Graham{0}}Učenje izaziva jedinstveni transkript

sažetak:
Učenje može izazvati neurofiziološku plastičnost u slušnom korteksu u više vremenskih razmjera. Trajne promjene slušne kortikalne funkcije koje traju danima, sedmicama ili čak cijelim životom zahtijevaju ekspresiju gena izazvanu učenjem. Zaista, de novo transkripcija je molekularna determinanta da li se prolazna iskustva transformišu u dugoročna sjećanja s trajnim utjecajem na ponašanje.

Kontinuiranim razvojem nauke i tehnologije, u toku ljudskog života pojavile su se mnoge magične životne pojave, među kojima je najvredniji za istraživanje pamćenje. Memorija je važan dio ljudske napredne neuronske aktivnosti, a također je zapis i akumulacija različitih događaja koji su se dogodili od ljudske evolucije. Dakle, postoji li veza između ekspresije gena i pamćenja? Odgovor je da.

Prvo, očigledan je uticaj gena na pamćenje. Može regulirati ekspresiju različitih molekula i proteina povezanih s pamćenjem putem polimorfizama pojedinačnih nukleotida (SNP) i drugim metodama. Ovo može uticati na efikasnost komunikacije između neurona, čime utiče na kognitivne, konceptualne, emocionalne i druge karakteristike osobe, što ukazuje na kvalitet pamćenja.

Drugo, pamćenje takođe može imati određeni uticaj na ekspresiju gena. U procesu našeg učenja, pamćenja i razmišljanja, nisu samo promjene u neuralnoj aktivnosti mozga već i regulacija i intervencija mnogih gena i molekula. Regulacija ovih gena i molekula će zabilježiti tragove koji odgovaraju osjećajima i iskustvima koji postoje u našem dugoročnom pamćenju, i na kraju će biti pohranjeni u genima.

Konačno, postoji međuzavisnost između pozitivnog stava i sposobnosti dugoročnog pamćenja. Veselo raspoloženje može nam pomoći da se više fokusiramo i koncentrišemo tokom procesa učenja i razmišljanja, čime pomažemo poboljšanju sposobnosti pamćenja. Dugotrajno namjerno pamćenje također može potaknuti stvaranje novih neuronskih veza i struktura u mozgu, što je također vrlo korisno za buduće učenje i pamćenje.

Stoga možemo zaključiti da postoji korelacija između ekspresije gena i pamćenja. Svoju sposobnost pamćenja možemo promovirati i poboljšati kroz namjerno pamćenje, optimizam i pozitivno razmišljanje, što nam također može pomoći da postignemo bolje fizičko i mentalno zdravlje. Samo na taj način možemo bolje služiti društvu i ljudskom razvoju. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal koji ima mnogo jedinstvenih učinaka, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost mljevenog mesa proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući kiselinu, polisaharide, flavonoide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite znati suplemente za poboljšanje pamćenja

Međutim, slušni kortikalni geni koji podržavaju slušno učenje, pamćenje i stečeno ponašanje specifično za zvuk uglavnom su nepoznati. Ovaj izvještaj je prvi koji identificira promjene u genomu u ekspresiji gena izazvane učenjem unutar slušne kore za koju se smatra da leži u osnovi formiranja slušne memorije. Bioinformatičke analize na profilima obogaćivanja gena iz sekvenciranja RNK identificirale su biološke puteve koji uključuju holinergičke sinapse i interakcije neuroaktivnih receptora.

Nalazi karakteriziraju ključne kandidate za efekte koji su u osnovi promjena u kortikalnim funkcijama koje podržavaju formiranje dugotrajne slušne memorije u mozgu odrasle osobe. Identificirani molekuli i mehanizmi potencijalni su terapijski ciljevi za olakšavanje dugoročnih i zvučnih promjena u slušnoj funkciji u odrasloj dobi i sada su primarni za buduća istraživanja usmjerena na gene.

rukopis:

Dobro prihvaćen koncept u području učenja i pamćenja je da se sjećanja pohranjuju tamo gdje se obrađuju (Nadel & Hardt, 2011). Biološki događaji poznati kao konsolidacija pamćenja mogu stabilizirati prolazne neuronske reprezentacije izazvane osjetilnim iskustvom (Lechner, Squire i Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Fundamentalni i evolucijski očuvani mehanizmi koji pokreću konsolidaciju pamćenja su transkripcija i translacija, definirani kao aktivna ekspresija gena i njihovih naknadnih proteinskih proizvoda (Alberini &Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Pretpostavili smo da učenje diskriminacije zvukom izaziva de novo ekspresiju gena unutar slušnog korteksa. Vrlo specifične reprezentacije zvučnih znakova mogu nadživjeti prolaznost iskustva (sekunde i minute) konsolidacijom u dugotrajnu memoriju (sati do dani) koja kasnije usmjerava ponašanje izazvano zvukom. Dok se smatra da su različiti regionalni transkriptomski profili odgovorni za konsolidaciju pamćenja (Katzman, et al., 2021), događaji transkripcije izazvani učenjem koji podržavaju formiranje memorije u centralnom slušnom sistemu su ozbiljno nedovoljno opisani.

