Ekspresija renalnog vitamina D i gena povezanih s fosfatoninom u ovčjem modelu osteoporoze
Jul 29, 2022
Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija
sažetak:Osteoporoza je značajan javnozdravstveni problem u cijelom svijetu, a postmenopauzalna osteoporoza zbog nedostatka estrogena rezultira u otprilike 3/4 slučajeva. U ovoj studiji, 18 starih Merino ovaca je podvrgnuto ovariektomiji, a 10 je bilo kontrola. Tri ovace sa ovariektomijom tretirane su sedmično sa 400 mg metilprednizolona tokom 5 mjeseci, a tri su tretirane sedmično tokom 2 mjeseca, nakon čega je uslijedio 3-mjesečni period oporavka. Nakon 2 mjeseca, eutanazirano je pet kontrolnih životinja i šest ovarijektomiranih životinja. Nakon 5 mjeseci, sve preostale ovce su eutanazirane. Uzorci bubrega prikupljeni su postmortem za qPCR analizu NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA i Ovce sa ovarijektomijom imale su značajno veću ekspresiju VDR u poređenju sa drugim grupama. Ovarijektomirane ovce liječene glukokortikoidima tokom 2 mjeseca, nakon čega je uslijedila eutanazija nakon 5 mjeseci, pokazale su značajne razlike u ekspresiji TRPV5, CYP24A1 i klotho gena u poređenju sa drugim grupama. Razlike u kloto ekspresiji bile su najizraženije nakon prilagođavanja za ponovljene mjere (p=0.1). Klotho je poznat kao hormon protiv starenja i uključen je u metabolizam kalcijuma i fosfora. Klotho može biti uključen u oporavak mineralne gustine kostiju kod ovaca sa ovariektomijom liječenih glukokortikoidima tokom 2 mjeseca nakon čega slijedi eutanazija nakon 5 mjeseci. Preporučuje se dalja istraživanja o ulozi klotha.
Molimo kliknite ovdje da saznate više
Ključne riječi:osteoporoza; ovce; vitamin D; fosfatiranje; qPCR; metabolizam kalcija; metabolizam fosfora; klotho
1. Uvod
Osteoporoza je glavni problem javnog zdravlja za sve starije svjetsko stanovništvo, koštajući Sjedinjene Američke Države skoro 17 milijardi USD u 205. godini, a predviđa se da će porasti na 25 milijardi USD u 2025. [1,2]. Otprilike 70-75 posto tereta osteoporoze je posljedica postmenopauzalne osteoporoze kod žena [1], primarne osteoporoze pri čemu nedostatak estrogena rezultira smanjenim formiranjem kostiju i povećanom resorpcijom kosti, što dovodi do smanjenja koštane mase i krhkosti kostiju [3] . Osteoporoza se također može pojaviti kao posljedica specifičnih uzroka, kao što je liječenje glukokortikoidima. Ovca je dobro uspostavljen veliki životinjski model za različite bolesti skeleta ljudi, uključujući osteoporozu[4]. Jedna od prednosti modela velikih životinja, kao što je ovca, je mogućnost testiranja ortopedskih implantata, hirurških tehnika i biomaterijala [4] Osim toga, ovca je relativno niska cijena, laka za rukovanje i pruža obilje materijala za testiranje [4,5].
Najčešći modeli osteoporoze kod ovaca su 12-mjesečna postoperativno ovariektomirana ovca i 6-mjesečna ovarijektomirana ovca na prehrani s nedostatkom kalcija i vitamina D uz primjenu glukokortikoida[4]. Koristeći kombinaciju poznatih faktora koji izazivaju osteoporozu, uključujući ovariektomiju, liječenje glukokortikoidima i ishranu s niskim sadržajem kalcija, uspjeli smo uspostaviti model osteoporoze ovaca za samo 5 mjeseci [6,7], čime smo smanjili smještaj, rad, i troškovi hrane uključeni u razvoj modela. U ovom modelu je utvrđeno da ovariektomija povećava serumske koncentracije C-terminalnih telopeptida kolagena tipa I (CTX-I, marker resorpcije kosti) i osteokalcina (marker koštanog obrta) u poređenju sa kontrolnim ovcama. Ovce koje su primale glukokortikoidnu terapiju tokom 2 mjeseca imale su veće koncentracije CTX-I u serumu i niže koncentracije osteokalcina u serumu. Dodatno, gustina kostiju femoralne i lumbalne kralježnice i ukupna i trabekularna volumetrijska mineralna gustina kostiju proksimalne tibije bile su niže u eksperimentalno tretiranim grupama u poređenju sa kontrolnim grupama, posebno kod ovaca tretiranih glukokortikoidima sa ovariektomijom [6]. Utvrđeno je da je metabolizam aminokiselina i lipida također promijenjen kod ovaca s ovariektomijom i glukokortikoidima [7].cistanche wirkungSlične promjene su nađene i na drugim modelima osteoporoze ovaca [8].
