Funkcionalni odziv memorijskih T ćelija kod pacijenata sa COVID-19

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Ece Tavukcuoglua,, Utku Horzum1 a,, Ahmet Cagkan Inkaya1 , Serhat Unal ,bb Gunes Esendaglia, *

a Odsjek za osnovnu onkologiju, Institut za rak Univerziteta Hacettepe, Ankara, Turska

b Katedra za infektivne bolesti, Medicinski fakultet Univerziteta Hacettepe, Ankara, Turska

Ključne riječi: SARS-CoV{1}} CentralmemorijaT ćelije, EfektormemorijaT ćelije, glikoprotein Spike S1 Dendritične ćelije Pomoćne T ćelije Citotoksični T limfociti

SAŽETAK: PrisustvomemorijaT ćelije kod pacijenata sa COVID-19 su potvrđene, međutim funkcionalna moćmemorijaodgovori su kritični za zaštitu. U ovoj studiji, naivna, efektorska, efektorska memorija i centralnamemorijaCD4 plus i CD8 plus T ćelije dobijene od preživjelih od COVID-19 ponovno su izložene autolognim DC-ovima izvedenim iz monocita koji su bili napunjeni SARS-CoV-2 šiljastim glikoproteinom S1. Kapacitet proliferacije, CD25, 4-1BB i PD-1

ekspresija, a izlučivanje IFN-, IL-6, granzima, granulizina i FasL-a je pojačano u CD4 plus i CD8 plus efektorumemorijai centralnomemorijaT ćelije. Iako su na heterogenim nivoima,memorijaT ćelije osoba sa istorijom COVID-19 posjeduju funkcionalne kapacitete da osnaže antivirusni imunitet protiv SARS-CoV-2.

Kliknite zaCistanche deserticola ma za poboljšanje pamćenja

1. Uvod

Uprkos novim podacima o korona virusnoj bolesti 2019. (COVID-19), imuni odgovor na teški akutni respiratorni sindrom korona virus 2 (SARS-CoV-2) ostaje da se bolje definira. Snaga i trajanje humoralnih i ćelijskih odgovora na SARS-CoV-2 povezani su s neutralizirajućim antitijelima imemorijaT ćelije [1,2]. Posebno, šiljasti glikoprotein-S1 ima značajnu imunodominaciju jer neutralizirajuća antitijela blokiraju njegovo vezivanje za angiotenzin-konvertirajući enzim 2 (ACE2) i ometaju ulazak virusa [3]. Osim toga, otprilike 50 posto pacijenata pokazalo je S{9}}specifične T ćelijske odgovore [4,5].

Ipak, heterogenost uočena među slučajevima COVID-19 ima zbunjujući efekat. Dok većina pacijenata razvija antivirusni imunitet, čak i rekonvalescenti možda neće biti zaštićeni od ponovne infekcije koja je potencijalno posljedica nedovoljne veličine i/ili stabilnosti T ćelija i proizvodnje antitijela [6–8]. Intrigantno, kod teških infekcija SARS-CoV-2, interakcija između CD4 plus pomoćnih T (Th) ćelija i B ćelija je prigušena u germinativnom centru, što potencijalno smanjuje dugovječnost odgovora antitijela [9]. Zajedno sa Th aktivnostima, robusnost CD8 plus citotoksičnih T ćelija je takođe ključna za uspešan antivirusni imunitet [10]. Ranije je prisustvo CD4 plus ili CD8 plusmemorijaT-ćelije su prijavljene u COVID-19, međutim, funkcionalni kapaciteti ovih ćelija moraju se detaljno pozabaviti [11–13]. U ovoj studiji, funkcionalna odzivnost naivne, efektorske, centralnememorija, te efektorska memorija CD4 plus ili CD8 plus T ćelija, koje su dobijene od pacijenata sa COVID-19 anamnezom, protiv dendritskih ćelija (DC) izvedenih iz monocita koje nose SARS-CoV-2 S1 antigen je potvrđen.

