pod fiziološkim uslovima. Međutim, učestalost CD45+CD11b− leukocita (pretežno limfocitnih ćelija) u mozgu nije bila pogođena kod GSK3 Ser389 KI miševa (Slika 1e). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da neuspjeh u inhibiciji GSK3 fosforilacijom na Ser389 dovodi do kroničnog urođenog inflamatornog odgovora u mozgu koji uzrokuje reaktivnost između mikroglije i astrocita.
Slika 1. Inaktivacija GSK3 fosforilacijom Ser389 utiče na populacije moždanih ćelija koje su uključene u neuroinflamaciju. Mozak i WT i GSK3 Ser389 KI miševa je uklonjen i obrađen za analizu protočne citometrije (a) CD11b++CD45 visoko aktivirane mikroglije/makrofaga, (b) CD11b++CD45 mikroglije u niskom stanju mirovanja, (c) ACSA -2+ astrociti, (d) Ly6G+ neutrofili i (e) CD11b− limfociti. Histogrami predstavljaju broj ćelija, izražen kao procenat CD45− ćelija (astrocita) ili CD45+ ćelija (sve ostale populacije). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM (n=7–9). Za poređenje genotipova primijenjen je Student t-test. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, divlji tip; KI i GSK3 Ser389 kucaju.
2.2. Nedostatak efekta fosforilacije GSK3 na Ser389 na ćelije slezene
Da bismo istražili da li je izmijenjeno inflamatorno stanje otkriveno kod GSK3 Ser389 KI miševa ograničeno na mozak ili je učinak također sistemski, izvršili smo analizu protočne citometrije za različite populacije stanica u slezeni. Neutrofili su identifikovani kao Ly6G+ ćelije. Ekspresija Ly6G bila je veoma varijabilna jer zavisi od faze sazrevanja ćelija, kao što je ranije prikazano [37]. Pored toga, monocitne mijeloidne ćelije su označene kao Ly6G–CD38+CD11b+ ćelije. Ovi monociti/makrofagi predstavljaju dvije jasno različite populacije na osnovu nivoa ekspresije CD38, kao što je ranije objavljeno [38]. CD8+ ćelije, CD4+ ćelije i B220+ ćelije (B ćelije) su također procijenjene (Slika S2 u Dodatnim materijalima).
Slika 2. Analiza protočne citometrije pokazuje slične populacije ćelija slezene kod WT i GSK3 Ser389 KI miševa. Nakon disocijacije ćelija slezene, protočna citometrija je korištena za procjenu broja (a) Ly6G+ neutrofila, (b) CD38+CD11b+ monocita/makrofaga, (c) CD4+ ćelija, (d) CD8+ ćelije, i (e) B220+ ćelije. Histogrami pokazuju brojeve ćelija izražene kao procenat ukupnih ćelija. Podaci odgovaraju srednjoj vrijednosti ± SEM (n=5–7). Za poređenje genotipova primijenjen je Student t-test. WT, divlji tip; KI, GSK3 Ser389 kucati.
2.3. LPS nije u stanju da poveća neuroinflamaciju kod miševa GSK3 Ser389 KI
Zatim smo istražili da li ukidanje fosforilacije Ser389, osim što uzrokuje bazalnu toničnu upalu, može utjecati i na upalni odgovor izazvan LPS-om. WT i GSK3 Ser389 KI miševima je intraperitonealno ubrizgana subletalna doza (0.5 mg/kg) bakterijskog lipopolisaharida (LPS). Inflamatorni odgovor mozga ispitan je tri dana kasnije jer je ranije pokazano da takav tretman izaziva upalu niskog stupnja u mozgu miševa [39,40]. Ovaj LPS odgovor također liči na kronično inflamatorno stanje uočeno kod nekoliko neuroloških bolesti, uključujući depresiju, anksioznost i Parkinsonovu bolest [41,42]. Kao što se i očekivalo, LPS je inducirao glijalnu reaktivnost kod WT miševa, što je određeno povećanjem učestalosti aktiviranih mikroglija/makrofaga (Slika 3a) i smanjenom učestalošću mikroglije u mirovanju (Slika 3b). Nasuprot tome, LPS nije uspio da izazove bilo kakav dalji upalni odgovor kod GSK3 Ser389 KI miševa (slika 3a,b). Tabela 1 direktno upoređuje veličinu LPS odgovora između dva genotipa. Osim toga, ovaj LPS tretman povećao je postotak ACSA-2+ astrocita kod WT miševa, kao što je ranije objavljeno [31], ali ne i kod GSK3 Ser389 KI miševa (Slika 3c). Što se tiče moždane infiltracije imunih ćelija, LPS je izazvao nakupljanje neutrofila kod WT miševa, ali nije imao efekta kod GSK3 Ser389 KI miševa (Slika 3d). Konačno, primjena LPS-a nije potaknula akumulaciju limfocita u mozgu ni kod WT ni kod GSK3 Ser389 KI miševa (Slika 3e). Sve u svemu, ova zapažanja ukazuju na to da je inaktivacija GSK3 fosforilacijom Ser389 ključna za sprečavanje toničnog upalnog stanja u mozgu, ali doprinosi akutnoj upali mozga kao odgovoru na stimuluse kao što je LPS.
Tabela 1. Razlike u LPS efektima između WT i GSK3 Ser389 KI miševa. Vrijednosti predstavljaju broj ćelija nakon LPS tretmana u svakom genotipu i izražene su kao povećanje u odnosu na kontrole tretirane nosačem (srednja vrijednost ± SEM). Zvezdice označavaju statistički značajne razlike između efekata LPS kod WT i GSK3 Ser389 KI životinja. WT, divlji tip; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolisaharid. *, p < 0.05; **, p < 0,01.