Cistanche može protiv starenja
Geni koji reaguju na vitamin D i sistem fosfatiranja nisu ranije istraživani na modelima ovaca sa ovariektomijom. Vitamin D, od kojih je 1,25-dihidroksivitamin D aktivni oblik, u konačnici dovodi do povećane koncentracije joniziranog kalcija i fosfora u plazmi vezivanjem na heterodimer receptora vitamina D(VDR)-retinoid X receptora i mijenjanjem ekspresije brojnih vitamina Geni koji reaguju na D, kao što su proteini koji vežu kalcij (calbindin D9 i 28k (CalD9k, CalD28k)) i kalcijumski kanali (prijelazni receptor potencijalnog katjonskog kanala potfamilije V, član 5 i 6 (TRPV5, TRPV6), plazma membranska kalcijeva ATPaza (PMCA) , natrijum-kalcijum izmenjivač 1(NCX1)[9]. Proizvodnja 1,25-dihidroksivitamina D je strogo regulisan korak, pri čemu bubrežna lo hidroksilaza (CYP27B1) katalizira konverziju 25-hidroksivitamina D do 1,25-dihidroksivitamin D, a enzim 24-hidroksilaza (CYP24A1) razgrađuje i 25-hidroksivitamin D i 1,25-dihidroksi vitamin D u neaktivne nusproizvode.cistanche UKSistem fosfatiranja takođe kontroliše koncentracije fosfora i kalcijuma u plazmi[10]. Glavna osovina u ovom sistemu je faktor rasta fibroblasta 23, koji proizvode osteociti u kostima i prvenstveno kontroliše koncentraciju fosfora u plazmi vezivanjem za kofaktor kloto kako bi se smanjila ekspresija ko-transportera natrijum-fosfata (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. Zbog međusobno povezanih efekata paratiroidnog hormona i 1,25-dihidroksi vitamina D, određivanje efekata FGF23 na metabolizam kalcijuma bilo je izazovno, ali postoje dokazi koji ukazuju na to da može regulisati crijevnu apsorpciju kalcija i bubrežne funkcije reapsorpcija kalcijuma[12,13].
Glukokortikoidi imaju brojne efekte na metabolizam kalcija i fosfora, uključujući inhibiciju crijevne apsorpcije kalcija, smanjenu tubulnu reapsorpciju kalcija u bubrežnim kanalima i smanjenu reapsorpciju fosfora u bubrezima [14-16]. Pored toga, malo istraživanja je ispitivalo efekat nedostatka estrogena na gene koji reaguju na vitamin D i sistem za fosfatiranje [17,18].
Ovaj model osteoporoze kod ovaca sa ovariektomijom, ishrana sa niskim sadržajem kalcijuma, tretiran glukokortikoidima, pružio je priliku da se proizvedu preliminarne informacije o efektima ovih tretmana na ekspresiju gena za fosfatiranje i vitamin D u bubrezima ovaca. Ciljevi ove studije bili su dvostruki: (1) utvrditi da li su ovariektomija ili ovarijektomija i liječenje glukokortikoidima promijenili ekspresiju vitamina D i gena povezanih s fosfatiranjem u bubrezima; (2) utvrditi odnose između bubrega vitamina D i gena povezanih s fosfatiranjem, serumski vitamin D i serumski markeri koštanog prometa (CTX-I i osteokalcin).