Nasuprot tome, slušni korteks je izuzetno dobro opisan u studijama slušnog učenja i pamćenja na nivou neurofizioloških promjena, posebno u receptivnim poljima i tonotopskim mapama (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), kortiko kortikalna i kortiko-fugalna povezanost (Souffi et al., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu et al., 2011; Xiong, Znamenskiy i Zador, 2015), uključujući na više vremenskih skala (Froemke& Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David i Shamma, 2007; Tchernichovski i Margoliash, 2013). Štaviše, neurofiziološke promjene su povezane s ponašanjem, npr. za djelovanje usmjereno na znak (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), pažnju (Fritz et al., 2007; Elhilali et al., 2007) i pamćenje za zvučne signale (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso i Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, &Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Decenijama dokaza za neurofiziološku plastičnost u slušnom korteksu izazvanu učenjem pokazala su zajedničke karakteristike ponašanja slušne memorije (Weinberger 2007a; 2007b), što ga čini glavnim kandidatom za konsolidaciju slušnog pamćenja. Bioinformatičkim istraživanjem slušnog korteksa, također koristimo nepristrasnu priliku da otkrijemo uobičajene ili različite biološke čuvare neuroplastičnosti u osnovi adaptivne slušne funkcije u cijelom mozgu. Iz šire perspektive, regionalno transkriptomsko profiliranje može dovesti do potpunijeg razumijevanja načina na koji je senzorni sistem modificiran iskustvom u službi pamćenja.

Transkriptomski profili izazvani učenjem identificirani unutar slušnog korteksa mogu potvrditi, proširiti ili dovesti do novih bioloških modela procesa koji podržavaju ili narušavaju adaptivnu slušnu obradu. Konsolidacija slušnog pamćenja je vjerovatno proizvod promjena u ekspresiji gena ovisnih o iskustvu koje utječu na ćelijske funkcije unutar slušnog korteksa, što zauzvrat potiče trajne promjene neurofiziološkog odgovora izazvanog zvukom koje mijenjaju zvukom izazvana ponašanja.

Da bi se identifikovali transkripti izazvani učenjem, analiza profilisanja ekspresije, korišćenjem RNAsekvencije (RNAseq) izvršena je na uzorcima anatomski definisanog slušnog korteksa (Bregma -3.10 mm, Interaural 6.90 mm; Paxinos & Watson, 2007. ) od odraslih pacova sa ograničenom količinom vode, obučenih da prešu štap do čistih tonova za nagradu za vodu. Odgovori na ciljnu čistu frekvenciju tona (5,0 kHz; 65 dB SPL) rezultirali su nagradom, dok su odgovori na neciljnu (11,5 kHz; 65 dB SPL) bili nenagrađeni i započeli su vremenski period koji je produžio vrijeme do sljedećeg ispitivanja.

Ovaj zadatak dvotonske diskriminacije (2TD) nije težak perceptivno; akustične frekvencije su udaljene preko oktave i lako ih razlikuju glodari (Talwar & Gerstein, 1998). Umjesto toga, izazov u ponašanju bio je asocijativan: 2TD performanse zahtijevaju pamćenje za koje je ton povezan s nagradom (nasuprot bez nagrade). Obučeni pacovi (N=8) su žrtvovani nakon tri uzastopne dnevne 45-minute 2TD treninga i upoređeni sa grupom zdravo naivnih pacova (N=4). Ovo je vremenska tačka u ranoj fazi treninga kada životinje još uvek usvajaju zadatak 2TD. Rano usvajanje zadataka bilo je usmjereno na hvatanje početnih transkripcijskih događaja izazvanih učenjem koji su postavili teren za kasnija povećanja performansi 2TD uočena u ponašanju tokom sedmica treninga.

Na primjer, prosječni učinak je bio iznad šanse, ali samo 66±7,81% nakon 3 dana, u poređenju sa većim ili jednakim 90% nakon produženog treninga (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019.). Kako bismo iskoristili priliku da identifikujemo ekspresiju gena relevantnih za uspješnu asocijativnu memoriju specifičnu za zvuk, iskoristili smo inhibitor HDAC koji cilja na sepigenetsku regulaciju ekspresije gena zavisne od aktivnosti u učenju i formiranju pamćenja (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et. al., 2017.; Malvaez, et al., 2012.). Važno je da je decenija rada pokazala da HDAC-inhibicija može olakšati neurofiziološku plastičnost izazvanu učenjem u zvučno izazvanim slušnim kortikalnim odgovorima (u odnosu na vozilo) i poboljšati slušno diskriminativno ponašanje (Bieszczad et al., 2015; Phan et al., 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) uključujući neljude (Gervain, et al., 2013).