Slika 3. Neuroimune ćelije iz GSK3 Ser389 KI miševa ne reaguju na LPS. Odraslim miševima WT i GSK3 Ser389 KI intraperitonealno je ubrizgan LPS (0.5 mg/kg). Tri dana kasnije, populacije mozga (a) CD11b++CD45 visoko aktiviranih mikroglija/makrofaga, (b) CD11b+CD45 mikroglije u mirovanju, (c) ACSA-2+ astrocita, (d) Ly6G+ neutrofila, i ( e) CD11b- limfociti su procenjeni protočnom citometrijom. Histogrami pokazuju efekte LPS-a na broj ćelija u oba genotipa. Podaci su predstavljeni kao postoci CD45− ćelija (astrociti) ili CD45+ ćelija (sve ostale populacije), a vrijednosti odgovaraju srednjoj vrijednosti ± SEM (n=7–9). Student t-test je primijenjen za procjenu značajnosti promjena izazvanih LPS-om u svakom genotipu. ** p < 0.01. WT, divlji tip; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolisaharid.
Zatim smo ispitali mogući uticaj hipokampalne GSK3 Ser389 fosforilacije na bazalnu glijalnu aktivaciju i glijalan odgovor na upalne stimuluse. U tom cilju, Iba-1 označavanje je procijenjeno mikroskopski u dentat gyrusu (Slika 4a). Prvo su evaluirani WT miševi. Mikrogrami otkrivaju nisku bazalnu glijalnu aktivaciju, ali snažno povećanje glijalne imunoreaktivnosti kao odgovor na injekciju LPS (0.5 mg/kg, 3 dana) (Slika 4b). Kvantifikacija integrisane gustine za Iba-1 imunobojenje pokazala je vrijednosti koje su bile 53% veće kod WT miševa nakon tretmana (Slika 4d). Ove promjene su bile statistički značajne i u skladu su sa izraženom ćelijskom hipertrofijom uzrokovanom LPS-om u hipokampusu miša o kojoj je prethodno objavljeno [43,44].
Slika 4. Glioza kao odgovor na LPS je izmijenjena kod GSK3 Ser389 KI miševa. Odraslim miševima WT i GSK3 Ser389 KI intraperitonealno je ubrizgan LPS ili vehikulum (C). Nakon 3 dana, mozgovi su obrađeni za fluorescentnu mikroskopiju. (a) Presjek koronalnog hipokampusa prilagođen iz atlasa mozga miša [45] ukazuje na lokalizaciju slika, koje uključuju zupčani girus. (b) Sekcije mozga su imunoobilježene na mikroglije/makrofage markere Iba-1. Grafikoni prikazuju integrisanu gustinu Iba-1 imunoreaktivnosti, što je mjera glijalne reaktivnosti koja odražava i intenzitet i proširenje glijalnog bojenja. (c) Poređenje kontrolnih WT i KI životinja. (d) LPS odgovor u svakom genotipu miša. Sve vrijednosti su izražene uz povećanje u odnosu na WT kontrole tretirane vehikulom (srednja vrijednost ± SEM, n=4–5). Primijenjen je Studentski t-test. *, p < 0.05. Skala bar, 100 µm. WT, divlji tip; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, vozilo; LPS, lipopolisaharid.
Analiza hipokampusa Ser389 KI miševa otkrila je razlike u bazalnoj mikroglijalnoj aktivaciji u odnosu na WT miševe. Dakle, iako je vizuelna inspekcija mikrosnimaka pokazala umjerenu glijalnu aktivaciju kod mutantnih životinja (slika 4b), integrirana mjerenja gustoće pokazala su da je povećanje glijalne imunoreaktivnosti statistički značajno (slika 4c). Zanimljivo je da miševi Ser389 KI nisu pokazali znakove dalje aktivacije nakon tretmana LPS-om (slika 4b), a kvantitativna analiza je potvrdila da LPS nije bio u stanju povećati imunobojenje Iba-1 u hipokampusu (slika 4d), što sugerira da aktivacija glijalnih stanica putem LPS je poremećen u odsustvu fosforilacije GSK3 Ser389.
prednosti dodataka cistanche—protiv-inflamatorno
2.5. Periferni imuni odgovor na LPS nije bio pod utjecajem GSK3 Ser389 KI miševa
Naši prethodni eksperimenti otkrivaju duboke posljedice inaktivacije GSK3 fosforilacijom Ser389 na odgovor mozga na LPS. Zatim smo se pozabavili da li su slični efekti prisutni u sistemskom imunitetu. Pošto je poznato da LPS izaziva aktivaciju urođenih imunih ćelija slezene [46], populacije ćelija slezene iz WT i GSK3 Ser389 KI miševa su procenjene 3 dana nakon injekcije LPS (0.5 mg/kg). broj Ly6G+ neutrofila (Slika 5a) i CD38++CD11b++Ly6G− monocita/makrofaga (Slika 5b) značajno se povećao kod WT miševa kao odgovor na LPS tretman. Ovi LPS efekti, očekivani kod WT miševa, uočeni su i kod GSK3 Ser389 KI miševa (Slika 5a,b). Nisu dobijene razlike između genotipova ni kada su analizirane populacije limfocita iz slezene, jer je procenti CD4+ ćelija slezene (Slika 5c) i CD8+ ćelija (Slika 5d) smanjen LPS-om iu oba miševa lanca (smanjenje kod mutantnih miševa bilo je statistički značajno samo za CD4+ ćelije); i B220+ B ćelije nisu bile pod uticajem LPS-a nezavisno od genotipa (Slika 5e). Ova zapažanja su u suprotnosti s diferencijalnim efektima LPS-a koji se nalaze u mozgu oba genotipa. Dakle, dok su GSK3 Ser389 KI miševi otporni na neuroinflamaciju koju pokreće LPS, ovi miševi nisu sistemski desenzibilizirani na LPS. Stoga se čini da su efekti fosforilacije GSK3 Ser389 selektivni za mozak.
