HLA-G je široko izražen mastocitima u regijama fibroze organa u jetri, plućima i bubrezima
Feb 21, 2022
sažetak:Prethodno smo pokazali da su mastociti koji eksprimiraju HLA-G povezani s regijama izazvanim virusom hepatitisa Cjetrafifibroza. Ovdje smo imali za cilj utvrditi da li je ekspresija HLA-G u mastocitima specifična za virusnu etiologiju,jetraili na opći proces fifibroze. Nabrojali smo HLA-G plus ćelije i mastocite pomoću imunohistokemije (i)jetrablokira 41 slučaj alkoholne ciroze, (ii) 10 idiopatske plućne fifibroze (IPF) i (iii) 10 slučajeva renalfifibroza. Priroda HLA-G plus ćelija određena je multipleksnom imunofluorescencijom uz korištenje softvera. Više od polovine svih HLA-G plus ćelija bile su mastociti u fibroznim područjima alkoholne ciroze i IPF-a. Ububrezi,podvrgnute fifibrozi, HLA-G plus ćelije su zaista bile mastociti, ali se nisu mogle prebrojati. Štaviše, u određenim slučajevimajetrai pluća, uočili smo niz ćelijskih čvorova, koji su bili sekundarni ili tercijarni folikuli, u kojima je HLA-G bio visoko eksprimiran od strane B limfocita. Zaključno, HLA-G plus mastociti mogu se uočiti u fibroznim regijama svih proučavanih organa. Prethodne studije ukazuju na zaštitnu ulogu HLA-G plus mastocita protiv upale i fifibroze. Uočeni folikuli s B limfocitima koji eksprimiraju HLA-G mogu također pojačati njihovu antifibrotičku ulogu.
Ključne riječi:fibroza; HLA-G; mastociti; folikuli; B limfociti; antifibrotik; Bubreg; Jetra
UvodHronične bolesti koje dovode do fifibroze organa povezane su sa značajnim mortalitetom i morbiditetom, čineći do 45 posto smrtnih slučajeva u razvijenim zemljama [1]. Prevalencija fifibroznih bolesti u stalnom je porastu i važan je javnozdravstveni problem. Fibrozne bolesti mogu zahvatiti sve organe, kao nprjetra, bubrezi, pluća i srce. Patološku fifibrozu karakterizira pretjerano taloženje komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM), kao što je kolagen. Takva akumulacija ECM uništava normalnu arhitekturu organa i dovodi do disfunkcije i zatajenja organa uz promjenu specijaliziranih funkcija svakog organa, tj.jetra, funkciju detoksikacije, za pluća, funkciju izmjene plinova i zabubreg,funkcija fifiltracije. Osim toga, fifibroza može potaknuti razvoj raka. Transplantacija za zamjenu fifibroznog organa često predstavlja najbolju terapijsku opciju. Proces fifibroze nastaje kao odgovor na ozljedu ili oštećenje tkiva nakon uporne ili prejake upalne reakcije. Fibroza, koja je u početku reverzibilna, može evoluirati u ireverzibilno stanje [2]. Thejetramogu biti ozlijeđeni virusima (hepatitis B, C, D, E), gljivičnim toksinima, parazitima, autoantitijelima, ishranom bogatom mastima i prekomjernom konzumacijom alkohola, što je česta etiologijajetrafifibroza [3] pa čak i preovlađujući uzrok u određenim zemljama. Kada se uvrede ponavljaju,jetrarazvija hronični hepatitis sa fifibrozom praćenom uznapredovalom fifibrozom ili cirozom, što je stanje predispozicije za hepatocelularni karcinom (HCC).
U plućima, idiopatska plućna fifibroza (IPF) predstavlja najčešću od grupe bolesti koja uključuje fifibrozu preosjetljivosti i reumatoidnu plućnu fibrozu. Ova hronična progresivna fifibrozirajuća intersticijska bolest pluća nepoznatog porijekla je rijetka i pogađa tri miliona ljudi širom svijeta. Međutim, IPF je povezan s ranom smrću. Zaista, IPF dovodi do uznapredovale respiratorne insuficijencije i također predstavlja nezavisni faktor rizika za rak pluća [4]. Transplantaciju pluća treba razmotriti kao opciju za mlade pacijente sa uznapredovalom bolešću.
Renalfifibroza je posljednji zajednički put brojnih progresivnihbolesti bubrega.Incidencija hroničnihbolest bubrega, što dovodi do završne fazebubrežna bolest, značajno se povećao, pogađajući 10 posto svjetske populacije, uz visok mortalitet [5]. Osim toga, pacijenti s kroničnimbolest bubregaimaju povećan rizik od razvojabubregkarcinom (do 10 puta veći od opće populacije), sa čestim bilateralnim i/ili multifokalnim oštećenjima [6].
