materijali i metode

6. Testovi ćelijske apsorpcije

Internalizacija EV-a u ćelije je praćena prvim bojenjem LEV-a i SEV-a lipofilnim DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD). Nakon tretiranja ćelija obojenim EV tokom 1, 3, 6, 12, 24 i 48 h, medij za rast je uklonjen i ćelije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida (Wako, Japan). Dodan je Hoechst 33342 (Invitrogen) i ćelije su inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi da bi se jezgre obojile (plavo). Konačno, ćelije su isprane PBS-om koji sadrži 1 posto goveđeg serumskog albumina, a fluorescencija (crvena i plava) je uočena pod fluorescentnim mikroskopom (Leica Microsystems, Wetzlar, Njemačka). Najmanje tri polja su odabrana i analizirana pomoću softvera ImageJ.

7. Mjerenje sadržaja melanina

Da bi se procijenio sadržaj melanina, ćelije melanoma B16BL6 su prvo inokulirane u 24-ploče (5 × 104 ćelije/jažici) u zapremini od 500 μL. Nakon 24 h inkubacije, ćelijesu tretirani samo sa 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ili 50 μL LEVs i SEVs pri 1, 5 i 10 µg/mL tokom 48 sati. Nakon tretmana, ćelije su isprane PBS-om, a zatim inkubirane sa 2,5 posto tripsina (Gibco, Thermo Fisher Scientific) za izolaciju. Ćelijske mikrosfere su rastvorene u 1n rastvoru natrijum hidroksida (Sigma-Aldrich) koji sadrži 1 procenat DMSO (Sigma-Aldrich) tokom 1 sata na 80 stepeni. Ćelijski lizati su prebačeni u ploču sa 96-jažicom i sadržaj melanina je određen mjerenjem apsorbancije na 405 nm koristeći enzimski marker (BioTek). Sadržaj melanina je određen korištenjem standardne krive melanina konstruisane od 0-100 µg/mL sintetičkog rastvora melanina (Sigma-Aldrich) (ekstracelularne vezikule Slika kako slijedi). Sadržaj melanina je izračunat poređenjem sa kontrolama.

8. Test aktivnosti tirozinaze

Aktivnost TYR mjerena je pomoću aktivnosti L-DOPA oksidaze. B16BL6 ćelije su inokulirane u -MEM mediju koji sadrži 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) i kultivisane pri gustini od 1 × 105 ćelija/jažici u 24-pločama za kulturu jažica. Nakon tretiranja ćelija sa 50 μL LEV-a i SEV-a u koncentracijama od 10, 50 i 100 µg/mL tokom 24 h, ćelije su isprane PBS-om i lizirane sa 1 posto Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Lizirane ćelije su inkubirane na - 80 stepenu 30 minuta, a zatim liofilizirane i pohranjene na sobnoj temperaturi 10 minuta. Dobijeni uzorci su bistreni centrifugiranjem na 12,000 × g tokom 15 minuta, nakon čega je dodato 2 mg/mL L-DOPA (Sigma-Aldrich) i inkubirano na 37 stepeni 1 h. Apsorpcija je zatim izmjerena na 490 nm pomoću enzimskog markera (BioTek). Apsorbancija je zatim izmjerena na 490 nm koristeći BioTek.

Kliknite ovdje da dobijeteCistanche koristi od izbjeljivanja kožeikoji su efekti Cistanche tubulosa

9. Western blot analiza

Nivoi proteina povezani sa antimelanogenim putem određivani su intracelularno Western blot analizom ekstrakata celih ćelija. Zapremina od 500 μL B16BL6 ćelija mišjeg melanoma je inokulirana u 24-ploče (1 × 105 ćelija/jažici). Ćelije su lizirane inkubacijom u RIPA puferu (Thermo Fisher Scientific) tokom 20 minuta u prisustvu mješavine inhibitora proteaze (Roche, Njemačka) i tretirane sa 50 μL 10, 50 i 100 μg/mL EV tokom 24 h. Ćelijski lizati su centrifugirani na 17 709 g tokom 15 minuta, a koncentracija proteina u rezultirajućim lizatima je određena korištenjem kompleta za analizu BCA (Thermo Fisher Scientific). Jednake količine proteina (10-20 ug/uzorak) ubačene su u jažice Bolt 4-12 posto Bis-Tris Plus gelova (Invitrogen) i elektrotransferirane na PVDF (poliviniliden fluorid) membrane (GE Healthcare, Chicago, IL, SAD). Membrane su isprane tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0,2 posto (v/v) ten -20 (TBST), zatvorene TBST koji sadrži 5 posto (w/v) obranog mlijeka (Gibco, Thermo Fisher Scientific) tokom 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirano na 4 stepena u rastvoru primarnog antitela razblaženom sa 1 procentom (w/v) obranim mlekom. Inkubacija je obavljena preko noći. Primarna korištena antitijela uključivala su anti-TRP-1 (1:1000), anti-TRP-2 (1:1000) i anti-MITF(1:1000) antitijela iz Abcam, Cambridge, UK; anti-TYR (1:500) antitijela iz Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Anti{40}}antitijelo (1:500; Santa Cruz) korišteno je za standardizaciju na nivou proteina. Primarna antitijela su otkrivena sekundarnim antitijelima označenim s peroksidazom hrena (HRP) iz Genetexa (Irvine, Kalifornija, SAD). Membrane su isprane sa TBST i inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi sa razblaženjem 1:2000 sekundarnog antitela u TBST. Signal generiran nakon pranja membrane TBST-om i inkubacije sa reagensom poboljšane hemiluminiscencije (ECL) (GE Healthcare) detektovan je korištenjem ImageQuant 350 gel sistema za snimanje (GE Healthcare).