Polovina obučenih životinja tretirana je inhibitorom HDAC, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; sub. cu. injekcija) , dok je druga polovina bila identično obučena, ali primijenjena otopina nosača (N=4; podudarna zapremina, sub. cu. injekcija; Slika 1a). Nije bilo razlika u performansama 2TD između grupa u vrijeme prikupljanja mozga (RGFP966: 61±5,0% naspram vozila: 71±7,0%; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 Welch-ov t-test). Mozgovi su odmah prikupljeni i zamrznuti u vremenskoj tački u skladu s vršnom koncentracijom inhibitora u slušnom korteksu, jedan sat nakon injekcije bilo HDAC inhibitora ili vehikuluma nakon sesije (Bieszczad et al., 2015).

Ovi nalazi su prvi koji identifikuju transkriptomski profil asocijativnog učenja unutar slušnog korteksa. Učenje u zadatku dvotonske diskriminacije izazvalo je promjene u nivoima transkripcije stotina gena (u poređenju sa naivnim zvukom) (slika 1b). Algoritam hijerarhijskog grupisanja pokazao je da su geni jedinstveno regulirani naviše ili na niže, otkrivajući složenu mrežu događaja ekspresije kortikalnih gena izazvanih slušnim učenjem (slika 2a).

Analize obogaćivanja (iPathwayGuideTM; metoda analize uticaja) identificirale su holinergičku sinapsu (diferencijalno izraženi geni (DEG) / svi geni (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) kao glavni biološki put (Tabela 1) . Ovaj rezultat je u skladu s istraživanjima od 1990-ih koja naglašavaju dovoljnost kolinergičke signalizacije u slušnom korteksu za neurofiziološku plastičnost i povezano slušno ponašanje (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard1998). Nivoi transkripta izazvani učenjem pod HDAC-inhibicijom su ili pojačani u istom pravcu (daljnjim povećanjem ili daljim smanjenjem nivoa jedinstvenog transkripta gena) (Slika 2b) ili su smanjeni u poređenju sa samo učenjem (Slika 2c). Jedan od glavnih bioloških puteva u ovim uslovima bila je interakcija neuroaktivnog liganda i receptora (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; Tabela 1) koja je uključivala efektore ključne za neuralnu aktivaciju.

Drugi glavni put bio je interakcija receptora ekstracelularnog matriksa (ECM-receptor) (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; Tabela 1). Komponente ECM-a su kritične za kortikalnu plastičnost i konsolidaciju pamćenja (Happel, et al., 2014; Banerjee, et al., 2017; El-Tabbal, et al., 2021; Sonntag, et al., 2015). Ovi putevi nude potencijalne alternative, možda komplementarne, holinergičkoj signalizaciji koja može olakšati trajne promjene u slušnoj funkciji zavisne od iskustva (Ji, Gao i Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Drugi geni čija se ekspresija promijenila sa slušnim učenjem, ali ne dalje sa HDAC-inhibicijom, vjerovatno su bili povezani sa proceduralnim uslovima zadatka, a ne sa asocijativnom memorijom specifičnom za zvuk. Na primjer, identificiran je signalni put apelina (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), koji je važan u mozgu za homeostatsku regulaciju unosa vode (Hu, et al., 2021). Direktno poređenje nivoa transkripta između dvije grupe obučenih pacova (koji uče sa ili bez HDAC inhibicije) pokazalo je vrlo malo jedinstveno različito izraženih gena (DEG).

Prag koji se značajno koristi za identifikaciju najvjerovatnijih DEG-ova (p =0.05) za koji je utvrđeno da su samo Adamts13, U6, Rexo4 i Cabin1 različito izraženi (slika 2d). Dakle, čini se da je glavni efekat inhibicije HDAC moduliraju ekspresiju gena izazvanu slušnim učenjem u normalnim uvjetima, umjesto da se regrutuju jedinstveni geni koji služe memoriji specifičnoj za zvuk. Zajedno, ovi nalazi pokazuju da se velike transkriptomske promjene dešavaju u slušnom korteksu u ranoj fazi treninga dok odrasle životinje uče da razlikuju asocijativne odnose između zvučnih znakova. Zajedno sa utvrđenim neurofiziološkim i bihevioralnim izvještajima o inhibiciji HDAC-a za promoviranje slušne funkcije, ovi nalazi podržavaju taktiku korištenja HDAC inhibitora za razlikovanje gena čija ekspresija određuje uspjeh formiranja slušne memorije.