Slika 5. Sličan periferni imuni odgovor na LPS kod GSK3 Ser389 KI i WT miševa. Odraslim miševima WT i GSK3 Ser389 KI ip je ubrizgan LPS. Nakon 3 dana, stanice slezene su ekstrahirane i obrađene kako bi se protočnom citometrijom procijenio broj (a) Ly6G+ neutrofila, (b) CD38+CD11b+ monocita/makrofaga, (c) CD8+, (d) CD4+, i (e) B220+ ćelije. Histogrami pokazuju efekte LPS-a na broj ćelija, uključujući WT i KI miševe. Student t-test je primijenjen za procjenu značajnosti promjena izazvanih LPS-om u svakom genotipu. Prikazana je srednja vrijednost ± SEM (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, divlji tip; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitonealno; C, vozilo; LPS, lipopolisaharid.
2.6. LPS-indukovana aktivacija NF-κB puta u hipokampusu ukinuta je kod miševa GSK3 Ser389 KI
NF-κB je faktor transkripcije neophodan za LPS da izazove upalu [47]. Pored toga, pokazalo se da NF-κB reguliše GSK3 u mozgu [2,19,23]. Stoga smo ispitali aktivaciju NF-κB u mozgu kao odgovor na LPS analizom IKK fosforilacije, ranog koraka u putu aktivacije NF-kB. WT i GSK3 Ser389 KI miševima je ip primijenjen LPS (0.5 mg/kg) i nakon 4 h hipokampus je sakupljen. Ekstrakti cijelih stanica korišteni su za ispitivanje fosfo-IKK / i ukupnog IKK / Western blottingom. Kao što se očekivalo, LPS je povećao fosforilaciju IKK u hipokampusu kod WT miševa (slika 6a,b). Nasuprot tome, LPS nije uspio inducirati fosforilaciju IKK kod GSK3 Ser389 KI miševa (slika 6a,b). Aktivacija STAT3 je također povezana s upalom izazvanom LPS-om [48]. Stoga smo ispitali fosforilaciju STAT3 Western blot analizom. Za razliku od aktivacije NF-kB, fosforilacija STAT3 je snažno indukovana u hipokampusu i WT i GSK3 Ser389 KI miševa kao odgovor na LPS (Slika 6a,c). Stoga, sprečavanje inaktivacije GSK3 fosforilacijom Ser389 selektivno narušava NF-κB signalizaciju, što je u skladu sa ulogom GSK3 kao uzvodnog regulatora NF-κB puta u hipokampusu. Ovi rezultati sugeriraju da GSK3 put utječe na neuroinflamaciju kontroliranjem ključnih medijatora upale, kao što je NF-κB.
Slika 6. Neuspjeh da se inaktivira GSK3 fosforilacijom Ser389 različito utiče na NF-κB i STAT3 signalizaciju kod miševa tretiranih LPS. Aktivacija NF-κB i STAT3 puteva ispitana je u lizatima cijelih stanica iz hipokampusa 4 h nakon ip injekcije LPS-a ({{10}}.5 mg/kg) ili nosača (C) u oba WT i GSK3 Ser389 KI miševi. Blotovi ilustruju Western blot analizu fosfora-IKK / , ukupnog IKK / , fosfora-STAT3 i ukupnog STAT3. (a) Detekcija tubulina je uključena kao kontrola opterećenja. Povezani grafikoni odgovaraju (b) omjerima fosfo-IKK / /IKK / i (c) omjerima fosfo-STAT3/STAT3, dobijenim denzitometrijskom analizom Western blot traka. Student t-test je primijenjen za poređenje netretiranih kontrolnih (C) i životinja tretiranih LPS-om u svakom genotipu (srednja vrijednost ± SEM, n=5–6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Podaci su reprezentativni za četiri nezavisna eksperimenta za pIKK/IKK i tri nezavisna eksperimenta za pSTAT3/STAT3. WT, divlji tip; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitonealno; C, vozilo; LPS, lipopolisaharid.