Bez obzira na organ koji razvija fifibrozu, važno je razumjeti mehanizme koji su uključeni u njenu pojavu kako bi se razvile terapije za prevenciju. Konkretno, kronična upala dovodi dojetrailibubrežnififibroze, a njeno kontrolisanje može omogućiti da se ograniči njeno napredovanje i početak zatajenja organa ili raka. Citokini i hemokini igraju centralnu ulogu kako u orijentaciji imunološkog odgovora tako iu održavanju upale [7,8]. Pored ovih imunoloških molekula, istraženi su i drugi proteini, kao što je HLA-G, molekul HLA klase Ib koji je dobro poznat po svojim imunomodulirajućim svojstvima [9]. Prethodno smo pokazali da se HLA-G ekspresira mastocitima koji su povezani s područjem uzrokovanim virusom hepatitisa Cjetrafifibroza [10,11]. U ovoj studiji, istražili smo da li je ekspresija HLA-G u mastocitima specifična za virusnu etiologiju,jetraili proces fifibroze, bez obzira na organ. Karakterizirali smo ekspresiju HLA-G u mastocitima i imunim stanicama na parafinskim blokovima kohorte od 41 pacijenta s cirozom uzrokovanom alkoholom, 10 s IPF-om i 10 sabubrežnififibroza. Precizna identifikacija ćelija koje eksprimiraju HLA-G izvršena je korištenjem četverostruke imunofluorescencije na parafinskim rezovima i softvera koji zasebno analizira fluorescenciju i spaja je na tri slučajajetraalkoholom izazvana fifibroza i dva od IPF-a.
Rezultati
Kvantitativna ekspresija i priroda HLA-G plus ćelija u fibrozi izazvanoj alkoholomInicijalna imunohistohemijska studija izvedena je na seriji uzoraka fifibroze izazvane alkoholom (n=41), što je omogućilo nabrajanje HLA-G plus i CD117 plus ćelija na cijelim stakalcima poluautomatskim prebrojavanjem koristeći HALO softver. Rezultati su sažeti u tabeli 1.
HLA-G plus i CD117 plus ćelije su brojane na cijeloj površini serijskih pločica od 41 slučaja alkoholne ciroze pomoću HALO softvera uz odgovarajući algoritam nakon imunohistohemije sa 4H84, koji prepoznaje HLA-G, i anti-CD117/c-kitom. Srednja vrijednost, standardna devijacija i raspon su naznačeni za ćelije HLA-G plus i CD117 plus: 555 ± 699 HLA-G plus /(41–2686) i 200 ± 271 CD 117 plus ćelije (12–1113).
Morfološke karakteristike HLA-G plus ćelija kod ciroze izazvane alkoholom topografski odgovaraju mastocitima (Slika 1A). U određenim slučajevima, izvršeno je dvostruko označavanje CD117 i humanih mastocita i pokazalo se da su CD117 plus ćelije jetre mastociti u fibroznom području (slika 1A). Tri reprezentativna slučaja ciroze izazvane alkoholom proučavana su četvorostrukom imunofluorescencijom i Sirius Red bojenjem pomoću HALO softvera za preciznu identifikaciju HLA-G plus ćelija. Prosječna površina fifibroze odgovarala je 19,4 postojetratkiva. Identifikacija HLA-G ćelija plus je pokazala da su 51 posto mastociti (Tabela 2; Slika 1A,1B1) definisanih humanom triptazom mastocita plus fenotipom CD1177 ili humanom triptazom mastocita plus ko-bojanjem za CD117. Mastociti koji eksprimiraju HLA-G locirani su u fifibrotičnim područjima (Slika 1B1). Suprotno tome, 49 procenata HLA-G plus ćelija nisu bile mastociti niti CD117 plus ćelije (tabela 3) i generalno se činilo da su grupisane zajedno kao čvorovi (slika 1B2). Stoga je izvršeno drugo označavanje različitih zona kako bi se identificirale ove ćelije (Tabela 4). Podjela različitih tipova HLA-G plus ćelija razlikovala se ovisno o površinijetrapregledano tkivo (tabele 3 i 4). Sve u svemu, činilo se da su 63 procenta HLA-G plus ćelija u fifibrotičnom području mastociti naspram samo 3 procenta u čvorovima. Osim toga, 68 posto HLA-G plus ćelija u čvorovima ko-eksprimira CD20, marker B limfocita (slika 1C1), i 3 posto CD3 (slika 1C2). HLA-G plus CD117 triptaza mastocita HLA-G plus CD117 HLA-G plus CD117 mastocitna triptaza plus i HLA-G plus CD117 plus triptaza mastocita plus ćelije su izbrojane u tri reprezentativna slučajajetrafifibroze korišćenjem HALO softvera sa odgovarajućim algoritmom. Ćelije su prebrojane u dva različita područja uzorka alkoholne ciroze, tj. fifibrotično područje i ćelijski čvor, u reprezentativnom slučajujetrafifibroze korišćenjem HALO softvera sa odgovarajućim algoritmom. Nijedna HLA-G plus ćelije ne eksprimiraju CD31, marker endotelnih ćelija ili CD1a, marker dendritskih ćelija.