Nekoliko gena od interesa (GOI) odabrano je iz analiza obogaćivanja u biološkim putevima kako bi se potvrdilo sekvenciranje u cijelom genomu s pristupom ciljanim na gen. Uzorci su prikupljeni iz odvojenih kohorti koje su replicirale dvije grupe obučenih i tretiranih životinja u istom ranom periodu. vremenska tačka treninga (tj. jedan sat nakon treće sesije 2TD treninga) za upotrebu u analizi ekspresije gena koristeći kvantitativnu lančanu reakciju polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR). Nije bilo razlika u performansama 2TD u repliciranim kohortama (RGFP9661: 61±5.0% naspram RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274; i Vehicle1:71±6.0% naspram Vehicle2: 74±3.0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; Welch-ov t-test).

Prvi GOI bio je Egr1, dobro proučen, "neposredno rani gen" zavisan od aktivnosti za koji se zna da dostiže vrhunac u prvim satima učenja i koji je ključan za formiranje pamćenja (Duclot & Kabbaj, 2017). To je bio gen koji je inducirao toplearning s potvrđenom povećanom ekspresijom koji je također bio pojačan inhibicijom HDAC u odvojenoj skupini životinja u studiji ciljanoj na gen (slika 3). Isto je važilo i za Per2, gen uključen u regulaciju cirkadijalnih ritmova i serotoninergičkih puteva u mozgu (Bae, et al., 2001; Albrecht, et al., 2001; Cuesta, et al., 2009; Reh, et al. ,2020). Per2 je dio porodice "gena sata" koja je povezana s HDAC modulacijom u drugim regijama mozga (Kwapis, et al., 2018) i može imati ulogu i u slušnoj funkciji (Reh et al., 2020). Nasuprot tome, neke GOI identificirane u cijelom genomu su samo djelimično potvrđene.

Chrna7 kodira podjedinicu dinamičkog nikotinskog acetilkolinskog receptora (nAChR) za koju je utvrđeno da je smanjena regulacijom slušnog učenja, u skladu s neurofiziološkim dokazima (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Stoga smo očekivali da će studija usmjerena na gen potvrditi smanjenje regulacije Chrna7 kod svih 2TD obučenih životinja, ali je smanjenje regulacije bilo očito samo kod životinja tretiranih vozilom koje su naučile 2TD bez HDAC inhibicije. Dodatni odabrani GOI bili su iz porodice nuklearnih receptora siročad Nr4a, Nr4a1 i Nr4a2, koji su geni za koje se navodi da su neophodni za propagiranje nizvodnih efekata selektivne HDAC mete RGFP966 u drugim regijama mozga (McQuown et al., 2011; Kwapis, et al. ., 2019.).

U skladu sa prethodnim izveštajima o regionalnim razlikama u ekspresiji gena porodice Nr4a u zavisnosti od zadatka (McNulty, et al., 2012), Nr4a1, ali ne i Nr4a2, bio je pojačano regulisan u slušnom korteksu nakon auditivnog učenja. Drugi DEG, Htr1a ili Adamts13, nisu potvrđeni genskim ciljanim studijama, vjerovatno zbog razlika u poznatim varijantama transkripta koje nisu otkrivene našim prilagođenim sondama ciljanim na gene, ili zbog greške tipa I, ili zbog suptilnih razlika u ponašanju između obučenih kohorti životinja koje ostao neotkriven u 2TD mjerama performansi. Također smo istraživali Lynx1, gen s dugom istorijom funkcije za ponovno otvaranje plastičnosti poput "kritičnog perioda" u senzornom korteksu (Morishita et al., 2010.), vjerovatno zbog njegovog djelovanja na holinergičku i serotonergičku modulaciju (Takesian, et al. , 2018). Međutim, u skladu s prethodnim izvještajima o cijelom genomu koji nisu uspjeli u otkrivanju (Kalish, et al., 2020), nije otkriven ni u našem skupu podataka RNAseq niti u studiji ciljanoj na gene.

Iako ostaje izazov odrediti mogu li se neslaganja objasniti stvarnom biološkom ili individualnom varijabilnosti između životinja, ili zbog tehničke varijabilnosti s niskim obiljem ili specifičnim ekspresnim transkriptima za tip ćelije, mi izvještavamo o izuzetno konzistentnim rezultatima za neke GOI. Kako je ekspresija Chrna7, Egr1 i Per2 izazvana učenjem konzistentna između pristupa ciljanog na gen i genoma, i između različitih kohorti dresiranih životinja, logično je da ovi geni mogu biti najvažniji igrači za trajne promjene u slušne funkcije i pamćenja i sada su najvažniji za buduća istraživanja.