2. Materijal i metode

2.1. Pacijenti i prikupljanje uzoraka

U dvije različite vremenske tačke, uzorci periferne krvi su svježe prikupljeni od pacijenata oporavljenih od COVID-19 (Tabela 1), a mononuklearne ćelije periferne krvi su razdvojene gradijentom gustine Ficoll od 1,077 g/mL (Sigma-Aldrich). Svi protokoli su odobreni od strane lokalnih etičkih komiteta i Ministarstva zdravlja Republike Turske. od pacijenata je dobijen informirani pristanak. U studiju su uključeni pacijenti sa pozitivnim RT-PCR testom i/ili seropozitivnošću. Klinički simptomi su kategorizirani kao blagi (nehospitalizirani pacijenti), umjereni (pacijenti koji su imali umjerenu upalu pluća) i teški (pacijenti koji su imali tešku upalu pluća i bili su hospitalizirani duže od 5 dana). Uzorci krvi zdravih davalaca [n=10 (6 žena, 4 muškarca), srednja starost 33 godine (min 28–max 55)] bez SARS-CoV-2 istorije i seropozitivnosti su korišteni kao kontrola.

2.2. Uspostavljanje kokultura DC i T ćelija izvedenih iz monocita

DC su generisani iz monocita (CD14 MACS, Miltenyi) prema ranije objavljenom protokolu [14]. Punjenje antigenom rekombinantnim S1 proteinom (S1; 10 µg/mL, Abcam) ili HIV Gag antigenom (10 µg/mL, TUBITAK Marmara Research Center) [15] ili tetanus toksoidom (TT; 10 µg/mL, Turk Ilac ) je istovremeno započet sa sazrevanjem DC-ova izvedenih iz monocita sa LPS (1 µg/mL, Sigma-Aldrich). Zreli DC-ovi izvedeni iz monocita generirani u odsustvu a

specifični antigen korišteni su kao kontrole. Na kraju 7-dnevne inkubacije, DC-ovi izvedeni iz monocita su okarakterizirani kao CD11bhiCD14loCD1a plus CD83 plus populacija.

Od istog COVID-19 pacijenta, autologni naivni T (TN), terminalno diferencirani efektor T (TEMRA), centralnimemorijaT (TCM) i efektormemorijaT (TEM) ćelije su pročišćene (veće ili jednako 96 posto) pomoću FACS (FACSAria II; Becton Dickinson) kao CD3-netaknute, CD19- i CD56- negativni limfociti prema na diferencijalnu ekspresiju CD45RA, CD45RO i CCR7 markera (slika 1A).

DC-ovi izvedeni iz monocita (5x104) su kultivisani zajedno sa pročišćenim podtipovima T ćelija (10)5 tokom 96 h u jažici ploče sa okruglim dnom 96-jažica koja sadrži 200 µL RPMI 1640 medija sa 10 posto FBS-a , 1 posto penicilina/streptomicina (Biološka industrija), 5 ng/mL IL-2 (Bio-

Legenda). Prije zajedničkog uzgoja, podtipovi T ćelija su označeni sa 5 µM CFSE (BioLegend). Kao pozitivna kontrola, u kokulture je dodano anti-CD3 antitijelo (HIT3a, 25 ng/mL; BioLegend). Eksperimentalna postavka je sažeta na slici 1A.

2.3. Imunofenotipizacija i testovi vezani za funkciju protočnom citometrijom

Imunofenotipizacija je izvršena sa monoklonskim antitelima anti-humani-CD4 (OKT4), -CD8 (RPA-T8), -CD56 (MEM-188), -CD19 (SJ25C1), -CD45RA (HI100), -CD45RO (UCHL1 ), -CCR7 (G043H7), -CD25 (M-A251), -CD38 (HIT2), -4-1BB (4B4-1), -PD-1 (NAT105), -CD14 (M5E2), -CD11b (ICRF44) (BioLegend); -CD1a (REA736), -CD83 (REA714) (Miltenyi). Srednje vrijednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene su na CD4 plus i CD8 plus T ćelijama, i prema CFSE razblaženju.

Promjena u MFI izračunata je poređenjem podataka iz ko-kultura sa antigenom napunjenim DC i kontrolnim DC.

Procenat T ćelija sa CFSE razblaženjem je procenjen za proliferaciju. Antigen-specifični proliferacijski kapacitet T ćelija izračunat je kao promjena u proliferaciji pri čemu su kao normalizatori korišteni podaci iz kokultura sa kontrolnim DC-ovima izvedenim iz monocita. Sakupljeni supernatanti korišćeni su u multipleks ELISA testu (LEGEND-plex, BioLegend). Sve protočne citometrijske analize su obavljene na FACSAria II sorteru.