2. Materijali i metode
Detaljne metode za razvoj modela osteoporoze kod ovaca s ovariektomijom i glukokortikoidima tretirane su ranije objavljene [6]. Ukratko, stare Merino ovce (7-9 godina, n=28) su nasumično raspoređene u grupe: kontrolna(n=10) ovariektomizirana (OVX) (n=12), ovarijektomirana i liječenje glukokortikoidima (40 mg metilprednizolona subkutanom injekcijom) mjesečno tokom 2 mjeseca nakon čega slijedi bez liječenja 3 mjeseca (n=3) i liječenje glukokortikoidima (400 mg metilprednizolona) mjesečno tokom 5 mjeseci (n=3) .bioflavonoidi citrusaOvce su bile smeštene u štali i hranjene ili kontrolnom (115 g/kg kalcijuma; 2,2 g/ovca dnevno) ili niskom kalcijumom (5 g/kg kalcijuma; 1 g/ovca dnevno) koncentratom ovčijeg peleta [19]. Zahtjevi za održavanje ovce koja nije gravidna su 1,2 g po ovci dnevno[19].
Uzorci krvi su uzeti punkcijom jugularne vene 2 mjeseca i 5 mjeseci nakon operacije. Osteokalcin je mjeren korištenjem kompleta za imunoanalizu Micro Vue Osteocalcin, a CTX-I korištenjem IDS Serum CrossLaps ELISA kita, kao što je prethodno objavljeno [6]Ukupne koncentracije kalcija i fosfora u serumu mjerene su spektrofotometrijom na AU680 Clinical Chemistry, Breckman Chemistry, Co. , Kalifornija, SAD). Koncentracija 25-hidroksivitamina D u serumu je mjerena korištenjem tečnog hromatograma za razrjeđivanje izotopa; rafijske masene spektrometrije u Endolab, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, Novi Zeland.
Mjesecima, 5 ovaca iz kontrolne grupe i 6 iz OVX grupe su eutanazirane i obducirane. Nakon 5 mjeseci, preostale ovce su također eutanazirane (kontrolna grupa n =5, OVX grupa n=6, OVX plus 2m glukokortikoida n=3 i OVX plus 5m glukokortikoida n=5 ) i obdukcija. Uzorci bubrega su sakupljeni u roku od 30 minuta od smrti i podijeljeni na dva, s tim da je jedan uzorak stavljen u 10 posto neutralnog puferiranog formalina i obrađen za histologiju, a drugi je zamrznut u tekućem dušiku i pohranjen na -80 stepenu do obrade hematoksilina i Primarni autor je pregledao rezove bubrega obojene eozinom i potvrdio odsustvo značajnih lezija.
Sve eksperimentalne procedure odobrene su od strane Komiteta za etiku životinja Univerziteta Massey (broj odobrenja 14/103) i izvedene su u skladu s Kodeksom etičkog ponašanja za korištenje živih životinja za istraživanja na Univerzitetu Massey, Palmerston North, Novi Zeland.
Ekstrakcija RNK i qPCR izvedeni su kao što je prethodno opisano [20,21]. Ukratko, Tri reagens (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) je korišten za ekstrakciju RNK prema uputama proizvođača. Genomska DNK je uklonjena sa Ambion Turbo DNK bez (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD) prema uputama proizvođača. Koncentracija RNK je određena pomoću Qubit 2.0 fluorometra i Qubit RNA širokog spektra testa (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD), a kvalitet RNK je procijenjen određivanjem omjera 260/280 i radom na agaroznom gelu. Komplet za sintezu cDNK prvog lanca Transcriptor (Roche) korišten je za sintezu cDNK. Svaka reakciona mješavina od 20 μL sadržavala je 600 ng RNK, 2,5 μM oligo (dT), 8 mM RT reakcijski pufer, 1 mM dNTP, 10U reverznu transkriptazu, 20 U inhibitor Rnaze i vodu bez Rnaze-Dnaze. Reakcija je izvedena na 55 stepeni tokom 30 minuta, 85 stepeni tokom 5 minuta, a zatim ohlađena na 4 stepena korišćenjem Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD). qPCR u realnom vremenu je izveden pomoću StepOne Plus PCR mašine u realnom vremenu (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Svaka PCR mješavina je sadržavala 5 uL Power SYBR Green PCR master mješavine (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD), naprijed i nazad prajmere u koncentracijama navedenim u Tabeli S1,10 ng cDNK, a zatim napravljene do 10 μL sa RNazom, vodom bez DNaze. PCR protokol se sastojao od 95 stepeni tokom 20 s, 40 ciklusa na 95 stepeni za i 60 stepeni za i, konačno, krivulja topljenja u rasponu od 60 stepeni do 95 stepeni sa brzinom zagrevanja od 0,3 stepena/15 s. Voda i reakcijska mješavina bez reverzne transkriptaze uključene su kao negativne kontrole u svaki PCR test, a svi uzorci su rađeni u duplikatu. Procijenjeni su sljedeći geni: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA i NCX1. Ranije je utvrđeno da su PKG1 i SDHA stabilno eksprimirani u bubrezima ovaca [20], a uzorci su normalizirani u odnosu na ekspresiju ovih gena i efikasnost gena korištenjem 2-AACt metode [22].