Razmotreni zajedno, nalazi otkrivaju dinamičan transkripcijski krajolik u odraslom slušnom korteksu koji bi mogao podržati pojavu slušne funkcije u neurofiziologiji i ponašanju. S obzirom na sve veće dokaze o epigenetskoj kontroli funkcije senzornog sistema (usp., Shang & Bieszczad, 2022), uzbudljivo je razmotriti kako epigenetski mehanizmi igraju ulogu u balansiranju stabilnosti sa plastičnošću slušnih kortikalnih kola koja zavisi od iskustva. Na primjer, trenutni skup podataka za cijeli genom također je identificirao smanjenje ekspresije arepresivne histon deacetilaze, Hdac9, izazvano učenjem, koje je izostalo s HDAC inhibicijom.

Primamljivo je usporediti učinak smanjene ekspresije HDAC9 s učinkom farmakološki inhibicije HDAC-a za promoviranje transkripcije izazvane učenjem. Druga važna klasa epigenetskih regulatora mijenja DNK, a ne histone. Primjeri su Tet1 i Gadd45b koji oba utječu na metilaciju DNK (Bayraktar & Kreutz, 2018) i za koje je utvrđeno da su regulirani naniže i naviše s učenjem, respektivno, pod inhibicijom HDAC. Nadalje, klasa mikroRNA pojavila se kao vrhunski biološki put induciran učenjem sa HDAC-inhibicijom (vidi tabelu 1), koje su stekle privlačnost na terenu kao ključni epigenetički regulatori neuralne transkripcione kontrole (Saab & Mansuy, 2014). Molekularne interakcije višeg reda između epigenetskih igrača i proteinskih proizvoda eksprimiranih gena su također vjerovatne. Na primjer, identificirani gore regulirani Egr1 može regrutirati Tet1 da ukloni represivne oznake metilacije kako bi aktivirao nizvodne gene (Sun, et al., 2019). Biće potrebne dalje molekularne studije kako bi se razjasnio značaj interakcija između epigenetskih regulatora u slušnom sistemu tokom učenja. Štaviše, ovaj izvještaj predstavlja neposrednu priliku da se uspostave veze između odabranih slušnih kortikalnih gena i njihovih nizvodnih efektora.

Premošćivanje jaza između ovih gena i molekula do njihovog uticaja na neurofiziološke događaje izazvane zvukom je od suštinskog značaja za razumevanje načina na koji se slušni sistem odraslih prilagođava sa iskustvom da bi promenio ponašanje. Zaista, prijevod de novo transkripta je potreban za dugoročne promjene funkcije ponašanja jer proizvode trajne promjene u ćelijskoj funkciji. Na primjer, ključni ciljni efektori transkripcijskih procesa izazvanih učenjem mogu promijeniti dostupnost kanala ili receptora (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) unutar kola koja određuju zvuk. evocirani prag, responzivnost i arhitektura receptivnog polja u slušnom sistemu. Razumno je pretpostaviti da bi različiti auditivni zadaci regrutirali jedinstvene genetske mreže za biološke puteve relevantne za određene ćelijske funkcije koje bi podržale učenje za zvučne karakteristike ili strukturu zadatka relevantne za zadatak.

Sve u svemu, ovaj izvještaj služi kao početna tačka za stavljanje na raspolaganje RNAseq skupova podataka iz korteksa za učenje, odraslih i slušnog korteksa (pogledajte Repozitorijum podataka). Napor da se smanji jaz u znanju pogoršan ozbiljnim nedostatkom studija koje se fokusiraju na molekularne genetske procese u slušnom korteksu odraslih sada je dobrodošao. Podstičemo proučavanje izvan prostorno-vremenskih ograničenja masovnog sekvenciranja RNK čija je osjetljivost tehnički ograničena i dubinom čitanja (Li& Wang, 2021), posebno zato što se moderne Omics tehnologije brzo razvijaju i poboljšavaju.