Slika 1. Priroda HLA-G ćelija na reprezentativnom slučajujetrafifibroza. (A) U prvom pasusu, dvije fotografije na lijevoj strani pokazuju ekspresiju HLA-G i CD117 na reprezentativnom slučajujetrafifibroza od 41 slučaja pomoću imunohistohemije, pri čemu 4H84 prepoznaje HLA-G i CD117 antitijelo koje prepoznaje c-kit ćelije. Stakalca su obojena Mayer hematoksilinom. Rasponi fibroze su okruženi crvenom linijom. Područja u krugovima topografski odgovaraju HLA-G i CD117 obojenim stakalcima. Pravougaonik pokazuje snažno uvećanje ovih područja što ukazuje da se dvije HLA-G ćelije poklapaju sa dvije CD117 ćelije. Štaviše, imaju morfologiju kompatibilnu sa mastocitom. Fotografija u dvostrukoj fluorescenciji (CD117/triptaza mastocita) sa tri fotografije na desnoj strani koje odgovaraju jednostavnoj fluorescenciji (DAPI boji jezgre u plavo, CD117 u zeleno, triptaza mastocita u crveno) prikazuje većinu ćelija zajedno označenih u žutoj boji. CD117 ćelije su uglavnom mastociti. (B) Četvorostruka imunofluorescencija na reprezentativnom slučajujetrafifibroza (od tri) korišćenjem DAPI sa plavim jezgrima, HLA-G (sa 4H84 antitelom) sa zelenom pseudobojom, CD117 u cijan pseudoboji, triptazom mastocita u crvenoj pseudoboji i kompozitnom slikom ili spajanjem. Na desnoj strani je predstavljeno bojenje Sirius Red. 1 i 2 odgovaraju dvije različite oblastijetra,odnosno raspon fifibroze i ćelijski čvor. Većina HLA-G ćelija ko-ekspresira CD117 i triptazu mastocita u fifibrozi (1). Nasuprot tome, većina HLA-G ćelija ne ko-ekspresiraju mastociti, osim određenih HLA-G ćelija na periferiji ćelijskog čvora (2), blizu ili u fifibrozi. (C) Četvorostruka imunofluorescencija na ćelijama čvorajetrafifibroza prikazana na B2, sa DAPI, HLA-G sa zelenom pseudobojom, CD20 sa fuksija ružičastom, ili CD3 sa cijan pseudobojom, respektivno, u 1 i 2. Podudaranje Sirius Red boje je desno. Kvadrat prikazuje ograničeno topografski područje koje sadrži HLA-G pozitivne ćelije i odgovarajuće ćelije u toj zoni. Kompozitna slika prikazuje ružičasto zajedničko označavanje HLA-G i CD20. Nije primećeno zajedničko bojenje između HLA-G sa zelenom pseudobojom i CD3 sa cijan pseudobojom.
Apsolutni broj ćelija HLA-G plus, CD3 plus (T limfociti), CD20 plus (B limfociti) i triptaze mastocita plus (mastociti) određen je pomoću HALO softvera sa odgovarajućim algoritmom na jednom reprezentativnom slučaju i izražen je po mm2.
Analiza HLA-G plus ćelija u IPFU prvoj studiji koja je sprovedena na seriji IPF-a (n=10) imunohistohemijom, kao što je prethodno opisano, procijenili smo da je broj HLA-G plus ćelija 135 ± 62/mm2 i da je broj CD117 plus ćelija biti 227 ± 134/mm2 (Tabela 5). HLA-G plus ćelije nisu odgovarale CD117 plus ćelijama u fifibrozi pluća (slika 2A). HALO analiza četvorostruke imunofluorescencije i Sirius Red bojenje pokazala je da je priroda HLA-G ćelija različita u zavisnosti od histološke oblasti pluća (Tabela 6). Zaista, 63 posto HLA-G plus ćelija u fifibroznim područjima bile su mastociti (B1, C1), dok su one sadržavale samo 7 posto HLA-G plus ćelija u čvorovima (B2, C2). Većina HLA-G plus ćelija u čvorovima ko-eksprimirala je CD20 (slika 2B).