3. Diskusija
U mozgu, disregulacija GSK3 aktivnosti povezana je s višestrukim neuropatologijama u kojima je kronična upala uobičajeno obilježje [25]. Budući da velika literatura podržava da inhibicija GSK3 fosforilacijom Ser9 pojačava regulaciju protuupalnih medijatora i smanjuje regulaciju proinflamatornih citokina [23,28,30], mehanizam koji se obično predlaže za objašnjenje defektne inaktivacije GSK3 u neuroinflamatornim patologijama je neuspjeh fosforilacije Ser9 [3]. Međutim, neuobičajeno visoke razine fosfo-Ser389 GSK3 su otkrivene u mozgu [4], što sugerira da ovaj alternativni put za inaktivaciju GSK3 također može igrati istaknutu ulogu u mozgu. Eksperimenti koji su ovdje predstavljeni otkrivaju implikaciju fosforilacije GSK3 Ser389 u neuroinflamaciji, što je dodatak prethodnim dokazima koji sugeriraju uključenost ovog puta u popravku DNK mozga i preživljavanje neurona [6,7]. Jedan od ključnih nalaza u ovom radu je da mozak GSK3 Ser389 KI miševa pokazuje trajnu gliozu i povećanu infiltraciju imunoloških ćelija, što je u skladu sa idejom da sprečavanje inaktivacije GSK3 kroz fosforilaciju Ser389 dovodi do neuroinflamacije. Podaci iz naših eksperimenata protočne citometrije jasno ukazuju na povećanu neuroinflamaciju kod ovih životinja, jer je broj aktiviranih mikroglija/makrofaga, ACSA 2+ astrocita i infiltriranih neutrofila u mozgu Ser389 GSK3 KI miševa bio značajno veći. Međutim, uprkos tome što je mikro-astroglioza jasno uočena protočnom citometrijom, analiza mikrografa hipokampusa iz delova mozga Ser389 GSK3 KI miševa otkrila je da je hipertrofija mikroglije/makrofaga bila samo blaga. Slični rezultati su uočeni kada su analizirana druga područja mozga kako bi se procijenio obim i intenzitet glioze (nije prikazano). Stoga zaključujemo da, u odsustvu proinflamatornih stimulusa, nedostatak fosforilacije GSK3 Ser389 dovodi do stepena neuroinflamacije koji treba klasifikovati kao niskog stepena. Brojne studije podržavaju povezanost između hiperaktivnosti GSK3 i neurodegeneracije kod neuroloških poremećaja [25]. U tom kontekstu, upalni odgovor koji smo uočili kod miševa Ser389 GSK3 KI mogao bi biti posljedica neurodegeneracije, jer su prethodne studije otkrile neuronsku smrt u korteksu i hipokampusu ovih životinja [6]. Ovo je u skladu sa zapažanjem da oštećenje DNK inaktivira GSK3 kroz fosforilaciju Ser389 kao mehanizam za sprečavanje ćelijske smrti i promoviranje popravke DSB-a [7,8]. Kao posljedica toga, mozak KI miševa, u kojem je spriječena fosforilacija Ser389, nije zaštićen od smrti neurona izazvane DSB-om. Veza između ekspresije fosfor-Ser389 GSK3 i preživljavanja ćelija je prvi put predložena u limfocitima, kao mehanizam uključen u adaptivni imuni odgovor. Tako je utvrđeno da odsustvo fosforilacije GSK3 Ser389 kod KI miševa izaziva nekroptozu u B ćelijama tokom njihovog kasnog sazrevanja, što je visokoupalni tip ćelijske smrti povezan sa nekoliko patologija [9]. Također je zanimljivo primijetiti da se ne samo fosforilacija Ser389 već i fosforilacija Ser9 može pokrenuti da inaktivira GSK3 kao odgovor na oštećenje DNK. Međutim, Ser389 GSK3 KI miševi imaju neurodegenerativni fenotip [6] koji nije prisutan kod Ser9 GSK3 KI miševa [49,50], što ukazuje da fosforilacija Ser389 igra specifične uloge u kontroli aktivnosti GSK3 i da postoje scenariji u kojima fosforilacija Ser9 ne može kompenzirati za gubitak fosforilacije Ser389. Shodno tome, intrigantna veza između deregulacije Ser389 GSK3, neuroinflamacije i neurodegeneracije koja je ovdje otkrivena, treba dalje istražiti kako bi se razjasnilo može li izmijenjena fosforilacija GSK3 na Ser389 biti ključni faktor u neuropatologijama u kojima je kronična upala karakteristična, kao što je Alchajmerova bolest. Pored toga, blaga, ali uporna aktivacija neuroimunih ćelija uočena kod GSK3 Ser389 KI miševa je u skladu s hipotezom da neuspjeh fosforilacije Ser389 može biti povezan s imunosenscencijom. Ovo je proces vezan za starenje karakteriziran padom imunoloških funkcija zajedno s povećanjem ekspresije proinflamatornih medijatora; što dovodi do kronične upale niskog stupnja [1,51]. Nekoliko autora je ukazalo na uključenost GSK3 deregulacije u upalu uzrokovanu starenjem [1,52]. Također je predloženo da abnormalna funkcija mikroglije uočena u kontekstu imunosenescencije mozga može na kraju uzrokovati neurodegeneraciju [53]. Dakle, ubrzana imunosenscencija kod miševa Ser389 GSK3 KI mogla bi doprinijeti gubitku neurona koji je ranije bio zabilježen kod ovih životinja [6]. LPS se intenzivno koristio za izazivanje upale i u "in vivo" i "in vitro" modelima. Međutim, postoje dokazi da primijenjena doza LPS-a u velikoj mjeri određuje tip induciranog inflamatornog odgovora [54–56]. Visoke doze LPS-a proizvode reakcije slične septičkom šoku; dok umjerene doze LPS-a izazivaju upornu upalu niskog stupnja koja je bliža onoj uočenoj kod mnogih kroničnih bolesti [42]. U tom kontekstu, važno je naglasiti da je doza LPS odabrana za naše eksperimente (0,5 mg/kg, ip) umjerena i daleko od LD50 prijavljene za LPS kod miševa (10-25 mg/kg) [57,58 ]. U skladu s prethodnim izvještajima [40,59], otkrili smo da takva doza LPS-a nije smrtonosna i dovoljna je da poveća gliozu i moždanu infiltraciju neutrofila kod WT životinja, dok infiltracija limfocita nije pogođena. Zanimljivo je da je takav umjeren (ali značajan) LPS odgovor ukinut u mozgu KI miševa sa poremećenom inaktivacijom GSK3 fosforilacijom Ser389. Prema ovom zapažanju, produžena hiperaktivacija GSK3 u mozgu može na kraju smanjiti osjetljivost na proinflamatorne uvrede. Važno je napomenuti da je defektni odgovor na LPS kod mutantnih miševa kompatibilan s mehanizmom imunotolerancije ili rezistencije, uobičajenim procesom u CNS-u koji ima za cilj smanjenje aktivacije glijalnih stanica i ograničavanje oštećenja mozga od prekomjerne upale [60,61]. U skladu s ovom idejom, prethodna studija je pokazala da aktivacija GSK3 kod miševa može izazvati imunotoleranciju i potisnuti LPS odgovore [62].
Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem
Također je zanimljivo uzeti u obzir da efekti na mozak opisani u ovoj studiji pokazuju visoku specifičnost. Dakle, za razliku od mozga, većina populacija ćelija slezene procenjenih u WT i Ser389 GSK3 KI životinja je imala isti profil u nestimulisanim uslovima, kao i sličan odgovor na LPS. Ovo sugerira da put inaktivacije GSK3 ovisan o fosforilaciji Ser389 igra specifične uloge u regulaciji neuroinflamacije. U skladu sa ovom hipotezom, moždane ćelije pokazuju visoku ekspresiju fosfo-Ser389 GSK3 u poređenju sa drugim tkivima, a ova ekspresija je strogo regulisana tokom razvoja mozga [5]. Konačno, prema našim nalazima, regulacija GSK3 fosforilacijom na Ser389 je specifično posredovana NF-kB signalnim putem, budući da aktivacija STAT3 nije bila pogođena u Ser389 GSK3 KI. Mnogi nizvodni upalni medijatori su regulirani aktivacijom NF-kB, uključujući citokine, receptore, faktore transkripcije i enzime. Identifikovanje na koje od ovih NF-kB ciljeva utiče fosforilacija Ser389 GSK3 je izvan okvira našeg rada, ali će to biti uzbudljiv cilj za buduća istraživanja koja imaju za cilj da razjasne mehanizme neuroinflamacije.
4. Materijali i metode
4.1. Životinje
C57BL/6J miševi divljeg tipa (WT) kupljeni su od Jackson Laboratories. C57BL/6 GSK3 Ser389 KI miševi, kod kojih je Ser389 ostatak GSK3 zamijenjen sa Ala kako bi se spriječila fosforilacija, generirani su kao što je prethodno opisano [8]. Svi miševi su bili smješteni u objektu za životinje povezanom s Medicinskom školom Albacete pod 12-ciklusom svjetlo/mrak. Hrana i voda su davani ad libitum. Za eksperimente su korišteni odrasli miševi stari četiri do šest mjeseci.
4.2. LPS administracija
Da bi izazvali upalni odgovor, miševi su primili jednu intraperitonealnu (ip) injekciju {{0}}.5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (serotip typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Španija) rastvoren je u sterilnom, bez endotoksina 0.9% fiziološkom rastvoru pri 10 mg/mL. Tri dana nakon tretmana, miševi su eutanazirani, a mozak i slezena su uklonjeni za imunohistohemijsku ili protočnu citometrijsku analizu glijalnih stanica i infiltriranih imunoloških stanica. Za Western blotting analizu, životinje su eutanazirane 4 h nakon ip injekcije 0,5 mg/kg LPS-a, jer je ranije objavljeno da LPS reguliše upalne proteine u mozgu miševa i pacova 2-4 h nakon ip primjene [63,64].
4.3. Protočna citometrija
Za analizu moždanog tkiva i ćelija slezene protočnom citometrijom, životinje su anestezirane ip injekcijom tribrometanola, što je preporučeno za akutne terminalne studije. Niska doza tribrometanola koja se koristi (200 mg/kg) daje laganu anesteziju bez ozbiljnih štetnih efekata ili uticaja na ekspresiju upalnih citokina [65]. Zahvati na životinjama rađeni su nakon provjere odsustva refleksa.
4.3.1. Disocijacija moždanog tkiva i izolacija neuralnih ćelija Percoll Gradijenta
Miševi su intrakardijalno perfuzirani sa 50 mL 0,9% NaCl prije prikupljanja tkiva kako bi se uklonile cirkulirajuće ćelije iz krvnih sudova mozga. Nakon perfuzije, mozgovi su uklonjeni, moždane ovojnice i horoidni pleksus su pažljivo odvojeni, a mali mozak i olfaktorne lukovice su odbačeni. Preostalo tkivo je stavljeno u hladni Hankov balansirani rastvor soli, koji je bez kalcijum hlorida i magnezijum hlorida (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Španija, 14175). Uzorci tkiva su zatim fino iseckani skalpelom pre varenja. Usitnjeno tkivo je zatim stavljeno u MACS C epruvete (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Španija, 130-093-237) u ukupnoj zapremini od 5 mL i obrađeno mehaničkim disocijatorom na 6 rpm tokom 30 min. Enzimska disocijacija je izvedena prema našem vlastitom protokolu [31] korištenjem papaina (100 U; Worthington, LK003178) i dispaze II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Španija, D4963) u Earleovom balansiranom rastvoru soli (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgSO4; Gibco, Madrid, Španija, 24010). DNKaza I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Španija, DN25) je dodana u rastvor da bi se uklonila sluz DNK koja negativno utiče na vitalnost ćelija [66]. Prije upotrebe, papain je aktiviran 30 minuta na 37 ◦C u 5% CO2. Da bi se zaustavila probava, uzorci su razrijeđeni hladnim HBSS i stavljeni na led. Ova otopina je zatim pipetirana 10 puta pomoću pipeta od 5 mL i filtrirana kroz ćelijsko cjedilo od 70 µm (BD, 352350). Rezultirajuća jednoćelijska suspenzija je centrifugirana na 300×g 10 minuta na sobnoj temperaturi. 30% PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Španija, 17-0891-01) gradijent je korišten za uklanjanje mijelina i obogaćivanje homogenata u održive glijalne ćelije. U tu svrhu pripremljen je osnovni rastvor izotoničnih Percoll-a (SIP) (9:1 Percoll u 10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185), a ćelijske pelete su resuspendirane u 30% (v/ v) SIP (u 1× HBSS). Gradijent od 30% Percoll je izveden dodavanjem 3 mL SIP u 7 mL 1× HBSS koji sadrži suspenziju ćelija u polipropilenskoj epruveti od 14 mL. Svaki gradijent je centrifugiran bez kočnice na 300 × g tokom 30 minuta na 18 ◦C. Nakon centrifugiranja, ćelije iz donjeg sloja su sakupljene, isprane sa 1× HBSS, centrifugirane 10 minuta na 300× g i resuspendirane u 10 mL 1× pufera za lizu crvenih krvnih zrnaca na 4 ◦C. Nakon lize, ćelijska suspenzija je centrifugirana na 300 × g 10 minuta, a rezultirajuća ćelijska peleta je konačno resuspendirana u 50 µL pufera za blokiranje prije bojenja za protočnu citometriju.