Dok su istraživanja u slušnom korteksu napravila neke početne korake u molekularnoj genetici koja je identificirala bitne molekularne kaskade (Schicknick, et al., 2008), permisivni IEG profili (Mello, Velho i Pinaud, 2006; de Hoz, et al., 2018 ; Peter, et al., 2011.) pa čak i hromatinske dinamike (Peter, et al., 2021.), postoji presedan u slušnoj periferiji gdje se dinamika transkripcije lijepo proučava (Kwan, 2016; Barta, et al., 2018; Li, et al. al., 2020; Ebeid, et al., 2017.). Postojeći molekularni alati kao što su jednoćelijsko RNA sekvenciranje (RNA-Seq) i fluorescentna in situ hibridizacija malih molekula (smFISH) bit će korisni za pružanje uvida u varijacije stanica-ćelija ovisne o iskustvu i molekularne interakcije unutar slušnih kortikalnih ćelija i krugova. Za razliku od bulk RNAseq-a, ove metode poštuju duboku ćelijsku raznolikost i organizaciju višeg reda u slušnom korteksu, kao što su mikrokrugovi specifični za sloj i lemniska topografija.
Pametni pristupi označavanju i sekvenci transkripata iz tek nedavno aktivnih slušnih kortikalnih ćelija (Cho, Huang, & Grey, 2016) mogu povećati osjetljivost dovoljno da se pouzdano dobiju funkcionalno najrelevantniji setovi gena iz funkcionalno najrelevantnijih tipova ćelija i populacija. Slični pristupi bi se mogli koristiti i subkortikalno za hvatanje i kontrastiranje regionalnih transkriptomskih profila zavisnih od aktivnosti u korteksu koji poštuju nevjerovatnu integraciju kortikala sa subkortikalnom funkcijom slušnog sistema pod različitim uvjetima slušanja ili zahtjevima ponašanja. Potpuno karakteriziranje staničnih i regionalnih razlika u genetskim i molekularnim mehanizmima na kojima se temelji slušno učenje u mozgu odraslih je ključno za razvoj precizne terapije selektivne lokacije i molekule ciljane koja omogućava robusne i trajne funkcionalne promjene za podršku specifičnim sposobnostima sluha i slušanja tijekom životnog vijeka.

Metode

Subjekti: Ukupno 24 odrasla mužjaka Sprague-Dawley štakora (250 – 300 g po dolasku; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) korištena su u bihevioralnim i molekularnim eksperimentima. Sve životinje su pojedinačno smještene u sobi za kolonije s kontroliranom temperaturom (24 ˚C) na 12-satnom svjetlo/tamnom ciklusu. Ispitanici su imali ad libitum pristup hrani i vodi prije treninga ponašanja. Sve procedure su odobrene i provedene u skladu sa smjernicama od strane Institucionalne komisije za njegu i korištenje životinja (IACUC) na Rutgersu, Državni univerzitet New Jersey (Protokol br.:999900026 (KMB)).

Bihevioralni aparati i zvučni stimulansi: Sve sesije ponašanja su provedene u dvije identične instrumentalne komore za kondicioniranje (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) unutar zvučno prigušene kutije. Dnevne sesije obuke bile su uravnotežene kako bi se osigurala jednaka izloženost objema komorama. Svaka komora (12" Š x 10" D x 12" V; pod od žičane mreže je bio opremljen polugom za odziv (H21-03R), kućnim svjetlom (H11-01R), zvučnikom (H{ {8}}R), i sistem za dovod vode (H14-05R). Tokom faza treninga, životinje su mogle pritisnuti polugu odgovora ("barpress"), što je pokrenulo predstavljanje čaše za vodu (~0,02cc) u nagradnom portu (1,25"Š x 1,625"H). Ručni prekidač (H21-01) je korišten tokom rane sesije da se oblikuje reakcija na pritisak na šipku životinje kako bi se pokrenule prezentacije čaše za vodu koja je omogućila pristup Reakcije u ponašanju su snimljene korišćenjem softvera Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) za vanmrežnu analizu.

Svi slušni stimulansi su generisani korišćenjem Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) i RPvdsEx softvera i predstavljeni preko zvučnika koji se montira na zid u operantnoj komori. Bijeli šum (tokom proceduralne obuke; slika 1a) je bio prikazan u trajanju od 7 ili 9 s (75 dB SPL). Čisti tonovi (tokom dvotonskog treninga diskriminacije; slika 1a) su uvijek bili prikazani tokom 8 s (70 dB SPL). Nivoi zvuka su svakodnevno kalibrisani pomoću digitalnog merača zvuka (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Obuka ponašanja i farmakološka inhibicija HDAC3: Nakon jednog dana aklimatizacije na vivarijum, pacovi su tretirani svakodnevno najmanje 3 dana. Prije početka treninga ponašanja, štakori su stavljeni na režim ograničene količine vode sve dok nisu dostigli 85% neograničene težine kontrolnih životinja odgovarajuće dobi. Pacovi sa ograničenom količinom vode su zatim oblikovani unutar zvučno prigušenih komora kako bi pritisnuli vodu za nagradu (slika 1a). Oblikovanje barpressa i kasniji trening zvuka bili su kao što je prethodno opisano (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019.). Ukratko, sve životinje su oblikovane da pritiskaju barpress tokom 5 dana, a zatim su obučene u proceduralni zadatak da nauče da pritiskaju na zvuk, što je u ovoj fazi bio je širokopojasni Gausov stimulans šuma (1-12.5 kHz propusno filtrirani bijeli šum; 75 dB SPL), da bi se dobila nagrada za vodu. Sve životinje su uspješno naučile povezivati ​​ovaj zvuk s nagradom prije nego što su prešle na sljedeću fazu treninga. Proceduralna obuka pokazala je individualnu varijabilnost u tome koliko brzo životinje mogu naučiti zadatak do visokog nivoa učinka. Ipak, sve životinje su uspjele postići nivo performansi veći ili jednak 90% dva uzastopna dana (srednja vrijednost=92,85%, sem =0,01%) nakon prosjeka od 12,67 dana ( sd=2.85 dana). Učinak je izračunat korištenjem 100%.