10. Elektronska mikroskopska detekcija intracelularne proizvodnje melanina

Ćelije su obrađene sa LEV ili SEV i inkubirane 48 h. Nakon tretmana, ćelije su fiksirane inkubacijom sa 200 mM kakodilatnog pufera koji sadrži 8 posto glutaraldehida i 20 posto paraformaldehida (Wako). Nakon što su dehidrirani etanolom, pripremljeni su ultra-tanki rezovi koristeći Leica EM UC7 mikrotom (Leica) i sakupljeni na 200-mrežastoj bakrenoj mreži. Sekcije su obojene sa 1 posto uranil acetata i olovnog citrata, a slike su dobijene transmisionim elektronskim mikroskopom JEOL JEM 1010 (JEOL) na 80 kV.

Ekstrakt Cistanche

11. Mjerenje efekta izbjeljivanja pomoću modela ljudske kože

Model ljudske kože derm-me (Tego Science, Seul, Koreja) korišten je za testiranje efekta izbjeljivanja LEV-a. Ljudsko kožno tkivo je tretirano sa 10 μg/mL leva tokom 7 dana kao negativna kontrola. Koncentracija arbutina bila je 70 µg/mL. Ljudsko kožno tkivo je otopljeno u 1 N NaOH i mjerena je apsorpcija na 405 nm pomoću enzimskog markera (BioTek) da bi se odredio sadržaj melanina. Sedmog dana upoređena je pigmentacija kože mikroskopskom analizom uzoraka obojenih Fontanom - masonom. Za bojenje po Fontana-Massonu, uzorci kože su fiksirani preko noći na sobnoj temperaturi u 4 posto paraformaldehida (Waco), razrezani na dijelove i ugrađeni u parafinski vosak. Parafinski delovi su zatim zagrevani u rerni na 60 stepeni 1 h da se osuše. Sekcije su zatim tri puta natopljene ksilenom, dva puta u 95-postotnom etanolu i dva puta u 100-postotnom etanolu, a zatim isprane destilovanom vodom. Bojenje po Fontana-Massonu izvršeno je amonijačnim rastvorom srebra na 56 stepeni i isprano destilovanom vodom. Stakalca su zatim fiksirana u 0,2 posto rastvora zlatnog hlorida i uronjena u 5 posto rastvor natrijum tiosulfata na sobnoj temperaturi. Konačno, pločice su dehidrirane u svježem alkoholu.

12. Statistička analiza

Podaci dobijeni iz eksperimenata izraženi su kao srednja vrijednost ± SEM. Izveli smo eksperimente sa četiri serije aktivnosti, sadržaja melanina i aktivnosti TYR (dodatna slika S3). Jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA) i Dunnett-ov test izvedeni su korištenjem GraphPad Prism-a (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). p < razlike; 0.05, p < 0.01, p < 0,001 smatrani su statistički značajnim.

Ekstrakt Cistanche tubulosa

Diskusija

Za razliku od većine eukariotskih ćelija, biljke imaju složeni stanični zid, koji predstavlja važnu prepreku kretanju egzosoma. Kao rezultat toga, biljne stanice oslobađaju egzosome kroz niz multivezikularnih tijela spojenih sa plazma membranom. Sekretorni proizvodi oslobođeni biljnim izlučevinama se talože unutar periplazmatskog jaza pored plazma membrane; dok se akumuliraju, stvaraju pritisak koji omogućava izlučivanju da pređe barijeru ćelijskog zida. Kao rezultat toga, izlučeni materijal, uključujući egzosome, može se osloboditi bez potrebe za energijom. EV biljnog porijekla su slične veličine ili veće od prirodnih egzozoma životinjskih stanica i slični su onima uočenim u egzosomalnoj tekućini suncokreta (50-200 nm) i Arabidopsis EV (50-300 nm). Efikasnost ćelijske apsorpcije se smatra ključnom determinantom efikasnosti, budući da su mete mnogih terapeutskih agenasa locirane intracelularno. Stoga smo odredili optimalno vrijeme i koncentraciju apsorpcije ćelija melanoma i uočili brzi prijenos LEV-a i SEV-a do stanica melanoma unutar 12 sati.