2.4. Statistička analiza

Rezultati su predstavljeni kao medijan ± SEM. Za statističke analize korišteni su Kruskal-Wallisov test i Bonferronijeva korekcija. AP vrijednost<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultati

Nakon inkubacije sa S{{0}}DC, identifikovan je mali procenat proliferirajućih T ćelija (procenat opsega, CD4 plus, TN {{0}}.49–6,8, TEMRA 3.29–7.7, TCM 0.38–20.2, TEM 0.2– 16.7; opseg procenata, CD8 plus, TN 0.64–5.6, TEMRA 2.16– 10.3, TCM0.8– 15, TEM 1.6–19.4). I CD4 plus i CD8 plus TCM i TEM ćelije su pokazale značajno povećanu učestalost proliferacije od naivne ili efektorske populacije T ćelija (slika 1B). CD4 plus TCM ćelije i CD8 plus TEM ćelije pokazale su najveću proliferativnu aktivnost. CD4 plusmemorijaProliferacija T ćelija mogla bi biti izazvana kod ~90 posto pacijenata sa COVID-19, međutim, CD8 plusmemorijaProliferacija T ćelija je dokazana samo kod ~60 procenata pacijenata (slika 1B). DC-ovi izvedeni iz monocita također su bili opterećeni irelevantnim virusnim antigenom, HIV Gag; očekivano, nije postignut značajan odgovor u T ćelijama preživjelih od COVID-19 (slika 1C). Slično, T ćelije zdravih osoba nisu reagovale na S1-DC. S druge strane, DC izveden iz monocita koji predstavlja TT antigen služio je kao pozitivna kontrola za T ćelijememorijaodgovori (slika 1C). Pored toga, površinska ekspresija određenih markera vezanih za aktivaciju, posebno CD25, PD-1 i 4-1BB, značajno je povećana na S1-reagirajućim T ćelijama (slika 1D). S1-DC-stimulirane TEM ćelije luče najviše nivoe IFN- i IL-6, koje u velikoj mjeri proizvode CD4 plus T ćelije tipa 1 i CD8 plus citotoksične T ćelije. Markeri citotoksičnog odgovora, granzim A, granulizin, Fas ligand (FasL), a posebno granzim B također su bili povišeni u kokulturama koje sadrže TEM ćelije od COVID-19 pacijenata (slika 1E). Supernatanti kokulture iz kojih su mjereni rastvorljivi faktori sadržavali su medijatore koje luče T ćelije i DC; stoga, kao što je navedeno u literaturi, umjerene količine citokina kao što su TNF-, IL-6, IL-4 i IFN- također mogu biti proizvedene od strane DC [16,17]. U nekim slučajevima, ne-memorijske T ćelije su reagovale na S1-DC, pojačale ekspresiju CD38 i 4-1BB, te lučenje IL-4 i TNF- (Slika 1) . Heterogenost je također zabilježena između proučavanih parametara T ćelija i vremena uzimanja uzorka krvi nakon oporavka, težine kliničkih simptoma ili nivoa anti-S1 antitijela (podaci nisu prikazani).