Statistička analiza je izvršena korištenjem R Studio 1.3.1093[23] sa R verzijom
4.0.3 i tidyverse, nlme 3.1-150 i Gary
2.1.2 paketi. Linearni modeli su primijenjeni na log10 transformirane podatke o ekspresiji gena. U prvom modelu, ekspresija gena je bila varijabla ishoda, dok su grupa (kontrola ili OVX, ali isključujući ovce tretirane glukokortikoidima) i vrijeme (eutanazirane na 2 m ili 5 m) bile zavisne varijable, s uključenim terminom interakcije (grupa: vrijeme). U drugom modelu, ekspresija gena je bila varijabla ishoda, dok je grupa (kontrola, OVX, OVX sa tretmanom glukokortikoidima u trajanju od 2 m, i OVX sa tretmanom glukokortikoidima tokom 5 m) bila zavisna varijabla.cynomorium prednostiKako su višestruke varijable ishoda (geni) bile testirane na razlike između grupa, p-vrijednosti su prilagođene za višestruko testiranje korištenjem sekvencijalne Holmove procedure [24]. Koncentracije kalcijuma, fosfora i 25-hidroksivitamina D u serumu testirane su na modelima ekspresije gena, ali nisu bile značajne i, s obzirom na nedostatak značajnih razlika između grupa, uklonjene su. Dodatno, analiza glavnih komponenti je korištena za procjenu da li se podaci o ekspresiji log10 transformisanog gena razlikuju prema grupi, vremenu eutanazije ili koncentraciji 25-hidroksivitamina D u serumu. Spearmanova parna korelacija i dijagrami raspršenja korišteni su za proučavanje korelacije između podataka o ekspresiji log10 transformisanog genskog nabora i serumskih analita.
3. Rezultati
3.1.Utjecaj ovarijektomije, vrijeme od ovarijektomije i glukokortikoidnog tretmana na koncentracije kalcija, fosfora i 25-hidroksivitamina D u serumu
Potpuni rezultati za koncentracije kalcija, fosfora i 25-hidroksivitamina D u serumu u svakoj grupi prikazani su na slici 1." Nije bilo značajnih razlika u koncentracijama kalcija, fosfora i 25-hidroksivitamina D u serumu između Ovariektomizirana i dijetalna grupa sa niskim sadržajem kalcija i grupa bez ovariektomije s adekvatnom ishranom kalcija, i vrijeme od ovariektomije od 2 mjeseca i 5 mjeseci. Ovi rezultati sugeriraju da ovariektomija u kombinaciji s ishranom sa niskim sadržajem kalcija nije imala utjecaja na koncentraciju kalcija u serumu. Ovce koje su ovariektomizirane za i liječeni glukokortikoidima mjesecima, nakon čega je uslijedila eutanazija nakon 5 mjeseci, imali su značajno niže koncentracije kalcija u serumu (p =0.0462, adj R20.13) u poređenju sa 5 m ovariektomiranih na dijeti sa niskim sadržajem kalcija i 5 m ovariektomiranih na ishrana sa niskim sadržajem kalcijuma i ovce tretirane glukokortikoidima. Međutim, ispitivanje podataka ukazuje da je to možda posledica jedne životinje koja je bila hipokalcemična (1,52 mmol/L, referentni opseg 2.{17}},7 mmol/L); uklanjanje; of ova životinja je uklonila svaki značaj.pustinjski zumbulSve ostale ovce imale su koncentraciju kalcija u serumu unutar referentnog raspona. Nisu uočene razlike u koncentraciji fosfora u serumu ili 25-hidroksivitamina D kod ovaca sa 5 m jajnika i glukokortikoidima.
