Glukoza ispoljava anti-melanogeno dejstvo indirektnom inaktivacijom tirozinaze u melanocitima i ekvivalentom ljudske kože
Mar 22, 2023
sažetak:
Šećeri su sveprisutni u organizmima i dobro su poznati kozmetički sastojci za vlaženje kože uz minimalne nuspojave. Glukoza, jednostavan šećer koji žive ćelije koriste kao izvor energije, često se koristi u proizvodima za njegu kože. Nekoliko izvještaja je pokazalo da šećer i jedinjenja povezana sa šećerom imaju antimelanogene efekte na melanocite. Međutim, osnovni molekularni mehanizam kojim glukoza inhibira sintezu melanina je nepoznat, iako se glukoza koristi kao izbjeljivač, ali i kao hidratantni sastojak u kozmetici. Ovdje smo otkrili da glukoza značajno smanjuje sadržaj melanina u B16 stanicama stimuliranim hormonom stimulirajućeg hormona melanocita (MSH) i tamno pigmentiranim normalnim ljudskim melanocitima bez znakova citotoksičnosti.
Nadalje, lokalni tretman glukozom pokazao je njenu efikasnost izbjeljivanja putem fotografije, Fontana-Masson (F&M) bojenja i višefotonske mikroskopije u pigmentiranom 3D modelu ljudske kože, MelanoDerm. Međutim, glukoza nije promijenila ekspresiju gena ili nivoe proteina glavnih melanogenih proteina u melanocitima. Dok je glukoza snažno smanjila aktivnost intracelularne tirozinaze u melanocitima, nije smanjila aktivnost tirozinaze gljiva u eksperimentalnom sistemu bez ćelija. Međutim, glukoza se metabolizira u mliječnu kiselinu, koja može snažno potisnuti aktivnost tirozinaze. Stoga smo zaključili da glukoza indirektno inhibira aktivnost tirozinaze kroz pretvaranje u mliječnu kiselinu, objašnjavajući njeno antimelanogeno djelovanje na melanocite.
Tirozinaza je enzim koji može razgraditi tirozin u proteinu i pretvoriti ga u produkte oksidacije tirozina, kao što su tirozin fenol i druge supstance. Ovaj enzim postoji široko u ljudskom tijelu, posebno u crijevnom traktu, gdje je uključen u probavu i apsorpciju hrane. Istovremeno, istraživanjem je utvrđeno da cistanche može smanjiti aktivnost tirozinaze i tako izbjeliti kožu.
Ključne riječi:
melanogeneza; šećer; glukoza; tirozinaza; ekvivalent ljudskoj koži
1. Uvod
Melanogeneza je proces proizvodnje melanina i neophodan je za zaštitu kože. Melanin apsorbira ultraljubičasto (UV) svjetlo i štiti kožu od štetnog djelovanja UV svjetla i slobodnih radikala [1]. Međutim, budući da prekomjerna proizvodnja melanina uzrokuje hiperpigmentaciju kao što su pjege i lentigo, što se može smatrati neestetskim, mnoga istraživanja posvećena su pronalaženju učinkovitih depigmentnih sastojaka za kozmetiku ili lijekove [2–4].
Šećer je snažan humektant za vlaženje kože i koristi se kao kozmetički sastojak za vlaženje kože uz minimalne nuspojave. Pored toga, šećeri i agensi srodni šećeru utiču na melanogenezu [5,6]. Glikozilacija tirozinaze, ključnog enzima uključenog u sintezu melanina, može se promijeniti, inhibirajući njegovu katalitičku aktivnost i ubrzavajući njegovu degradaciju [7]. Uloga šećera u melanogenezi je naglašena studijama koje su istraživale učinak glikozilacije na pigmentacijski fenotip melanocita i ulogu ostataka šećera na katalitičku aktivnost tirozinaze [5-7]. Neka istraživanja su objavila da derivati šećera mogu inhibirati sazrijevanje tirozinaze, utičući na njenu glikozilaciju. Na primjer, N-acetilglukozamin (NAG), aminoheksoza proizvedena fiziološki dodavanjem amino grupe glukozi, remeti glikozilaciju tirozinaze, što rezultira depigmentirajućim efektima na koži zamorca i ljudske kože [8].