Sljedeća faza obuke bio je zadatak dvotonske diskriminacije (2TD) (slika 1a), u kojem su pacovi obučeni da razlikuju dvije spektralno različite zvučne frekvencije. Pritisci na S+ ton (5.0 kHz; 70 dB SPL) bi rezultirali dodjelom vodene nagrade, dok bi pritisci šipke na Stone (11,5 kHz; 70 dB SPL) rezultirali signalom greške (bljeskanje kuće). svjetlo) i "tajm-aut" (dodatnih 6 s čekanja za početak sljedećeg suđenja). S+ i S-S-pokusi su bili randomizirani i trajali su 8 s. Inter-probni intervali (ITI) bili su u prosjeku 15 s (opseg: 5-25 s, randomizirano). Pritisci na traku tokom tihog ITI-a nisu bili bitni (bez tajm-auta, bez signala greške, niti nagrade za vodu). Dnevne sesije su trajale 45 minuta. Sve životinje su izvodile 2TD zadatak ukupno tri uzastopna dana. Pacove je upario obučeni posmatrač tako da su životinje sa sličnim stopama usvajanja proceduralnog zadatka dobile različite uslove tretmana u 2TD fazi. Parovi usklađeni po učinku primili su sistemske injekcije ili inhibitora HDAC3 farmakološke klase I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg; sc; N=12) ili rastvora nosača (N=9) odmah nakon svake 2TD session. Izvedba zadatka 2TD izračunata je kako je prethodno opisano: 100% (Shang,Bylipudi i Bieszczad, 20).

). Sakupljanje tkiva i izolacija RNK: Jedan sat nakon što su životinje primile treću i završnu injekciju RGFP966 nakon treće sesije 2TD, mozgovi su brzo secirani i fleš zamrznuti u čaši 2-metilbutana postavljenoj na suvi led. Flash zamrznuti mozgovi su zatim pohranjeni na -80˚ C do buduće obrade. Da bi se mozak pripremio za kriosekciju, mozgovi su obloženi spojem neoptimalne temperature rezanja (OCT) i pohranjeni na -20˚ C 12-24 sati kako bi se osiguralo da će moždano tkivo dostići -20˚ C za rezanje. Mozgovi koji su umotani u OCT bi se tada rezali horizontalno u kriostatu (Leica CM 3050S) debljine 250 µm. Koristeći mikro bušilicu okruglog tkiva od 1 mm, uzorkovano je 2 mm3 slušnog kortikalnog tkiva sa svake hemisfere (kombinovano u jedan uzorak za ukupno 4 mm3 po regiji mozga) za ekstrakciju RNK. Slušna kortekslokacija je identificirana korištenjem Paxinosa i Watsona The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6. izdanje) kao referenca (približno A/P=-3.6 do -5.8 mm, M/L {{20} } ±6.4 mm D/V=-4.2 do -5.8 mm; i korištenje hipokampusa kao orijentira