Slika 2. Priroda HLA-G ćelija na reprezentativnom slučaju IPF-a. (A) U prvom pasusu, fotografija s lijeve strane prikazuje Sirius crvenu boju jednog reprezentativnog slučaja od deset IPF-a, srednja fotografija prikazuje kontraboju Mayerovim hematoksilinom koristeći imunohistohemiju. Područja u krugovima topografski odgovaraju na stakalcima obojenim HLA-G i CD117 sa 4H84 koje prepoznaje HLA-G i CD117 antitijelom koje prepoznaje c-kit ćelije. Pravokutnici pokazuju snažno uvećanje ovih područja, što ukazuje da HLA-G ćelije ne odgovaraju CD117 ćelijama. (B) Četvorostruka imunofluorescencija na reprezentativnom slučajujetrafifibroza od dva koristeći DAPI sa plavim jezgrima, HLA-G (sa 4H84 antitijelom) sa zelenom pseudobojom, CD117 u cijan pseudoboji, triptazom mastocita u crvenoj pseudoboji i kompozitnom slikom ili spajanjem. Na desnoj strani je predstavljen Sirius Red; 1 i 2 odgovaraju dva različita područja pluća, odnosno raspon fifibroze i ćelijski čvor. (C) Petostruka imunofluorescencija sa DAPI, HLA-G sa zelenom pseudobojom, triptaza sa crvenom pseudobojom, CD3 sa cijan pseudobojom, CD20 sa fuksija ružičastom pseudobojom, na istom slučaju IPF-a prikazanog na (B) . (C1) odgovara području (B1). U (C1), većina HLA-G ćelija odgovara mastocitima u području fifibroze, dok su vrlo rijetke mastocite HLA-G u čvoru prikazanom na (C2). Većina ćelija čvora su CD20. HALO analiza je pokazala da su većina HLA-G plus ćelija B limfociti.
HLA-G plus i CD117 plus ćelije su prebrojane za 10 slučajeva korišćenjem HALO softvera sa odgovarajućim algoritmom, nakon imunohistohemije. Srednja vrijednost, standardna devijacija i raspon su naznačeni.
Analiza HLA-G plus ćelija u bubrežnoj fibroziU istraživanju serije od 10 slučajevabubrežnififibroze imunohemijom, pronašli smo 133 ± 102 HLA-G plus ćelije/mm2 i 426 ± 207 CD117 plus ćelija/mm2 (Tabela 7). Nije bilo podudaranja između HLA-G plus i CD117 plus ćelija (slika 3A).
Slika 3. Priroda HLA-G ćelija na reprezentativnom slučajububrežnifibroza. (A) U prvom pasusu, fotografija s lijeve strane prikazuje Sirius crvenu boju, srednja fotografija prikazuje protuboju Mayerovim hematoksilinom koristeći imunohistohemiju. Područja u krugovima topografski odgovaraju HLA-G i CD117 obojenim stakalcima, pri čemu 4H84 prepoznaje HLA-G i CD117 prepoznaje c-kit ćelije. Crvene strelice su pozitivne ćelije. Pravokutnici pokazuju snažno povećanje ovih područja što ukazuje da HLA-G ćelije ne odgovaraju CD117 ćelijama. (B) Četvorostruka imunofluorescencija na reprezentativnom slučajujetrafibroza pomoću DAPI sa plavim jezgrima, HLA-G (sa 4H84 antitijelom) sa zelenom pseudobojom, CD117 u cijan pseudoboji, triptazom mastocita u crvenoj pseudoboji i kompozitnom slikom ili spajanjem. Na desnoj strani je predstavljen Sirius Red. Ćelije obojene žuto na spoju odgovaraju HLA-G plus mastocitima. (C) Područja obojena cijan odgovaraju brojnim tubulima koji eksprimiraju samo CD117. Ćelije obojene žuto na spoju odgovaraju HLA-G plus mastocitima.
HLA-G plus i CD117 plus ćelije su izbrojane za 10 slučajevabubrežnififibroza upotrebom HALO softvera sa odgovarajućim algoritmom, nakon imunohistohemije. Srednja vrijednost, standardna devijacija i raspon su naznačeni za HLA-G plus i CD117 plus ćelije. Četvorostruko označavanje sa HALO softverom u kombinaciji sa Sirius Red i morfološka analiza pokazala je značajnu heterogenost označavanja na dijelububregprema ne samo anatomskoj regiji već i unutar istog anatomskog odjeljka (slika 3B,C). Dakle, popis i izračunavanje procenta HLA-G plus ćelija nisu bili relevantni u ovom organu. Zaista, mikroskopski pregled je pokazao snažno bojenje obima tubula sa CD117 koji nije bio ko-obilježen s onim mastocita (slika 3C). HLA-G plus ćelije su mastociti i nalaze se u inflamatornom intersticijumu (slika 3B,C).