Osim toga, nedavne studije su pokazale da spojevi povezani sa šećerom inhibiraju ekspresiju ili aktivaciju tirozinaze, kao i mijenjaju njenu glikozilaciju. Na primjer, procijenili smo učinkovitost izbjeljivanja galakturonske kiseline (GA), šećerne kiseline koja je oksidirani oblik galaktoze i glavna komponenta pektina. Galakturonska kiselina ima efekat izbeljivanja kroz regulaciju aktivnosti i ekspresije tirozinaze u B16 ćelijama mišjeg melanoma i ekvivalentu ljudske kože [9]. U drugom izvještaju, novi tip cikličkog oligosaharida, poznat kao ciklična nitrozil nigeroza (CNN), pokazao je slab, ali značajan direktan inhibitorni učinak na enzimsku aktivnost tirozinaze, sugerirajući jedan od mogućih mehanizama hipopigmentacije [10]. Slično sazrevanju tirozinaze pravilnom glikozilacijom, ekspresija ili aktivnost CNN-a može biti meta antimelanogenih agenasa [11]. Međutim, brojni antimelanogeni agensi imaju ozbiljne nuspojave, kao što je vitiligo [12,13]. Stoga postoji veliko interesovanje za sigurnije depigmentarne spojeve.
Ovdje smo istraživali antimelanogene efekte glukoze na B16 ćelije melanoma miša i normalne ljudske melanocite. Osim toga, ispitali smo boju tkiva i epidermalni status bojenjem presjeka tkiva ekvivalenta ljudske kože. Na osnovu naših nalaza, predlažemo da učinak izbjeljivanja glukoze ovisi o proizvodnji mliječne kiseline, što rezultira inaktivacijom tirozinaze.
2. Rezultati
2.1. Anti-melanogena efikasnost glukoze u B16 i NHMs
Da bismo istražili antimelanogeni učinak glukoze, koristili smo dvije vrste melanocita, B16 melanomske ćelije (linija ćelija mišjeg melanoma) i normalne ljudske melanocite (NHM). Prvo smo utvrdili je li glukoza toksična za B16 stanice. Glukoza nije pokazala nikakvu citotoksičnost pri koncentracijama do 100 mM u B16 ćelijama, kao što je prikazano na slici 1A. Na osnovu podataka o citotoksičnosti, B16 ćelije su tretirane različitim koncentracijama glukoze tokom 72 h u prisustvu -melanocit-stimulirajućeg hormona (MSH), induktora melanogeneze. Kao što je prikazano na slici 1B, glukoza je jasno i značajno smanjivala sadržaj unutarćelijskog melanina na način ovisan o dozi. Kojična kiselina (KA) je korištena kao referentno jedinjenje za antimelanogenezu jer se često koristi kao kozmetički sastojak za posvjetljivanje kože [1,3,4]. Boja lizata u ćelijama tretiranim glukozom bila je svetlija od boje kontrolnih ćelija (slika 1C).
Osim toga, potvrdili smo da se količina melanina izlučenog u podlogu za kulturu smanjila i da je boja podloge svjetlija (slika 1D). Zatim smo istraživali antimelanogeni učinak glukoze na tamno pigmentirane NHM. Glukoza u koncentracijama do 100 mM nije bila citotoksična do četiri 4 dana (slika 1E). Kada je određen sadržaj melanina nakon tretmana NHM glukozom u trajanju od 4 dana, otkrili smo da se sadržaj melanina smanjio na način ovisan o dozi (slika 1F). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da glukoza potiskuje sintezu melanina u melanocitima.
2.2. Efekat izbjeljivanja glukoze na 3D ekvivalent ljudske kože
Da bismo dalje definirali antimelanogenu sposobnost glukoze, koristili smo pigmentirani 3D model ljudske kože, MelanoDerm. Kao što je opisano u odjeljku Materijali i metode, glukoza je lokalno primijenjena na MelanoDerm tokom 18 dana, a vitalnost ćelija je određena CCK-8 testom. Kao što je prikazano na slici 2A, nije uočena citotoksičnost tkiva nakon tretmana glukozom tokom 18 dana. Promjene boje tkiva procijenjene su fotografijom. Kao što je prikazano na slici 2B, tkivo tretirano glukozom bilo je svjetlije boje od tkiva tretiranog fosfatnim puferom (PBS). Osim toga, bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) otkrilo je da glukoza nije izazvala kolaps tkiva, dok je fontana-masson (F&M) bojenje pokazalo da glukoza smanjuje broj hiperpigmentiranih melanocita (kao što je prikazano strelicama) u bazalnom sloju (slika 2C) .