4.3.2. Disocijacija ćelija slezene
Slezene su stavljene na Petrijevu posudu koja sadrži RPMI 1640 i izrezane na male komadiće. Dobijeno tkivo je propušteno u 70 µm ćelijsko cjedilo (BD, 352350) i razbijeno kružnim pokretima rebrastim vrhom klipa šprica. RPMI 1640 je zatim propušten kroz cjedilo. Dezintegrisano tkivo je prebačeno u epruvete od 50 mL (Sarstedt, Barcelona, Španija, 62.547.254) i centrifugirano na 100 g 10 min. Supernatant koji je sadržavao suspenziju ćelija je zatim sakupljen i ponovo centrifugiran na 300 g tokom 10 minuta. Dobijeni supernatant je uklonjen, a talog je resuspendiran u 10 mL fosfatnog pufera (PBS) sa 1% FBS da bi se izbrojio broj ćelija pod mikroskopom, nakon čega je ponovo centrifugiran na 300 g tokom 5 minuta. Korišteno je samo 500,000 ćelija po uzorku. Svaki uzorak je zatim resuspendiran u 50 µL pufera za blokiranje prije bojenja za protočnu citometriju.
4.3.3. Bojenje ekstracelularnom protočnom citometrijom
Tabela 2. Antitijela i reagensi korišteni za analizu protočnom citometrijom.
4.4. Imunohistohemija
Miševi su duboko anestezirani i intrakardijalno perfuzirani fiziološkim rastvorom {{0}}.9% (w/v). Njihovi mozgovi su sakupljeni i naknadno fiksirani sa 4% paraformaldehida tokom 24 h. Nakon post-fiksacije, krioprotecirani su sa 30% saharoze i zamrznuti na -20 ◦C do sekcije. Presjeci tkiva (20 µm) su isječeni pomoću kriostata (ThermoFisher, Microm™ HM550), odmrznuti postavljeni na Superfrost Plus stakalce (ThermoFisher, J1800AMNZ) i konačno pohranjeni na -20 ◦C do bojenja. Imunohistohemijsko bojenje preseka tkiva izvedeno je kao što je opisano ranije [67]. Primarne i sekundarne otopine antitijela razrijeđene su u 1× PBS sa 1% BSA. Sekcije su inkubirane sa primarnim antitijelom anti-zečjeg Iba-1 (razrjeđenje 1:500; Wako Chemicals, Barcelona, Španija, 019-19741). Alexa Fluor 488-konjugirani kozji anti-zečji IgG (razrjeđenje 1:2000; ThermoFisher, Madrid, Španija, A11031) korišteno je kao sekundarno antitijelo. Uključeno je odgovarajuće tkivo pozitivne kontrole, kao i primarne i sekundarne negativne kontrole. Slike fluorescentnog označavanja su dobijene pomoću ZEISS Apotome. 2 mikroskop sa aksiom 503 mono digitalnim fotoaparatom i Zen Blue upravljačkim softverom verzije 2.3 (Carl Zeiss). Za vizualizaciju hipokampusa korišten je 10× objektiv (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR). Integrisana gustina unutar regiona od interesa je izračunata pomoću softvera ImageJ. Ovaj parametar odgovara zbiru vrijednosti intenziteta za svaki piksel u odabranoj regiji. Stoga se koristi za kvantifikaciju broja obojenih ćelija u kombinaciji sa intenzitetom bojenja svake ćelije.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
4.5. Western blot analiza
Mozak miša je brzo uklonjen, a hipokampusi su odmah secirani i zamrznuti. Tkivo je pripremljeno korišćenjem pufera za hipertoničnu lizu koji sadrži inhibitore proteaze kao što je prethodno opisano [68]. Primarna korišćena antitela bila su anti-zečji fosfor-IKK / (razblaživanje 1:1000; Cell Signaling, Alcobendas, Španija, 2861), anti-zečja IKK / (razblaživanje 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Nemačka, sc{{ 9}}), antizečji fosfor-STAT3 (1:1000 razrjeđenje; Cell Signaling, 9145) i anti-miš STAT3 (1:1000 razrjeđenje; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-miš-tubulin (1:2000 razrjeđenje; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) je korišten kao kontrola punjenja. Anti-zečji HRP (razrjeđenje 1:5000; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, SAD, 111-035-144) i anti-mišji HRP (1:5000 razrjeđenje; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003) korišteni su kao sekundarna antitijela . Kvantifikacija proteinskih traka izvršena je analizom denzitometrije trake pomoću NIH ImageJ softvera (verzija 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, pristupljeno 1. marta 2022.). Da bi se osigurala jednaka opterećenja, integrirana gustina dobivena za svaki pojas je izražena kao relativna vrijednost u odnosu na odgovarajuću kontrolu opterećenja u domaćinstvu.