DiskusijaEkspresija HLA-G proteina je prvi put demonstrirana u citotrofoblastima na interfejsu fetal-maternal [12]. U bazalnim uslovima, njegova ekspresija je uglavnom ograničena na specifična tkiva, kao što su rožnjača [13], timus [14] i otočići pankreasa [15]. Međutim, određene vrste ćelija su također u stanju da ga eksprimiraju, kao što su epitelne stanice bronhija [16], mezenhimske ćelije [17], ćelije monocitne loze [18–20], te eritroidni i endotelni prekursori [21], u posebnim uvjetima . Ranije smo pokazali da mastociti mogu da eksprimiraju HLA-G u bazalnom stanju, uz povećanu ekspresiju u određenim sredinama bogatim citokinima, posebno u fifibroznomtkiva jetre.Istraživali smo da li se HLA-G može eksprimirati mastocitima povezanim sjetrafifibroza druge etiologije ili fifibroza u drugom organu proučavanjem 41 slučaja uzrokovanog alkoholomjetraciroza, 10 od IPF-a i 10 odbubrežnififibroza.
Infekcije, toksične i metaboličke ozljede te idiopatske upalne bolesti mogu potaknuti razvoj fifibroze jer kronična ozljeda inducira apoptozu parenhimskih stanica koje oslobađaju profibrogene i upalne citokine kao što je TGF-. Ćelije koje proizvode kolagen se razlikuju od rezidentnih mezenhimskih ćelija kao odgovor na povredu. Prelazak epitela u mezenhim je fenomen ćelijske transdiferencijacije koji se opaža za holangiocite ujetra, pneumociti u plućima i tubularne epitelne ćelije ububreg[22]. Apoptotične ćelije izazivaju povećanje koncentracije TGF-a u svim organima. Međutim, specifične karakteristike fifibrogeneze mogu se razlikovati u različitim organima. Ujetra,apoptoza se odnosi na hepatocite, dok zahvaća epitelne ćelije u plućima ibubreg[22]. Dakle, rezidentni fifibroblasti ububregi pluća aktiviraju u miofifibroblast koji eksprimira a-SMA, kolagen1, dokjetramiofibroblasti zadržavaju svoje neuralno specifične markere [23].
Ujetra,zvijezdaste ćelije jetre doprinose više od 80 posto svih stanica koje proizvode kolagen. U plućima je oštećenje pneumocita povezano s apoptozom endotelnih stanica. Uloga upale u IPF-u je kontroverzna. Tipični IPF ne pokazuje influks inflamatornih ćelija, ali neki autori sugerišu ulogu upale u diferencijaciji plućnih fifibroblasta u miofibroblaste koji proizvode ECM [24]. Ponovljene lezije alveolarnog epitela nepoznate etiologije i alveolarna epitelna apoptoza su uključene u IPF [25]. Ububregijetra,mijelomonocitne ćelije se regrutuju iz koštane srži i predstavljaju 14 do 15 procenata odnosno 8 do 12 procenata miofibroblasta. U plućima nije uočena reverzibilnost fifibroze za razliku odjetraibubregu odsustvu povrede i ako nije dostignuta tačka bez povratka. Zaista, upalni procesi su ograničeni kod IPF-a, posebno u ranoj fazi bolesti, dok ponovljene lezije alveolarnog epitela nepoznate etiologije i alveolarna epitelna apoptoza mogu potaknuti proliferaciju i aktivaciju plućnih fifibroblasta ili miofibroblasta [25].
Kao zajetrafifibroza, neuspjeli proces zacjeljivanja ranabubregtkivo nakon kronične, trajne ozljede dovodi do proizvodnje i lučenja proinflamatornih citokina, kao i TGF-, koji igra ključnu ulogu u fifibroznom procesu. Na primjer, ujetrafifibroza, TGF-, koja se izražava kao mala količina u mirnom HSC, brzo se proizvodi od strane ove vrste ćelija nakonozljeda jetre.Pored HSC-a, drugi izvori TGF-a su opisani kao trombociti, makrofagi, hepatociti, kao i mastociti [26]. TGF- 1 se pohranjuje u matriksu u svom latentnom obliku, i kada se aktivira, promoviše tranziciju iz fifibroblasta u miofibroblast, što je fundamentalno za proces fifibroze. Osim toga, inhibira degradaciju ECM supresijom metaloproteaza i promoviranjem prirodnog inhibitora TIMP. Dakle, on inducira proizvodnju ECM-a kroz SMAD3-zavisne ili ne-povezane sa SMAD mehanizme [27]. Zaista, postoji međusobna interakcija između mastocita i TGF-a. TGF- je snažan atraktant za mastocite; zaista, patološki procesi posredovani TGF- često su povezani sa akumulacijom mastocita [28]. Osim toga, mastociti su jedan od primarnih izvora IL-17 koji pokreću TGF- -zavisnu fifibrozu [29]. Također je zabilježeno da TGF- promovira ili potiskuje funkcije mastocita. Zaista, TGF- inhibira ekspresiju IgE receptora visokog afiniteta Fc1RI, koji aktivira mastocite [30]. S druge strane, on inhibira proliferaciju mastocita, degranulaciju i proizvodnju nekoliko efektorskih molekula kao što su histamin i TNF- [31]. S obzirom na povećanje MC kod fifibroze, učinak TGF- na funkcije MC može biti važan u regulaciji upalnih odgovora koji održavaju proces fifibroze.