4. Diskusija

Kod preživjelih od COVID-19, cirkulirajuće S1-specifične TEM i TCM ćelije zadržale su funkcionalnu reakciju i pokazale povećane efektorske kapacitete kao što su aktivacija, proliferacija i izlučivanje imunih medijatora. Iako je proliferativni odgovor umemorijaCD8 plus T ćelije nisu bile tako moćne kao u CD4 plusmemorijaT ćelijama, naši podaci sugeriraju da ove ćelije mogu brzo napredovati u efektorno stanje kada su izložene SARS-CoV-2 S1 antigenu. TEM ćelije su kritični čuvari vrata jer imaju tendenciju da se lociraju u tkiva sklona invaziji patogenih mikroorganizama, dok se TCM ćelije regrutuju u sekundarne limfoidne organe za ubrzavanje imunoloških reakcija koje inauguriraju DC-ovi koji predstavljaju antigen [18]. Iako pokriva ograničen broj slučajeva COVID-19, u našoj studiji, većina pacijenata je sadržavala TEM i TCM ćelije koje su funkcionalno reagirale na S1 protein u smislu najmanje jednog testiranog parametra. Ovi preliminarni nalazi mogu ukazivati ​​na vjerojatni disparitet između funkcionalne sposobnosti T ćelija i težine COVID-19. Prethodna studija je prijavila veću učestalost S1-specifičnih T ćelija od T ćelija specifičnih za N i M proteine ​​[8]. Shodno tome, funkcionalni odgovor T ćelija na druge SARS-CoV-2 antigene ostaje da se bolje razjasni. Nedavno objavljeni temeljni rad pokazao je prisustvo dugoročnogmemorijau T ćelijama pacijenata sa COVID-19 [19,20]. Koristeći poseban eksperimentalni pristup u kojem su autologni DC izvedeni iz monocita korišteni kao izvodljivi element za testiranje odgovora T ćelija, naša studija je potvrdila funkciju i karakter T ćelija koje su prethodno spomenute kod osoba sa COVID-19 istorijom. Akumuliranje dokaza o imunitetu uspostavljenom kod preživjelih od COVID-19 omogućilo bi bolje razumijevanje patogeneze bolesti, terapijskih pristupa i razvoja vakcine.

Slika 1. Procjena funkcionalnih odgovora u T ćelijama preživjelih od COVID-19. A) Prikazan je grafički prikaz eksperimentalne postavke. Dendritične ćelije izvedene iz monocita generirane su od osoba sa COVID-19 istorijom i napunjene SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-S1 (S1-DC); zatim, autologni naivni T (TN), terminalno diferencirani efektor T (TEMRA), centralnimemorijaT (TCM) i efektormemorijaT (TEM) ćelije su pročišćene i zajedno kultivisane sa ovim DC. Proliferacija T ćelija, ekspresija markera aktivacije i sekrecija citokina mjereni su nakon 96 h inkubacije. B) Promena u proliferaciji CD4 plus i CD8 plus T ćelija je ucrtana za svakog pacijenta u poređenju sa onom dobijenom sa kontrolnim kokulturama sa DC izvedenim iz monocita bez specifičnog opterećenja antigenom. Reprezentativni histogrami protočne citometrije dati su na desnoj strani. Ko-kulture stimulirane anti-CD3 monoklonskim antitijelom služile su kao tehnička pozitivna kontrola za proliferaciju T stanica. C) Proliferacijski odgovor TCM i TEM ćelija dobijen od pacijenata na S{{1{{20}}}}DC upoređen je s onima dobijenim s HIV Gag ili sa antigenom tetanus toksoid (TT) -napunjeni DC. T ćelije i S1-DC dobijeni od zdravih osoba (S1(hd)) su također korišteni kao kontrole. D) Promene u nivoima markera aktivacije CD4 plus i CD8 plus T ćelija su prikazane u poređenju sa onima dobijenim sa kontrolnim kokulturama sa DC izvedenim iz monocita bez specifičnog opterećenja antigenom. E) Procijenjena je količina citokina povezanih s T ćelijama izlučenih u supernatante kokulture. (*p < 0,05,="" **p=""><>

CrediT izjava o autorskom doprinosu

Ece Tavukcuoglu: Istraživanje, vizualizacija, formalna analiza, pisanje - recenzija i uređivanje. Utku Horzum: Istraživanje, vizualizacija, formalna analiza, pisanje - recenzija i uređivanje. Ahmet Cagkan Inkaya: Konceptualizacija, resursi. Serhat Unal: Konceptualizacija, resursi. Gunes Esendagli: Konceptualizacija, pisanje - recenzija i uređivanje, nadzor.

Izjava o konkurentskim interesima

Autori izjavljuju da nemaju poznatih suprotstavljenih finansijskih interesa ili ličnih odnosa koji bi mogli uticati na rad prikazan u ovom radu.