Da bismo dalje istražili promjene u sadržaju melanina, uporedili smo signale autofluorescencije melanina u slojevima melanocita tkiva tretiranih PBS-om i glukozom koristeći dvofotonsku ekscitaciju fluorescentnu mikroskopiju (TPEF), kao što je prikazano na slici 2D. Analiza ovih slika je pokazala da je volumen melanina smanjen za približno 36 posto, a intenzitet TPEF signala za melanin u području bogatom melanocitima smanjen je za približno 38 posto u tkivima tretiranim glukozom u poređenju sa tkivima tretiranim PBS.
Slika 2. Učinak glukoze na ekvivalent ljudske kože, MelanoDerm. (A) Viabilnost ekvivalenata ljudske kože tretiranih glukozom. (B) Ekvivalenti ljudske kože (MelanoDerm; n=3) su lokalno tretirani glukozom 18 dana, a zatim fotografisani. Vrijednost ∆L ukazuje na stepen svjetlosti u poređenju sa tkivom tretiranim PBS-om. (C) H&E i F&M bojenje presjeka tkiva. Stakalca su fiksirana u otopini formaldehida i stavljena u parafinski vosak za bojenje (skala bar, 5{{10}} µm). Crne strelice označavaju pigmentirane melanocite. (D) Snimanje melanina (200 × 200 × 60 µm3) ekvivalenata ljudske kože izvedeno je korištenjem TPEF mikroskopije. Pseudoboji (crveni) signali ukazuju na melanin (skala bar, 50 µm). Grafikoni pokazuju kvantifikaciju volumena melanina i TPEF signala. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD za najmanje tri nezavisna mjerenja (*p < 0,05, ***p < 0,001).
2.3. Utjecaj glukoze na ekspresiju melanogenih proteina u melanocitima
Zatim, da bismo razjasnili mehanizam depigmentacije glukoze u melanocitima, procijenili smo njen učinak na ekspresiju melanogenih enzima kao što su tirozinaza i Tyrp{0}} u B16 ćelijama i NHM. B16 ćelije su tretirane glukozom u naznačenim vremenima u prisustvu -MSH. Zatim su nivoi proteina tirozinaze i Tyrp-1 određeni Western blot testom (Slika 3A). Nivoi ekspresije tirozinaze i Tyrp-1 nisu smanjeni glukozom ni u jednom trenutku. Nadalje, nivoi transkripta tirozinaze nisu bili pod utjecajem glukoze u -MSH-stimuliranim B16 stanicama (Slika 3B). Slično B16 ćelijama, nivoi proteina tirozinaze, Tyrp{12}} i MITF nisu bili inhibirani glukozom (slika 3C) u NHM ćelijama tretiranim glukozom, a nivoi mRNA tirozinaze i Tyrp-1 također nisu bili smanjen, ali prilično malo povećan za glukozu (slika 3D).
Slika 3. Utjecaj glukoze na ekspresiju melanogenih proteina u B16 ćelijama i NHM. (A, B) B16 ćelije su tretirane sa -MSH tokom naznačenog vremena u prisustvu ili odsustvu 20 mM glukoze. Zatim su izvedeni Western blot (A) i qRT-PCR (B) testovi. (C) NHM su tretirani naznačenim koncentracijama glukoze 48 h. Zatim je urađen Western blot test. (D) NHM su tretirani naznačenim vremenom u prisustvu 50 mM glukoze. Zatim su izvedeni qRT-PCR testovi. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD najmanje tri nezavisna mjerenja.
2.4. Utjecaj glukoze na aktivnost tirozinaze
Da bismo dalje definirali mehanizam djelovanja glukoze, testirali smo da li ima inhibitorni učinak na aktivnost tirozinaze gljiva. Kao što je prikazano na slici 4A, otkrili smo da glukoza nije imala inhibitorni efekat na aktivnost tirozinaze gljiva, što ukazuje da glukoza ne utiče direktno na aktivnost tirozinaze. Zatim smo izvršili analizu ukupne intracelularne aktivnosti tirozinaze koristeći lizate ćelija tretiranih glukozom iz B16 ćelija i NHM. Zanimljivo je da je aktivnost intracelularne tirozinaze inhibirana na način ovisan o dozi u B16 ćelijama tretiranim glukozom u prisustvu -MSH (slika 4B). U NHM, glukoza je takođe inhibirala aktivnost intracelularne tirozinaze (slika 4C). Ovi podaci podržavaju mogućnost da glukoza indirektno inaktivira tirozinazu u melanocitima.