Kao i kod virusa hepatitisa Cjetrafifibroze, otkrili smo da su polovica HLA-G plus ćelija u cirozi izazvanoj alkoholom mastociti (tabela 2) i samo 34 posto mastocita eksprimira HLA-G, sa visokom individualnom varijabilnosti prikazanom standardnom devijacijom (tabela 1) . Osim toga, uočili smo jasnu podjelu prema regijijetra,u kojoj su 63–92 procenta HLA-G plus ćelija u fibroznim regijama bile mastociti, dok su samo 3–23 procenta bili mastociti u ćelijskim čvorovima (tabela 3). Slično, različit obrazac je uočen za mastocite, budući da je 92 posto mastocita u fifibroznim regijama eksprimiralo HLA-G, dok je samo 23 posto eksprimiralo HLA-G u ćelijskim čvorovima (podaci nisu prikazani). Dakle, ekspresija HLA-G nije ograničena na virusnu etiologijujetraciroza. Zaista, dobili smo sličan rezultat za pluća. Kod IPF-a, 63 posto HLA-G plus ćelija u fifibrotičnim regijama bile su mastociti, dok su samo 7 posto onih u čvorovima bili mastociti (tabela 6). Slučajevibubrežnififibroze su bile posebne. Kao rezultat velikog broja tubula, nije bilo moguće pravilno izbrojati ćelije u fifibrotičnim regijama jer su mastociti infifiltrirali tubule. Moglo se izvršiti samo kvalitativna mikroskopska opservacija, koja pokazuje da su određeni broj HLA-G plus ćelija mastociti, a da se tubule ne mogu razlikovati od fifibroznih regija (Slika 3). Stoga se čini da se HLA-G eksprimira u mastocitima u fifibroznoj bolesti kroz ćelijsku površinu i intra-citoplazmatske molekule, bez obzira na organ. Prethodno smo pokazali da su ljudski mastociti u kulturi bili u stanju da proizvode rastvorljive HLA-G forme u kondicioniranom mediju u bazalnom stanju i da se sekrecija povećava nakon stimulacije citokinima, uključujući IL-10 [10].
Veći procenat mastocita (više od polovine) koji eksprimiraju HLA-G ujetrai pluća mogu se objasniti upalnim komponentama fifibroze. Zaista, kao urođene imunološke ćelije, broj mastocita se povećava u upalnim stanjima, a one također mogu oslobađati proinflamatorne medijatore [32]. Broj mastocita je povećan kod fifibroznih bolesti. Zaista, gustina mastocita je veća u plućima pacijenata sa IPF-om nego kod pacijenata sa drugim plućnim patologijama [33] i normalnim plućima. Slično, ljudskibubrežne bolestisu praćene povećanjem broja mastocita ububrežnikorteksa, posebno u području fifibroze [34], jer se mastociti rijetko uočavaju kod zdravihbubrezi.
Prethodne publikacije su navodile da mastociti nedostaju ili da se samo rijetko nalaze u normalnoj ljudskoj jetri, plućima ibubrezi[35]. Napredak znanja o mastocitima pokazao je da se mastociti kao urođene imune ćelije mogu uočiti u svim tkivima, ali ih ima više na mjestima izloženim okolišu. Štaviše, oni pokazuju veliki repertoar receptora koji im omogućava da odgovore na podražaje i da stupe u interakciju sa drugim ćelijama [36].Renalmastociti funkcionalno nalikuju onima u plućima. Prijavljeni su kontradiktorni podaci o ulozi mastocita u fifibrozi. Brojni autori su sugerirali da su mastociti uključeni u fifibrozu jer igraju ulogu u akutnoj i kroničnoj upali koja je pokreće. Osim toga, mastociti su u stanju da luče histamin, heparin i IL-4, koji pojačavaju proliferaciju fifibroblasta. Međutim, drugi [37,38], uključujući i nas [39], pokazali su da mastociti imaju antifibrotičku ulogu: na primjer, na životinjskim modelima, kao što su Ws/Ws miševi i pacovi s nedostatkom mastocita. Okazaki et al. pokazalo je da je indukovana fifibroza bila teža kod pacova sa nedostatkom mastocita nego kod pacova divljeg tipa [38].