3.2.Utjecaj ovarijektomije i vrijeme nakon ovarijektomije na ekspresiju gena povezanu s vitaminom D i fosfatoninom u bubrezima
Ekspresija gena vitamina D i gena vezanih za fosfatiranje nije bila povezana s ovariektomijom ili vremenom od ovariektomije (Slika 2). Izuzetak je bio receptor vitamina D (VDR), pri čemu je OVX grupa imala značajno veću ekspresiju VDR (p=0.05, adj R2 0.16); međutim, ovaj značaj je nestao nakon prilagođavanja za ponovljene mjere.
3.3. Utjecaj ovarijektomije i liječenja glukokortikoidima na ekspresiju gena povezanu s vitaminom D i fosfatoninom u bubrezima 5 mjeseci nakon operacije
Potpuni rezultati su prikazani na slici 3. Ekspresija PTH1R je bila značajno veća kod ovaca OVX liječenih glukokortikoidima tokom 5 mjeseci u poređenju sa ostalim grupama (p=0.04, adj R40.18), dok je TRPV5 (p{ {8}}.01, adj R20.31) i CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) ekspresija je bila značajno veća kod ovaca OVX liječenih glukokortikoidima tokom 2 mjeseca u poređenju sa drugim grupama.
Ekspresija klothoa se značajno razlikovala između svih grupa (p =0.01, adj R20.48), a najmanja je ekspresija kod kontrolnih ovaca. OVX ovce koje su liječene glukokortikoidima 2 mjeseca imale su najveću ekspresiju (p =0.002), zatim OVX ovce (p=0.008), a zatim OVX ovce tretirane glukokortikoidima 5 mjeseci (p{ {10}}.03). Međutim, kada se prilagodi ponovljenim mjerama, ekspresija gena nije se značajno razlikovala između ovih grupa, pri čemu je klotho pokazao najveću razliku kod ovaca OVX tretiranih glukokortikoidima tokom 5 mjeseci (p=0.1).
Slično, ekspresija VDR-a se značajno razlikovala između svih grupa (p=0.03, adj R20.38). Najveća ekspresija VDR bila je kod OVX ovaca koje su mjesecima liječene glukokortikoidima (p=0.009), zatim OVX ovaca (p=0.01), zatim OVX ovaca tretiranih glukokortikoidima 5 mjeseci (p=0.05), a najmanja ekspresija bila je prisutna kod kontrolnih ovaca.
3.4.PCA ukupne genske ekspresije između grupa
PCA analiza OVX-a, kontrole i eutanazije nakon 2 i 5 mjeseci nije uspjela razdvojiti različite grupe (Slika S1). PCL i PC2 objasnili su 69,6 posto varijacije. Slično, PCA analiza grupa eutanaziranih nakon 5 mjeseci također nije uspjela izdvojiti različite grupe. PCL i PC2 objasnili su 53,2 posto varijacije (Slika S2). PCA analiza je pokazala da se ukupna ekspresija gena ne može objasniti koncentracijama kalcija i fosfora u serumu 25-hidroksivitamina D (Slika S3).
3.5. Parna korelacija između svih analita i ekspresije gena
Bez obzira na status ovariektomije, sadržaj kalcija u ishrani, vrijeme od ovariektomije (2m ili 5m) ili status liječenja glukokortikoidima, ekspresija NPT1 gena je bila značajno i pozitivno povezana (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">
4. Diskusija
Rezultati ove studije sugeriraju da je tretman glukokortikoidima kod ovaca sa ovariektomijom imao najveći utjecaj na ekspresiju gena, dok su sama ovariektomija i vrijeme od ovariektomije (2 i 5 mjeseci) imali mali utjecaj na ekspresiju gena. U univarijantnoj analizi, uočene su značajne razlike u ekspresiji gena TRPV5, CYP24A1 i kloto kod ovaca sa ovariektomijom liječenih glukokortikoidima 2 mjeseca, nakon čega je uslijedila eutanazija nakon 5 mjeseci, te u PTH1R kod ovaca sa ovariektomijom liječenih glukokortikoidima 5 mjeseci. Razlike su bile najizraženije u kloto ekspresiji nakon prilagođavanja za ponovljene mjere.