Slika 4. Utjecaj glukoze na aktivnost tirozinaze. (A) Utjecaj glukoze na aktivnost tirozinaze gljiva u sistemu bez ćelija. (B, C) Test aktivnosti ćelijske tirozinaze. (B) B16 ćelije su tretirane naznačenim koncentracijama glukoze tokom 24 h. Zatim je izvršen test aktivnosti ćelijske tirozinaze, kao što je opisano u odjeljku o metodama. (C) NHM su tretirani sa 50 mM glukoze za naznačeno vrijeme. Zatim je izvršen test aktivnosti ćelijske tirozinaze, kao što je opisano u odjeljku o metodama. Aktivnost ćelijske tirozinaze je normalizovana ukupnim sadržajem proteina. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD za najmanje tri nezavisna mjerenja (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
2.5. Inaktivacija tirozinaze proizvodnjom mliječne kiseline u melanocitima tretiranim glukozom
Glukoza se pretvara u ćelijski metabolit laktat, koji je mliječna kiselina u otopini i za koju se navodi da je efikasan u liječenju pigmentnih lezija [14,15]. Stoga smo pretpostavili da se glukoza pretvara u mliječnu kiselinu u melanocitima i da povećani nivoi mliječne kiseline inhibiraju melanogenezu kroz inaktivaciju tirozinaze. Da bismo procijenili ovu hipotezu, prvo smo procijenili proizvodnju mliječne kiseline u medijima iz melanocita tretiranih glukozom. Kao što se i očekivalo, glukoza je značajno povećala sadržaj mliječne kiseline u podlozi uzgojenim B16 stanicama (slika 5A). Osim toga, budući da je poznato da mliječna kiselina direktno inhibira aktivnost tirozinaze [15], procijenili smo da li mliječna kiselina potiskuje aktivnost tirozinaze gljiva. Kao što je prikazano na slici 5B, mliječna kiselina je dramatično inhibirala aktivnost tirozinaze gljiva, za razliku od glukoze. Ovi rezultati sugeriraju da konverzija glukoze u mliječnu kiselinu ima antimelanogeni učinak putem inaktivacije tirozinaze mliječnom kiselinom.
Slika 5. Proizvodnja laktata glukozom i uticaj mliječne kiseline na aktivnost tirozinaze. (A) Proizvodnja laktata u B16 ćelijama tretiranim glukozom. (A) B16 ćelije su tretirane naznačenim koncentracijama glukoze 3 dana. Zatim je izvršena analiza laktata koristeći kultiviranu podlogu, kao što je opisano u odjeljku o metodama. (B) Utjecaj mliječne kiseline na aktivnost tirozinaze gljiva u sistemu bez ćelija. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD najmanje tri nezavisna mjerenja (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001) .
3. Diskusija
Šećeri ili materijali dobijeni od šećera često se koriste kao kozmetički sastojci za zaštitu kože i fiziološku kontrolu. Na primjer, rafinoza povećava autofagiju nezavisnu od mTOR i smanjuje ćelijsku smrt u UVB-ozračenim keratinocitima, što ukazuje da prirodni agens rafinoza ima potencijalnu vrijednost u ograničavanju fotooštećenja [16]. Trehaloza i saharoza su novi aktivatori autofagije u ljudskim keratinocitima putem mTOR nezavisnog puta [17]. Ovi nalazi pružaju novi uvid u regulaciju autofagije u keratinocitima posredovanu šećerom. U slučaju glukoze, pokazalo se da lokalna glukoza inducira ekspresiju klaudina-1 i filagrina na mišjem modelu atopijskog dermatitisa i kulture keratinocita, što ukazuje da ima protuupalni učinak popravljajući funkciju kožne barijere [18]. Osim toga, glukoza inhibira proliferaciju i pojačava diferencijaciju keratinocita kože [19]. Stoga, glukoza regulira različite aspekte epidermalne fiziologije, kao što su funkcije kožne barijere i nivoi hidratacije keratinocita.
Šećeri mogu djelovati kao depigmentarni agensi putem nekoliko različitih mehanizama koji uključuju tirozinazu. Na primjer, neki agensi inhibiraju sazrijevanje tirozinaze, dok drugi induciraju inhibiciju ekspresije ili aktivnosti gena tirozinaze [5,8–10]. Međutim, nekoliko studija je istraživalo mehanizme koji su u osnovi efekata glukoze na depigmentaciju.