4.6. Statistička analiza
Rezultati su statistički analizirani pomoću softvera GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti (SEM) općenito četiri nezavisna eksperimenta (n {{0}}-9). Nakon potvrde normalne distribucije podataka Shapiro-Wilkovim testom, statistička značajnost između dvije grupe određena je Studentovim t-testom za parametarske podatke. Razlike su se smatrale statistički značajnim kada su vrijednosti vjerovatnoće (p) bile manje od 0.05 (*), 0,01 (**) ili 0,001 (***). Slike pokazuju reprezentativne eksperimente.
5. Zaključci
Ukratko, naši nalazi pokazuju da neuspjeh inaktivacije GSK3 fosforilacijom Ser389 dovodi do kronične upale i tolerancije endotoksina i da inhibicija GSK3 fosforilacijom Ser9 i Ser389 igra komplementarnu, a ne redundantnu ulogu u neuroimunom odgovoru. Stoga bi trebalo istražiti specifične posljedice fosforilacije GSK3 Ser389 na neuropatologiju i starenje mozga.
Reference
1. Souder, DC; Anderson, RM Rastuća GSK3 mreža: Implikacije za istraživanje starenja. Geroscience 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Zahtjevi za glikogen sintazu kinazu-3 u preživljavanju stanica i aktivaciji NF-κB. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Glamur i sumor glikogen sintaze kinaze-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Drvo, CD; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; et al. Fosforilacija p38 MAPK kao alternativni put za inaktivaciju GSK3beta. Science 2008, 320, 667–670. [CrossRef]
5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Regulacija GSK3 fosforilacijom Ser 389 tokom neuralnog razvoja. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Hare, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Neuspjeh da se inaktivira nuklearni GSK3 od strane Ser 389-fosforilacije dovodi do fokalne neuronske smrti i produženog odgovora na strah. Neuropsychopharmacology 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]
7. Hare, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; King, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Dvije sedmice varijabilnog stresa povećavaju nivoe gama-H2AX u jezgru mišjeg kreveta stria terminalis. Neuroscience 2018, 373, 137–144. [CrossRef]
8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. Inaktivacija nuklearnog GSK3beta fosforilacijom Ser (389) promoviše fitnes limfocita tokom odgovora na prekid dvostrukog lanca DNK. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]
9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Nekroptoza i njena uloga u upali. Nature 2015, 517, 311–320. [CrossRef]
10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Pod stresom i upalom, može li se kriviti GSK3? Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]
11. Beutler, B.; Rietschel, ET Urođeni imunološki senzor i njegovi korijeni: priča o endotoksinu. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Dinamička modulacija urođenog imunološkog odgovora različitim dozama lipopolisaharida (LPS) u ljudskim monocitnim stanicama. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]
13. Lu, YC; Yeh, WC; Ohashi, PS LPS/TLR4 put transdukcije signala. Cytokine 2008, 42, 145–151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, SY GSK3 inhibitorni peptid štiti miševe od endotoksinskog šoka izazvanog LPS-om. Immune Netw. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Ponovno razmatranje uloge GSK3, modulatora urođenog imuniteta, u idiopatskom miozitisu inkluzijskog tijela. Ćelije 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Nova antiinflamatorna uloga glikogen sintaze kinaze-3beta u inhibiciji faktora tumorske nekroze-alfa- i interleukina-1beta-inducirane ekspresije inflamatornog gena. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: Kinase Balancing Promotion and Resolution of Inflammation. Ćelije 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, E.; Jope, RS Proizvodnja interleukina-6 izazvana lipopolisaharidom je kontrolirana glikogen sintazom kinazom-3 i STAT3 u mozgu. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]
19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Inaktivacija glikogen sintaze kinaze-3 inhibira proizvodnju faktora tumorske nekroze u mikrogliji modulacijom nuklearnog faktora κB i signalnih kaskada MLK3/JNK. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]
20. Priego, N.; Valiente, M. Potencijal astrocita kao imunomodulatora u tumorima mozga. Front. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]
21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Uključenost mikroglije i astrocita u neurodegeneraciju i rak mozga. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Smanjenje nuklearnog beta-katenina, tau hiperfosforilacije i neurodegeneracije kod GSK-3beta uslovnih transgenih miševa. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; et al. Inhibicija Gsk3b smanjuje Nfkb1 signalizaciju i spašava sinaptičku aktivnost kako bi se poboljšao fenotip Rettovog sindroma kod Mecp2-nokaut miševa. Cell. Rep. 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Proizvodnja citokina posredovana receptorima sličnim Tollu je različito regulirana kinazom glikogen sintaze. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [CrossRef]
25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mehanizmi i terapeutske implikacije GSK-3 u liječenju neurodegeneracije. Ćelije 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kinaza Akt1 kontroliše odgovor makrofaga na lipopolisaharid regulacijom mikroRNA. Imunitet 2009, 31, 220–231. [CrossRef]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL-13 upravlja rješavanjem kronične crijevne upale putem fosforilacije kinaze glikogen sintaze-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]
28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glikogen sintaza kinaza-3beta je povezana sa Parkinsonovom bolešću. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]
29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. GSK{1}} parametri u limfocitima shizofrenih pacijenata. Psychiatry Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): Inflamacije, bolesti i terapeutici. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]