Štaviše, pokazalo se da su mastociti polarizovani kod raka, slično kao i makrofagi [40]. Protuupalni mastociti eksprimiraju citokine, kao što je IL-10, a njihov broj je obrnuto povezan sa ozbiljnošću upale, dok proinflamatorni mastociti odgovaraju proinflamatornom okruženju. Vjerovatno je da protuupalni mastociti eksprimiraju HLA-G, posebno zato što (i) u nekoliko modela je prikazana povezanost između nivoa IL-10 i ekspresije HLA-G i (ii) HLA-G ima protuupalno djelovanje. Mastociti koji eksprimiraju HLA-G mogu biti prisutni u ranoj fazi bolesti, tokom inflamatorne faze, kako bi se suprotstavili upalu, što je prva reakcija na leziju. U literaturi je objavljeno da Il-10, smanjujući inflamatorni odgovor, može inhibirati proliferaciju i sintezu kolagena miofibroblasta [41]. Zaista, IL-10 može igrati zaštitnu ulogu kod alkoholičarabolest jetre[42]. Nasuprot tome, viši nivoi IL-10 u serumu su nađeni kod pacijenata sa IPF-om nego kod normalnih ispitanika, a najviši nivo IL-10 u bronhoalveolarnoj lavaži je pokazan kod pacijenata sa IPF-om u poređenju sa sarkoidozom ili preosjetljivim pneumonitisom [43]. To bismo mogli objasniti manje važnom inflamatornom komponentom. Ububrežnififibroza, na mišjem modelu je pokazano da se nedostatak IL-10 pogoršavabubregupala i fifibroza [44]. Kod ljudi, liječenje lokalnom imunoterapijom IL-10 povezanom s TGF-antagonistom poboljšava hroničnubolest bubrega [45].
Još jedan relevantan rezultat je posmatranje HLA-G plus ćelija u ćelijskim čvorovima, blizu fifibroznih regiona u retkim slučajevima alkoholne ciroze. Ove ćelije su morfološki okarakterisane skupom lako prepoznatljivih ćelija male do srednje veličine, što ukazuje na limfoidni agregat. Njihove morfološke karakteristike upućuju na folikule, koje su strukture formirane uglavnom od B limfocita. Četvorostruka imunofluorescencija u čvorovima je potvrdila ovu hipotezu, jer je 68 posto HLA-G plus ćelija ko-eksprimiralo CD20, koji je specifičan marker B limfocita (Tabela 3). Slične strukture su uočene i kod IPF-a, sa sličnim rezultatom, koji pokazuje da su 76 posto HLA-G plus ćelija u čvorovima B limfociti (Tabela 6). Prijavljena je limfoidna neogeneza kod fifibroze. Dakle, pod određenim patološkim stanjima, kao što je trajna upala, ćelijski agregati se mogu razviti u visoko organiziranu strukturu koja liči na sekundarno limfoidno tkivo, odnosno tercijarne limfoidne organe ili ektopične limfoidne folikule [46]. Takvi limfoidni folikuli sadrže područja bogata T-ćelijama i različite folikule B-ćelija sa germinativnim centrima [47]. Mehanizam kojim infiltrirajuće B ćelije organizuju ektopični folikul i germinalni centar kontrolišu limfotoksin- 1 2 i limfoidni hemokini, kao što su CC-hemokin ligand 19 (CCL19), CCL21, CXC-hemokin ligand 12, i C CXCL13, koji regulišu homing limfocita. Pored lym fotoksina i hemokina, potrebna je i antigena stimulacija da se indukuje i održi formiranje folikula. Takvi folikuli nisu uočeni u našoj kohorti indukovanih virusom hepatitisa Cjetrafifibroze i pronađeni su samo u jednom od tri slučaja uzrokovane alkoholomjetrafifibroza, što ukazuje na poseban stadijum bolesti. Zaista, funkcija ektopičnih limfoidnih organa i njihova korelacija s upalom i fifibrozom još nije jasna. Brojne studije su pokazale novu i iznenađujuću ulogu B ćelija u regulaciji fifibroblasta u fifibrozi, u kojoj je njihov profibrotički efekat analogan onom TGF- i takođe pojačan faktorom aktivacije B-ćelija (BAFF) [48].
Relevantnost ćelijskog izvora HLA-G u fifibrozi nije samo deskriptivna već i funkcionalna. HLA-G ima inhibitorni efekat na funkciju svih vrsta limfocita [49] i dendritskih ćelija [20,50] preko svojih specifičnih receptora, kao što su ILT2 i ILT4. Prisustvo HLA-G na ovim imunim ćelijama, osim što je marker upale, takođe je znak odgovarajuće imunološke reakcije tako što smanjuje upalu. Zaista, poznato je da HLA-G igra zaštitnu ulogu protiv pretjeranih inflamatornih reakcija, kao što je ranije pokazano kod septičkog šoka [51]. Osim toga, prethodno smo proučavali recipročnu interakciju između mastocita i zvjezdanih ćelija jetre i pokazali da ona dovodi do privlačenja mastocita i značajnog smanjenja proizvodnje kolagena od strane HSC stanica kroz proizvodnju HLA-G [39]. Osim toga, ekspresija HLA-G od strane B ćelija u ektopičnim folikulima može također doprinijeti suzbijanju profibrotičkog efekta B limfocita na miofibroblaste inhibiranjem B ćelija putem autokrinog mehanizma.