Reference

[1] A. Mazzoni, L. Maggi, M. Capone, M. Spinicci, L. Salvati, MG Colao, A. Vanni, ST Kiros, J. Mencarini, L. Zammarchi, E. Mantengoli, L. Menicacci, E Caldini, S. Romagnani, F. Liotta, A. Morettini, GM Rossolini, A. Bartoloni, L. Cosmi, F. Annunziato, Ćelijski posredovani i humoralni adaptivni imuni odgovori na SARS-CoV-2 su niži u asimptomatski nego simptomatski pacijenti COVID-19, Eur. J. Immunol. 50 (2020) 2013–2024.

[2] Y. Tan, F. Liu, X. Xu, Y. Ling, W. Huang, Z. Zhu, M. Guo, Y. Lin, Z. Fu, D. Liang, T. Zhang, J. Fan, M. Xu, H. Lu, S. Chen, Trajnost neutralizirajućih antitijela i odgovor T-ćelija nakon infekcije SARS-CoV{4}}, Front. Med. 14 (2020) 746–751.

[3] C. Conte, F. Sogni, P. Affanni, L. Veronesi, A. Argentiero, S. Esposito, Vakcine protiv korona virusa: The State of the Art, Vaccines (Basel) 8 (2020).

[4] CK Li, H. Wu, H. Yan, S. Ma, L. Wang, M. Zhang, X. Tang, NJ Temperton, RA Weiss, JM Brenchley, DC Douek, J. Mongkolsapaya, BH Tran, CL Lin, GR Screaton, JL Hou, AJ McMichael, XN Xu, Odgovori T ćelija na cijeli SARS koronavirus kod ljudi, J. Immunol. 181 (2008) 5490–5500.

[5] M. Koblischke, MT Traugott, I. Medits, FS Spitzer, A. Zoufaly, L. Weseslindtner, C. Simonitsch, T. Seitz, W. Hoepler, E. Puchhammer-Stockl, SW Aberle, M. Fodinger, A. Bergthaler, M. Kundi, FX Heinz, K. Stiasny, JH Aberle, Dynamics of CD4 T ćelija i odgovor antitijela u COVID-19 pacijenti različite težine bolesti, Front. Med. (Lozana) 7 (2020), 592629.

[6] GA Poljska, IG Ovsyannikova, RB Kennedy, SARS-CoV-2 imunitet: pregled i prijave kandidata za vakcinu faze 3, Lancet 396 (2020) 1595–1606.

[7] R. Zhou, KK To, YC Wong, L. Liu, B. Zhou, X. Li, H. Huang, Y. Mo, TY Luk, TT Lau, P. Yeung, WM Chan, AK Wu, KC Lung, OT Tsang, WS Leung, IF Hung, KY Yuen, Z. Chen, Akutna infekcija SARS-CoV-2 narušava odgovore dendritičkih ćelija i T ćelija, Imunitet 53 (2020) 864–877 e{ {7}}.

[8] A. Grifoni, D. Weiskopf, SI Ramirez, J. Mateus, JM Dan, CR Moderbacher, SARawlings, A. Sutherland, L. Premkumar, RS Jadi, D. Marrama, AM de Silva, A. Frazier, AF Carlin, JA Greenbaum, B. Peters, F. Krammer, DM Smith, S. Crotty, A. Sette, Ciljevi odgovora T ćelija na SARS-CoV-2 Coronavirus kod ljudi s COVID-19 bolešću i Neeksponirani pojedinci, ćelija, 181 (2020) 1489-1501 e1415.

[9] PF Canete, CG Vinuesa, COVID-19 čini da B ćelije zaborave, ali T ćelije pamte, Cell 183 (2020) 13–15.

[10] I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt, K. Wild, LM Seidel, S. Killmer, F. Sagar, MS Daul, A. Lago, H. Decker, B. Luxenburger, D. Binder, O Bettinger, S. Sogukpinar, M. Rieg, D. Panning, M. Huzly, G. Schwemmle, CF Kochs, A. Waller, D. Nieters, F. Duerschmied, HE Emmerich, AR Mei, S. Schulz, DA Llewellyn -Lacey, T. Price, B. Boettler, R. Bengsch, M. Thimme, C.-H. Hofmann, Karakterizacija već postojećih i induciranih SARS-CoV-2-specifičnih CD8( plus ) T ćelija, Nat. Med. 27 (2021) 78–85.

[11] I. Odak, J. Barros-Martins, B. Bošnjak, K. Stahl, S. David, O. Wiesner, M. Busch, M.