Da bismo odredili učinak glukoze na melanogenezu, prethodno smo se fokusirali na jetrene X receptore (LXR), koji su nuklearni receptori aktivirani ligandom koji igraju ključnu ulogu u metabolizmu lipida i homeostazi kolesterola [20]. Otkrili smo da aktivacija jetrenog X receptora inhibira melanogenezu kroz ubrzanje degradacije transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF) posredovanom ekstracelularnim signalom reguliranom kinazom (ERK) [21]. Nadalje, glukoza je endogeni LXR ligand [22]. Stoga smo pretpostavili da glukoza ima antimelanogene efekte zbog aktivacije LXR-ovisnog puta. Međutim, kao što je prikazano na slici 3C, glukoza nije promijenila nivoe ekspresije tirozinaze ili MITF, iako je LXR aktivacija smanjila nivoe ekspresije ovih proteina u melanocitima.
Stoga smo zaključili da glukoza ima depigmentirajući učinak na melanocite neovisno o LXR aktivaciji.
Glukoza je glavni supstrat za proizvodnju energije, a hidrolizira se kroz serijske reakcije nekoliko enzima, poznatih kao glikoliza. Brojne studije su pokazale da glikoliza ima samo jedan krajnji proizvod, mliječnu kiselinu, bilo u aerobnim ili anaerobnim uvjetima. U aerobnim uslovima (O2), laktat se koristi kao supstrat mitohondrijalne laktat dehidrogenaze (MLD). LDH ga pretvaraju u piruvat koji ulazi u ciklus trikarboksilne kiseline (TCA). U anaerobnim uslovima (N2), laktat se akumulira u citosolu. Stoga, put glikolize počinje sa glukozom kao supstratom i završava proizvodnjom laktata kao glavnog krajnjeg proizvoda [23]. Osim toga, David et al. mjerio je frakciju glukoze koja je pretvorena u mliječnu kiselinu ili piruvat u normalnom ljudskom melanocitu [24]. Većina metabolita glukoze bila je mliječna kiselina, a ne piruvat.
Mliječna kiselina je alfa hidroksi kiselina (AHA); ove kiseline se intenzivno koriste u kozmetičkim formulacijama kao agensi za površinski piling [25]. Osim toga, mliječna kiselina potiskuje stvaranje melanina direktnim inhibiranjem aktivnosti tirozinaze, efekta neovisnog o njegovoj kiseloj prirodi, što znači da su efekti mliječne kiseline na pigmentne lezije uzrokovani ne samo ubrzanjem obnavljanja epidermalnih stanica već i direktnom inhibicijom stvaranja melanina u melanociti [15]. Stoga smo zaključili da glukoza može ispoljiti svoj antimelanogeni učinak kroz proizvodnju mliječne kiseline jer se glukoza može pretvoriti u mliječnu kiselinu. Kao što se očekivalo, otkrili smo da je tretman glukozom rezultirao proizvodnjom mliječne kiseline u melanocitima (slika 5A).
Osim toga, potvrdili smo da mliječna kiselina snažno i direktno inhibira aktivnost tirozinaze (slika 5B). Usuki et al. također su otkrili da mliječna kiselina smanjuje aktivnost intracelularne tirozinaze u B16 stanicama i ljudskim HM3KO stanicama [15]. U izvještaju, mRNA i nivoi proteina tirozinaze i Tyrp-1 nisu bili pod utjecajem mliječne kiseline. Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da glukoza povećava proizvodnju mliječne kiseline i da ova mliječna kiselina direktno inhibira aktivnost tirozinaze bez utjecaja na nivoe ekspresije gena, što ukazuje da glukoza ima antimelanogeni učinak u melanocitima putem indirektne inaktivacije tirozinaze ovisno o proizvodnji mliječne kiseline. Međutim, potrebni su daljnji eksperimenti kako bi se potvrdila uloga mliječne kiseline i glukoze u depigmentaciji.
Zbirni podaci iz ove studije pružaju preliminarne dokaze koji podržavaju korisnost lokalne glukoze kao efikasnog izbjeljivača, kao i hidratantnog reagensa koji se može bezbedno koristiti u kozmetici i medicinskim formulacijama.
4. Materijali i metode
4.1. Materijali
D-glukoza, -MSH, kojična kiselina (KA), L-tirozin, L-DOPA i mlečna kiselina kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Antitijela protiv tirozinaze i aktina kupljena su od Abcam-a (Cambridge, UK). Antitijelo protiv Tyrp-1 kupljeno je od Santa Cruz Biotechnology (Kalifornija, SAD). Antitijelo protiv MITF-a je kupljeno od Proteintech-a (grad, IL, SAD).