Pacijenti i metode
PacijentiKohorta od 41jetraispitan je transplantiranih pacijenata sa cirozom izazvanom alkoholom. Pacijenti su obaviješteni o protokolu i dobiveno je izostanak protivljenja (Bolička etička komisija, obavještenje br. 16.47). Deset uzoraka parafinskih blokovabubrežnififibroza i 10 IPF-a (Komitet za bolničku etiku, obavještenje br. 16.123), potpuno i nepovratno anonimizirani, proučavani su u skladu sa principima Helsinške deklaracije. Kliničke i biološke karakteristike tri kohorte su sumirane u tabelama 8-10.
Metodologija
Imunohistohemija i imunofluorescencijaTkiva su izvedena iz eksplantiranihjetraibubrežniili plućna biopsija. Pripremljeni su serijski rezovi ugrađeni u parafin (debljine 4 µm) i urađeno standardno histološko bojenje, odnosno HES koloracija i Sirius Red obilježavanje kolagena. Paralelno, imunohistohemija i imunofluorescencija su rađeni na serijskim sekcijama parafinskih sekcija iz istog bloka nakon deparafinizacije i protokola za pronalaženje antigena. Primarna antitijela (mAbs) su bila sljedeća: monoklonalna mišja anti-humani HLA-G (Exbio, 4H84 2 µg/mL ili 1:100, Vestec, Češka), poliklonska zečja anti-humani CD117/c-kit , prepoznavanje mijeloida i mastocita (Dako, 1:200, Kopenhagen, Danska), mišja monoklonska anti-humana (hum) triptaza mastocita (klon AA1, Dako, 1:1000), specifična za mastocite, monoklonska anti-humana CD3 (Thermo Scientifics, SP7, 1:500, Waltham, MA, SAD), specifičan za T limfocite, i monoklonalni antihumani CD20 (Dako, M0755, 1:600), specifičan za B limfocite.
Ukratko, preparati za imunohistohemiju su inkubirani sa primarnim antitelom u Discovery Ultra (Roche, Meylan, Francuska) automatizovanom sistemu. Vezano primarno antitijelo otkriveno je korištenjem biotiniliranog kozjeg anti-mišjeg ili anti-zečjeg IgG sekundarnog antitijela (Vector, ABCYS, les Ulis, Francuska, 1:700) i diamino-benzidina (DAB MAP komplet za detekciju, Roche , Meylan, Francuska), nakon čega slijedi Mayer hematoksilinska boja. Da bi se precizno odredila priroda HLA-G plus ćelija, trostruki (DAPI, CD117, triptaza mastocita), četvorostruki (DAPI, HLA-G, CD117, triptaza mastocita) i peterostruki (DAPI, HLA-G, CD3, CD20, mastocitna triptaza) imunofluorescentno bojenje je zatim obavljeno na tri reprezentativna slučaja alkoholom izazvane ciroze i dva reprezentativna slučaja IPF-a. Otkrivanje je izvedeno korišćenjem kompleta Discovery FAM, rodamina, DCC i Cy5 (Ventana Medical systems, Illkirch, Francuska). Nakon bojenja, slika cijele površine presjeka je digitalizirana uz povećanje od 20× ili 40× pomoću konfokalnog skenera (Panoramski skener, 3DHistech, Budimpešta, Mađarska). Imunohistohemija i multipleks imunofluorescentno bojenje analizirani su pomoću softvera za digitalnu analizu HALO (V3.0.311). Softver je obučen da prepozna fifibrozu (Sirius Red) pomoću modula Area Quantification (V2.1.3), dok je modul Fish-IF (v1.2.2) obučen za uzorke označene bojama. Cijeli dijelovi svakog uzorka odabrani su za analizu odgovarajućim algoritmom. Podaci su ekstrahovani u softver za proračunsku tablicu za analizu.
ZaključakOvaj rad povezan s našim prethodnim eksperimentima s podacima o anti-zaštitnoj ulozi mastocita putem HLA-G ekspresije [39] sugerira da mastociti igraju antifibrotičku i zaštitnu ulogu putem ekspresije HLA-G u fifibrotskim situacijama. Ova uloga je pojačana B limfocitima koji eksprimiraju HLA-G u ektopičnim folikulima. Sve u svemu, ovi nalazi sugeriraju zaštitnu ulogu za HLA-G eksprimiran mastocitima u fifibroznim organima.