M. Hoeper, I. Pink, T. Welte, M. Cornberg, M. Stoll, L. Goudeva, R. Blasczyk, A. Ganser, I. Prinz, R. Forster, C. Koenecke, CR Schultze-Florey, Reappearance efektorskih T ćelija povezan je s oporavkom od COVID-19, EBioMedicine 57 (2020), 102885.

[12] AE Oja, A. Saris, CA Ghandour, NAM Kragten, BM Hogema, EJ Nossent, LMA Heunks, S. Cuvalay, E. Slot, F. Linty, FH Swaneveld, H. Vrielink, G. Vidarsson, T. Rispens, E. van der Schoot, RAW van Lier, A. Ten Brinke, P. Hombrink, divergentni SARS-CoV-2-specifični T- i B-ćelijski odgovori kod teških, ali ne i blagih COVID-19 pacijenata , EUR. J. Immunol. 50 (2020) 1998–2012.

[13] B. Kratzer, D. Trapin, P. Ettel, U. Kormoczi, A. Rottal, F. Tuppy, M. Feichter, P. Gattinger, K. Borochova, Y. Dorofeeva, I. Tulaeva, M. Weber, K. Grabmeier-Pfistershammer, PA Tauber, M. Gerdov, B. Muhl, T. Perkmann, I. Fae, S. Wenda, H. Fuhrer , R. Henning, R. Valenta, WF Pickl, Imunološki otisak COVID-19 na populaciji leukocita u perifernoj krvi ljudi, Alergija (2020).

[14] AM Bruger, C. Vanhaver, K. Bruderek, G. Amodio, E. Tavukcuoglu, G. Esendagli, S. Gregori, S. Brandau, P. van der Bruggen, Protokol za procjenu supresije proliferacije T-ćelija od strane humanog MDSC, Methods Enzymol. 632 (2020) 155–192.

[15] SA Younes, B. Yassine-Diab, AR Dumont, MR Boulassel, Z. Grossman, JP Routy, RP Sekaly, HIV-1 viremija sprečava stvaranje interleukina 2- koji proizvodi HIV-specifičnememorijaCD4 plus T ćelije obdarene proliferativnim kapacitetom, J. Exp. Med. 198 (2003) 1909–1922.

[16] DM Frucht, T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, JJ O'Shea, S. Koyasu, Proizvodnja IFN-gama ćelijama koje predstavljaju antigen: mehanizmi koji se pojavljuju, Trends Immunol. 22 (2001) 556–560.

[17] EO Gubernatorova, EA Gorshkova, OA Namakanova, RV Zvartsev, J. Hidalgo, MS Drutskaya, AV Tumanov, SA Nedospasov, Neredundantne funkcije IL-6 koje proizvode makrofagi i dendritske ćelije kod alergijske upale dišnih puteva, Front. Immunol. 9 (2018) 2718.

[18] YD Mahnke, TM Brodie, F. Sallusto, M. Roederer, E. Lugli, Ko je tko diferencijacije T-ćelija: ljudimemorijaPodskupovi T-ćelija, Eur. J. Immunol. 43 (2013) 2797–2809.

[19] JM Dan, J. Mateus, Y. Kato, KM Hastie, ED Yu, CE Faliti, A. Grifoni, SI Ramirez, S. Haupt, A. Frazier, C. Nakao, V. Rayaprolu, SA Rawlings, B Peters, F. Krammer, V. Simon, EO Saphire, DM Smith, D. Weiskopf, A. Sette, S. Crotty, Imunološkimemorijana SARS-CoV-2 procijenjen do 8 mjeseci nakon infekcije, Science 371 (2021).

[20] LB Rodda, J. Netland, L. Shehata, KB Pruner, PA Morawski, CD Thouvenel, KK Takehara, J. Eggenberger, EA Hemann, HR Waterman, ML Fahning, Y. Chen, M. Hale, J. Rathe, C. Stokes, S. Wrenn, B. Fiala, L. Carter, JA Hamerman, NP King, M. Gale, Jr., DJ Campbell, DJ Rawlings, M. Pepper, Functional SARS-CoV{ {2}}specifična imunostmemorijaperzistira nakon blage bolesti COVID-19, Cell, 184 (2021) 169-183 e117.