4.2. Ispitivanje kulture ćelija i vitalnosti
Kupili smo B16 ćelije mišjeg melanoma, Dulbecco-ov modificirani Eagleov medij (DMEM) i fetalni goveđi serum (FBS) iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD). B16 ćelije su uzgajane u DMEM-u koji sadrži 4500 mg/L visoke glukoze (ATCC 30-2002) prema preporuci proizvođača (ATCC) sa dodatkom 5% FBS, i inkubirane na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 95% zraka i 10 posto CO2. Tamno pigmentirani primarni NHM su kupljeni od Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, SAD). Ćelije su uzgajane u medijumu 254 (#M254500) dopunjenom dodatkom za rast ljudskih melanocita (#S0025) i inkubirane na 37 ◦C u atmosferi od 5 posto CO2. Za eksperimente su korišteni primarni NHM između pasusa 4 i 7. Vijabilnost kultiviranih ćelija je procijenjena korištenjem kompleta za brojanje ćelija-8 (CCK-8) kako je opisano od strane proizvođača (DOJINDO, Tokio, Japan).
4.3. Mjerenje sadržaja melanina
Sadržaj melanina je određen kako je opisano u prethodnim izvještajima [2–4]. Ukratko, B16 ćelije su tretirane naznačenim koncentracijama glukoze u prisustvu -MSH (200 nM) tokom 72 h. NHM su tretirani naznačenim koncentracijama glukoze 4 dana. Nakon toga, sve ćelije su isprane sa fosfatnim puferom (PBS) i rastvorene u 1 N NaOH na 60 ◦C tokom 1 h. Ćelijski lizati su prebačeni u 96-ploču, a apsorbancija je izmjerena na 405 nm. Vrijednosti su normalizirane na osnovu koncentracija proteina u svakoj jažici uzorka.
4.4. Test aktivnosti tirozinaze gljiva
Istraživali smo direktne efekte naznačenih koncentracija glukoze na aktivnost tirozinaze gljiva. Ukratko, 100 µL fosfatnog pufera koji je sadržavao glukozu pomiješan je sa tirozinazom pečuraka (10 jedinica/bunariću) i pomiješan sa 50 µL 0,03 posto L-tirozina ili L-DOPA u destilovanoj vodi. Zatim je smeša zajedno inkubirana na 37 ◦C tokom 10 minuta, a apsorbancija je izmerena na 405 nm. Kojična kiselina (KA), dobro poznato sredstvo protiv tirozinaze, korišteno je kao referentno jedinjenje.
4.5. Intracelularni test aktivnosti tirozinaze
Ukratko, B16 ćelije ili NHM tretirani su naznačenim koncentracijama glukoze za naznačeno vrijeme. Zatim su ćelije isprane sa PBS i lizirane inkubacijom u 50 mM fosfatnom puferu (pH 6,8) koji sadrži 1 posto Triton X-100 i 0,1 mM fenilmetil-sulfonil fluorida. Ćelijski lizati su zatim centrifugirani na 12,000 rpm na 4 ◦C tokom 20 min. Sakupljen je supernatant koji sadrži ćelijsku tirozinazu i određen je sadržaj proteina za normalizaciju. Ćelijski ekstrakt je inkubiran sa L-DOPA u fosfatnom puferu, a formiranje dopahroma je praćeno merenjem apsorbancije na 405 nm unutar 30 minuta.
4.6. Izolacija RNK i kvantitativna reverzna transkripcija-polimerazna lančana reakcija u realnom vremenu (qRT-PCR)
Da bi se odredila relativna ekspresija mRNA odabranih gena, ukupna RNK je izolirana sa TRIzolom (Invitrogen, Kalifornija, SAD), prema uputama proizvođača, a 4 µg RNK je reverzno transkribirano u cDNK korištenjem RT-premiksa (Bioneer, Seoul, South Koreja). Kvantitativni PCR je izveden korišćenjem ABI 75{7}}0 Fast Real-Time PCR sistema (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD). qRT-PCR setovi prajmera za tirozinazu i Tyrp-1 su kupljeni od Applied Biosystems, a TaqMan Gene Expression Assay setovi (Applied Biosystems) su korišteni za amplifikaciju. Ekspresija ciljnog gena je normalizovana na ekspresiju kućnog gena koji kodira ribosomalni protein lateralnu podjedinicu P0 (RPLP0). Relativna kvantizacija je izvedena komparativnom ∆∆Ct metodom prema uputama proizvođača.