TYR je glikoprotein koji katalizuje konverziju l-tirozinaze u L-DOPA, korak koji ograničava brzinu u sintezi melanina. Oba EV pokazuju antimelanogeni efekat, ali je antimelanogeni efekat LEV-a znatno veći od efekta SEV.

Proizvodnja melanina je regulirana -MSH-MC1R, a poznato je da inhibicija PKC smanjuje pigmentaciju kože i kose. Međutim, mnoge genetske, biohemijske i farmakološke studije ukazuju na to da je signalni put -MSH-MC1R glavni pokretač melanogeneze. Iako naši eksperimenti nisu pokazali direktnu interakciju između MITF-a i TYR-a, pokazano je da LEV-ovi inhibiraju melanogenezu smanjujući ekspresiju MITF-a kroz UV-zavisni put -MSHMC1R, što zauzvrat smanjuje ekspresiju TYR, TRP-1, i TRP-2. Pretpostavljamo da su proteini porodice TRP indirektno povezani jedni s drugima, ali mogu biti potrebni daljnji eksperimenti kako bi se demonstrirala direktna interakcija između njih. Nadalje, rekonstruirani modeli ljudske kože pokazuju da LEV-ovi učinkovito inhibiraju sintezu melanina izazvanu UV zračenjem i sadržaj melanina.

Cistanche dulcis

Zaključak

Naši nalazi sugeriraju da su LEV kandidati za nove antimelanogene lijekove koji smanjuju melanogenezu inhibiranjem ekspresije proteina povezanih s melaninom. Rezultati su potvrdili da LEV-ovi smanjuju MITF i tako smanjuju TRP u B16BL6 ćelijama melanoma. leva i arbutin inhibirali su TRY za 66 posto, odnosno 67 posto. Sadržaj melanina u rekonstruiranoj koži tretiranoj LEV-om smanjen je za 43 posto i 28 posto u odnosu na netretiranu negativnu kontrolu i arbutin kao pozitivnu kontrolu, respektivno.

Na osnovu ranih otkrića, vjerujemo da bi električni pogoni biljnog porijekla mogli biti korisni kao antimelanogeni agens za razvoj prirodne kozmetike. U budućnosti su potrebna dalja istraživanja kako bi se razvili električni pogoni biljnog porijekla kao djelotvoran sastojak za poboljšanje kože i potrebno je pokazati sigurnost EV-a biljnog porijekla na modelima ljudske kože. Naši rezultati sugeriraju da se EV može koristiti za smanjenje melanina i na taj način posvijetliti kožu. Međutim, EV može imati toksične efekte na kožu, pa treba provesti druge eksperimente kao što su alergijski testovi ili Ames testovi.

REFERENCE

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. Uloga vezikularnog transporta makromolekula kroz ćelijske zidove u patogenezi gljivica. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Nekonvencionalno izlučivanje proteina u biljkama: kritička procjena. Protoplazma. 2016;253(1):31–43.

[3] Paiva EA. Kako sekretorni proizvodi prolaze kroz ćelijski zid biljke da bi se oslobodili? Nova hipoteza koja uključuje ciklično mehaničko djelovanje protoplasta. Ann Bot. 2016;117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Maksimiziranje koloidne stabilnosti egzosoma nakon elektroporacije. Anal Biochem. 2014;448(1):41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Ekstracelularni vezikuli izolovani iz apoplasta lista nose proteine ​​odgovora na stres. Plant Physiol. 2017;173(1):728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Inženjering egzosoma kao rafiniranih bioloških nanoplatforma za isporuku lijekova. Acta Pharmacol Sin. 2017;38(6):754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Mehanizmi regulacije melanogeneze. Grudnjak Dermatol. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Lokalna primjena inhibitora protein kinaze C smanjuje pigmentaciju kože i kose. J Invest Dermatol. 2004;122(1):159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Diferencijalna ekspresija gena protein kinaze C u normalnim ljudskim neonatalnim melanocitima i metastatskim melanomima. Karcinogeneza. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Melanini i melanosomi: biosinteza, biogeneza, fiziološke i patološke funkcije. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Signalni putevi u melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.