31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernández, M.; Tranque, P. Disocijacija mozga novorođenčadi i odraslih miševa za istovremenu analizu mikroglije, astrocita i infiltrirajućih limfocita protočnom citometrijom. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. Optimizovana metoda za obradu mišjeg CNS-a za simultanu analizu neuralnih ćelija i leukocita protočnom citometrijom. J. Neurosci. Metode 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG Metoda zasnovana na imunoafinitetu za izolaciju ultračistih odraslih astrocita zasnovana na ciljanju ATP1B2 ACSA-2 antitijela. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Upotreba protočne citometrije za procjenu vremenskih promjena u inflamatornim stanicama nakon fokalne cerebralne ishemije kod miševa. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninković, J.; et al. Anti-ACSA-2 definiše novo monoklonsko antitijelo za prospektivnu izolaciju živih neonatalnih i odraslih astrocita. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Analiza ekspresije gena endokanabinoidne signalizacije astrocita i mikroglije tokom autoimune demijelinizacije. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh zreli i Ly6Gint nezreli neutrofili doprinose eradikaciji S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Chew, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; et al. Imunohistohemijsko ocjenjivanje CD38 u mikrookruženju tumora predviđa odgovor na anti-PD-1/PD-L1 imunoterapiju kod hepatocelularnog karcinoma. J. Immunother. Rak 2020, 8, e000987. [CrossRef]
39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B suzbija upalu u mozgu miša izazvanu lipopolisaharidom (LPS). Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; et al. Uloga neuroinflamacije u amiloidnoj patologiji mozga izazvanoj hipertenzijom. Neurobiol. Starenje 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]
41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS aktivira neuroinflamatorne puteve da izazove depresiju u stanju nalik Parkinsonovoj bolesti. Front. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Neuralni i bihevioralni odgovori na upalu niskog stupnja. Behav. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolisaharid inducira aktivaciju neuroglije i aktivaciju NF-κB u moždanoj kori odraslih miševa. Lab. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]
44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Litijum ublažava neurotoksičnost izazvanu lipopolisaharidima u korteksu i hipokampusu mozga odraslih pacova. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Paxinos, G.; Franklin, KB Mouse Mouse in Stereotaxic Coordinates. 2001. Dostupno na internetu: https://books.google.es/books/ about/The_Miš_Mozak_u_Stereotaxic_koordinati .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (pristupljeno 1. marta 2022.).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Slezena u lokalnoj i sistemskoj regulaciji imuniteta. Imunitet 2013, 39, 806–818. [CrossRef]
47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-κB signalizacija u inflamaciji. Signal Transduct. Target. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balić, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. STAT3 fosforilacija serina je potrebna za TLR4 metaboličko reprogramiranje i ekspresiju IL-1. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Wnt skup glikogen sintaze kinaze 3beta je kritičan za neuronsku smrt uzrokovanu trofičkom deprivacijom. Mol. Cell. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]
50. Eom, T.; Jope, RS Blokirana inhibitorna serin-fosforilacija kinaze glikogen sintaze-3 / ometa in vivo proliferaciju neuronskih prekursora. Biol. Psihijatrija 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Hronična upala (upala) i njen potencijalni doprinos bolestima povezanim sa starenjem. J. Gerontol. Ser. Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]
53. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA Uloga nezrelih mijeloidnih ćelija u imunološkom starenju. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Y.; Le, W. Diferencijalne uloge M1 i M2 mikroglije u neurodegenerativnim bolestima. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Sistemska inflamacija i mikroglijalna aktivacija: Sistematski pregled eksperimenata na životinjama. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Heterogenost zavisna od regije mozga i razlika zavisna od doze u povećanju prolazne populacije mikroglije tokom upale izazvane lipopolisaharidom. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [CrossRef]
57. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Mikroglijalna i astrocitna aktivacija specifična za regiju mozga kao odgovor na sistemsko izlaganje lipopolisaharidima. Front. Aging Neurosci. 2022, 14, 910988. [CrossRef]
57. Radulović, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injekcije lipopolisaharida miševima kako bi se oponašalo ulazak proizvoda dobivenih od mikroba nakon proboja crijevne barijere. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]
58. Fink, MP Životinjski modeli sepse. Virulence 2014, 5, 143–153. [CrossRef]
59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Uloga endotelnog TLR4 za regrutaciju neutrofila u mikrožile centralnog nervnog sistema u sistemskoj upali. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]
60. Beurel, E. HDAC6 reguliše LPS-toleranciju u astrocitima. PLOS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]
61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Zaštitni efekti tolerancije endotoksina na perifernu neuroinflamaciju izazvanu lipopolisaharidima i dopaminergičke neuronske ozljede. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Faktor tumorske nekroze indukuje unakrsnu toleranciju na endotoksin u makrofagima posredovanu GSK3 kinazom. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. katalitički neaktivni protein povezan s fosfolipazom C reguliše anoreksiju izazvanu lipopolisaharidima hipotalamusa uzrokovanu upalom hipotalamusa kod miševa. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin stimuliše SIRT 1/Nrf2 signalni put suprotstavljajući se oksidativnom stresu izazvanom lipopolisaharidom (LPS) kako bi spasio postnatalni mozak štakora. CNS Neurosci. Ther. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetika proinflamatornih citokina nakon intraperitonealne injekcije tribromoetanola i kombinacije tribromoetanola/ksilazina kod ICR miševa. Lab. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Moller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Izolacija i protočna citometrijska analiza imunoloških ćelija iz ishemijskog mozga miša. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Odgovor transkripcionog faktora NFATc3 na ekscitotoksične i traumatske inzulte mozga: Identifikacija subpopulacije reaktivnih astrocita. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]
69. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Ekspresija selenoproteina S u reaktivnim astrocitima nakon ozljede mozga. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]