Ukupna RNK iz svakog uzorka je izolirana korištenjem PureLinkTM RNA Mini Kita (ThermoFisher) korištenjem protokola proizvođača. Uzorci RNA su zatim pročišćeni kompletom RNA Clean andConcentratorTM -25 (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), biblioteke za sekvenciranje su generisane korišćenjem Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit-a prema protokolima koje preporučuje proizvođač. Biblioteke su objedinjene i sekvenciranje je izvedeno na Illumina NovaSeq 6000 koji radi 100 bp uparenog kraja SBSchemistry. Čitanja su obrađena pomoću 'bcbio-nextgen.py' otvorenog informatičkog cevovoda koji je prvenstveno razvijen u Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) koji radi na Argon HPCresource na Univerzitetu u Ajovi. Ovaj cijev uključuje pristupe 'najbolje prakse' za kontrolu kvaliteta čitanja, poravnanje čitanja i kvantitaciju. Cjevovod 'bcbio-nextgen.py' je pokrenut u "RNA-seq" modu sa ključem 'rn6' kao odabranom konstrukcijom genoma (interno referencira sklop Ensembl i genebuild 'Rnor_6.0'). Poravnani cjevovod čita do genoma Rnor_6.0 koristeći ultra-brzi hisat2 aligner (2.2.1) i istovremeno kvantificirano čita na transkriptomu koristeći 'losos' (1.4.0) aligner. Qualimap (2.2.2), računski alat koji ispituje hisat2 BAM datoteke poravnanja, korišten je za ispitivanje pročitanih podataka radi kontrole kvaliteta. Rezultati kvaliteta sekvenci prošli su osnovne provjere i stope dupliciranja sekvence bile su unutar prihvatljivih parametara. Svi uzorci su prošli QC radi usklađivanja čitanja sa egzonskim regionima. Kvantifikacije transkripta dobijenih od lososa (TPM ili "transkripti na milion") su uvezene i sažete u procenjene brojeve na nivou gena koristeći tximport (1.12.3) u Rstudio, kako je opisano u najboljem- vježba DESeq2 vinjetu(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Geni s manje od 5 procijenjenih broja u svim uzorcima prethodno su filtrirani iz nizvodne analize, prema preporučenoj proceduri. Analiza diferencijalne ekspresije gena je provedena sa DESeq2 (v.1.24.0) na procijenjenom nivou gena. FDR od 5% i X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Validacija RNA-seq podataka pomoću qRT-PCR: RNA-seq podaci su potvrđeni qRT-PCR-om na mRNA ekstrahiranoj iz različitih kohorti pacova. Pet transkripata je odabrano sa liste novih DEG-ova obogaćenih u svakoj regiji na početku. Tri gena su bila zasnovana na hipotezama zasnovana na slušnoj kortikalnoj fiziološkoj i bihejvioralnoj literaturi, dok su još tri gena bili novi geni identifikovani na nivou gena i DEG analizama u poređenju između grupa lekova i vozila. Sve sekvence prajmera su odabrane ili iz prethodne literature o moždanom tkivu kod pacova (sekvencije date u donjoj tabeli) ili dizajnirane korišćenjem NCBI Primer Blast i validirane za ciljnu specifičnost procenom krivulja topljenja i sekvenciranja PCR amplikona. qRT-PCR analize su izvedene u QuantStudio 3 (Applied Biosystems) sa SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Za svaki uzorak, 500 ng cDNK je amplificirano pomoću iScriptTM kompleta za sintezu cDNA (Bio-Rad).

Priznanja

Autori se žele zahvaliti dr. Andrea Shang, Sean Tsaur i Sooraz Bylipudi na njihovoj pomoći u postupcima ponašanja i analizi; dr. Mimi L. Phan za njenu pomoć oko ekstrakcije RNK i protokola za prikupljanje uzoraka; Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi i ChristopherO'Brien za njihovu pomoć u analizi pročišćavanja uzoraka RNK; i Alisa Ray za tehničku pomoć. Zahvaljujemo se svom sadašnjem i bivšem osoblju CLEF Lab-a na njihovoj pomoći i podršci.

Ovaj rad su podržali Nacionalni instituti za zdravlje, Nacionalni institut za gluvoću i komunikacijske poremećaje [R01-DC014753 za KMB]; Škola za umjetnost i nauku na Univerzitetu Rutgers; fondacija Aresty na Univerzitetu Rutgers sa malim grantovima za dodiplomska istraživanja; i program Project SUPER na Univerzitetu Rutgers sa malim grantovima za dodiplomska istraživanja.

Reference:

Alberini, CM i Kandel, ER (2014). Regulacija transkripcije u konsolidaciji pamćenja. ColdSpring Harbor Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 i mper2 su neophodni za normalno resetovanje cirkadijalnog sata. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). Senzorni neokorteks i asocijativno pamćenje. BehavioralNeuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Diferencijalne funkcije mPer1, mPer2 i mPer3 u SCN cirkadijalnom satu. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS, & Weinberger, NM (1996). Indukcija fiziološke memorije u korteksu velikog mozga stimulacijom nucleus basalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Perineuronske mreže u senzornom korteksu odraslih su neophodne za učenje straha. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . On, DZ (2018). RNA-seq transkriptomikanaliza dlačnih stanica unutrašnjeg uha odraslih zebrica. Naučni podaci, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G., & Kreutz, MR (2018). Uloga demetilacije DNK zavisne od aktivnosti u mozgu odraslih i neurološkim poremećajima. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Inhibicija histon deacetilaze putem RGFP966 oslobađa kočnice senzorne kortikalne plastičnosti i specifičnosti formiranja memorije. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0914-15.2015

Brown, MR, & Kaczmarek, LK (2011). Modulacija kalijumovih kanala i slušna obrada. Istraživanje sluha, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN (2018). Lynx1 sprječava dugotrajnu blokadu potenciranja i smanjenje ekspresije neuromodulatora uzrokovane A 1-42 i JNK aktivacijom. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com