4.7. Western blotting
Ćelije su dva puta isprane hladnim PBS-om, a zatim lizirane u ledeno hladnom modifikovanom RIPA puferu (Cell Signaling Technology, MA, SAD) koji sadrži inhibitore proteaze (Calbiochem, La Jolla, Kalifornija, SAD). Određena je ukupna koncentracija proteina, a proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE na 4-12 posto gradijentnih Bis-Tris gelova (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), prebačeni na nitrocelulozne membrane (Thermo Fisher Scientific). Nakon transfera, membrane su blokirane u 5-postotnom rastvoru za blokiranje. Membrane su inkubirane s primarnim antitijelima na 4 ◦C tokom 24 h, isprane sa Tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0.1 posto Tween-20 (TBST) i izložene sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom 1 h na sobnoj temperaturi. Membrane su isprane tri puta sa TBST. Hemiluminiscentni signal je razvijen korištenjem Western blotting ECL reagensa (GE Healthcare, Hatfield, UK).
4.8. Trodimenzionalni (3D) ekvivalent ljudske kože
Koristili smo MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, SAD) kao model tkiva ljudske kože. Ovaj održivi, rekonstituisani, 3D ekvivalent ljudske kože izveden je od crnih donora i sadrži normalne melanocite i keratinocite. MelanoDerm je uzgajan na interfejsu vazduh-tečnost u EPI-100-NMM-113 medijumu (MatTek Corp, Ashland, MA, SAD). Prije tretmana glukozom, tkiva su isprana sa 1 mL PBS-a da bi se uklonila zaostala jedinjenja. Glukoza je otopljena u PBS. Konačna koncentracija glukoze bila je 2 posto. Kontrolni uzorak je tretiran samo sa PBS. Glukoza je primijenjena na MelanoDerm 1, 4, 6, 8, 11, 13 i 15 dana. Nakon 18 dana, MelanoDerm tkiva su fiksirana u 4 posto puferovanog formaldehida, uklopljena u parafin, isječena na debljinu od 3 µm i podvrgnuta na H&E i F&M bojenje. Vijabilnost uzoraka tkiva je procijenjena korištenjem kompleta za brojanje ćelija-8 (CCK-8) kako je opisano od strane proizvođača (DOJINDO, Tokio, Japan). Pigmentacija MelanoDerm-a procijenjena je poređenjem promjene u vrijednosti L*.
4.9. Dvofotonska ekscitacija fluorescencije (TPEF) Imaging
Da bismo vizualizirali distribuciju melanina u 3D ekvivalentu ljudske kože, izvršili smo TPEF snimanje, kao što je opisano u našim prethodnim izvještajima [3,4]. Ukratko, svaki MelanoDerm preparat je fiksiran u 4 posto formalina tokom 24 sata na 4 ◦C, a zatim ispran sa PBS/0.1 posto BSA (goveđi serum albumin, Merck, Branchburg, NJ, SAD). TPEF slike su dobijene iz bazalnog sloja za mjerenje intracelularnog melanina u sloju melanocita. Relativni intenziteti TPEF signala za melanin u mjernom volumenu kvantificirani su pomoću softvera Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, SAD).
4.10. Test L-laktata
B16 ćelije su zasijane u količini od 1.0 × 105 ćelija po jažici u 12-ploču. Nakon tretmana glukozom u trajanju od 3 dana, nivoi ekstracelularnog laktata su kvantificirani pomoću L-laktatnog kolorimetrijskog kompleta (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) prema protokolu proizvođača.
4.11. Statistička analiza
Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ± SD (standardne devijacije), a statistička značajnost je određena Studentovim t-testom. P-vrijednost < 0.05 se smatra statistički značajnom.
Doprinosi autora:
Konceptualizacija, H.-JK, JL i CSL; Kuriranje podataka, SHL; Istraga, SHL; Metodologija, SHL, I.-HB i E.-SL; Supervizija, JL i CSL; Pisanje—originalni nacrt, SHL i CSL; Pisanje—recenzija i uređivanje, JL Svi autori su pročitali i složili se sa objavljenom verzijom rukopisa.
finansiranje:
Ovo istraživanje je finansiran od strane Programa osnovnih naučnih istraživanja preko Nacionalne istraživačke fondacije Koreje (NRF) koju finansira Ministarstvo obrazovanja (Broj granta: 2018R1D1A1B07049402).
Sukobi interesa:
Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Skraćenice
-MSH -melanocit-stimulirajući hormon
Tyrp-1 protein vezan za tirozinazu 1
Transkripcijski faktor povezan s MITF mikroftalmijom
NHM normalni ljudski melanociti
TPEF dvofotonska ekscitaciona fluorescencija
LXR X receptor jetre
AHA alfa hidroksi kiseline
H&E hematoksilin i eozin
F&M Fontana-Masson
Reference
1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Istraživanje uloge melanina u ćelijskoj i mitohondrijskoj proizvodnji ROS-a izazvanoj UVA/UVB i vodikovim peroksidom i oštećenju mitohondrijske DNK u stanicama melanoma čovjeka. Slobodni Radic. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]
2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Novi derivat adamantil benzilbenzamida, AP736, potiskuje melanogenezu putem inhibicije cAMP-PKA-CREB-aktiviranog transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom i ekspresije tirozinaze. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]
3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Oh, SG; et al. Antimelanogena efikasnost Melasolva (3,4,5-trimetoksicinamat timol ester) u melanocitima i trodimenzionalnom ekvivalentu ljudske kože. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]
4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Manozileritritol lipidi inhibiraju melanogenezu supresijom signalizacije ERK-CREB-MITF-tirozinaze u normalnim ljudskim melanocitima i trodimenzionalnom ekvivalentu ljudske kože. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]
5. Bin, BiH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Razvoj antimelanogenih agenasa na bazi šećera. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]
6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogenesis Inhibitors. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]
7. Ando, H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Hearing, VJ Pristupi identifikaciji inhibitora biosinteze melanina putem kontrole kvaliteta tirozinaze. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]
8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MY; Yoon, TJ Poremećaj glikozilacije tirozinaze N-acetilglukozaminom i njegovih depigmentirajućih efekata u koži zamorca i ljudske kože. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]
9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Efikasnost depigmentacije galakturonske kiseline kroz regulaciju tirozinaze u B16 ćelijama mišjeg melanoma i trodimenzionalni ekvivalent ljudske kože. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]
10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Efekti cikličkog ugljikohidrata koji nije ciklodekstrin na ćelije melanoma miša: Karakterizacija novog tipa hipopigmentiranog šećera. PLOS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]
11. Khan, MT Novi inhibitori tirozinaze iz prirodnih resursa – Njihove računarske studije. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]
12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Sredstva za hipopigmentiranje: ažurirani pregled bioloških, hemijskih i kliničkih aspekata. Pigment. Cell. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]
13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Različiti efekti pet depigmentarnih spojeva, rododendrona, ketona maline, monobenzona, rucinola i AP736 na melanogenezu i održivost ljudskih epidermalnih melanocita. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]
14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Metabolizam glukoze u ćelijskoj kulturi sisara: Novi uvidi za podešavanje starih puteva. Trendovi. Biotechnol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]
15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Inhibicijski učinak glikolne kiseline i mliječne kiseline na sintezu melanina u stanicama melanoma. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]
16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Rafinoza povećava autofagiju i smanjuje ćelijsku smrt u keratinocitima ozračenim UVB zrakama. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]
17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehaloza, saharoza i rafinoza su novi aktivatori autofagije u ljudskim keratinocitima putem mTOR-nezavisnog puta. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]
18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Lokalna glukoza inducira ekspresiju Claudin-1 i Filagrina u mišjem modelu atopijskog dermatitisa iu kulturi keratinocita, ispoljavajući antiinflamatorne efekte popravljajući funkciju kožne barijere. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]
19. Spravčikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Učinci glukoze na keratinocite kože: posljedice za kožne komplikacije dijabetesa. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]
20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Nuklearni receptori u biologiji makrofaga: Na raskršću metabolizma lipida i upale. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]
21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Sin, ED; Park, YH; Lim, KM Aktivacija X receptora jetre inhibira melanogenezu kroz ubrzanje MITF-posredovane ERK degradacije. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]
23. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Nuklearni receptor LXR je senzor glukoze. Nature 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]
23. Schurr, A. Carbohydrate; IntechOpen: London, UK, 2017; str. 21–35.
24. Scott, D.; Richardson, A.; Filip, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Comparative metabolic Flux profiling of melanoma cell lines: Beyond the Warburg effect. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]
25. Tang, SC; Yang, JH Dvostruki efekti alfa-hidroksi kiselina na kožu. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