Kvantitativna periferna kompjuterska tomografija proksimalne tibije ovih ovaca pokazala je da je ovarijektomija smanjila ukupnu volumetrijsku mineralnu gustinu kostiju (vBMD) za 8 posto, ovarijektomija uz terapiju glukokortikoidima 5 mjeseci za 27 posto, a ovarijektomija glukokortikoidima u trajanju od 2 mjeseca i više od 2 mjeseca za 13 posto [6]. Zanimljivo je da su trabekularni BMD, trabekularna površina i mineralni sadržaj trabekularne kosti bili slični ili veći od kontrola kod ovaca s ovariektomijom liječenih glukokortikoidima 2 mjeseca i eutanaziranih nakon 5 mjeseci, što ukazuje na oporavak koštane mase [6]. Glukokortikoidi imaju nekoliko dobro dokumentiranih učinaka na kosti koji dovode do razvoja glukokortikoidno inducirane osteoporoze. Ovi efekti uključuju inhibiciju formiranja matičnih ćelija osteoblasta i osteoblasta, povećanje apoptoze osteoblasta i smanjenje proizvodnje osteoida, što sve smanjuje formiranje kosti [25,26]. U isto vrijeme, glukokortikoidi povećavaju resorpciju kosti smanjenjem ekspresije OPG-a, povećanjem ekspresije RANKL, povećanjem formiranja osteoklasta, smanjenjem apoptoze osteoklasta i povećanjem lučenja katepsina i matriksnih metaloproteinaza od strane osteoklasta [25,26].
Klotho je sastavna komponenta fosfatnog sistema, pri čemu se vezuje za faktor rasta fibroblasta 23 (FGF23) u bubregu. Kloto-FGF23 kompleks se zatim vezuje za FGFR1IIC receptor, koji pokreće nekoliko ćelijskih puteva i, na kraju, rezultira povećanjem ekspresije bubrežne 24-hidroksilaze(CYP24A1) i smanjenjem renalne la-hidroksilaze (CYP27B1) Na/P II kotransporteri (NPT2a i 2c) [10]. Povećana ekspresija (razlike u kojima su bile najizraženije nakon prilagođavanja za ponovljene mjere) klotho kod ovaca na glukokortikoidima tokom 2 mjeseca, a zatim eutanazirana nakon 5 mjeseci može objasniti povećanu ekspresiju CYP241 također uočenu u ovoj grupi ovaca, uprkos tome što nema značajnih razlika u koncentracije 25OHD u serumu.
Klotho je poznat kao protein protiv starenja, a miševi s nedostatkom klotho imaju nisku formaciju kostiju i resorpciju kostiju, što dovodi do osteopenije niskog koštanog obrta [27,28]. Dodatno, specifični polimorfizmi kloto gena povezani su sa smanjenom mineralnom gustoćom kostiju kod ljudi [29,30]. Rastvorljivi kloto pojačava regulaciju ranog odgovora na rast proteina 1 (EGR-1) i indukuje ekspresiju markera diferencijacije kostiju u kulturi ćelija osteoblasta [31] Dodatno, glukokortikoidi mogu potisnuti faktor rasta fibroblasta 232. Možda je veća ekspresija kloto kod ovaca na glukokortikoidima tokom 2 mjeseca, a zatim eutanazirana nakon 5 mjeseci, odraz procesa oporavka ove ovce nakon tretmana glukokortikoidima i, s obzirom na njegovu ulogu u formiranju i resorpciji kostiju, moguće je da je ključni pokretač oporavka kostiju. i stoga potencijalno cilj liječenja osteoporoze kod ljudi.
Međutim, OVX ovce su također imale povećane kloto ekspresije u poređenju sa kontrolnim ovcama. Slično, jedna studija na miševima sa nedostatkom aromataze pokazala je da nedostatak estrogena povećava nivoe klotho proteina, a liječenje estradiolom smanjuje ekspresiju klotho kod ovih miševa[17]. Kod miševa, estrogen smanjuje NPT2a u procesu koji je nezavisan od klotho/FGF23 i PTH[18]. Međutim, ovaj efekat nije uočen kod ovaca sa ovariektomijom u ovoj studiji. Inače, malo je literature o uticaju nedostatka estrogena na kloto. Dalja istraživanja bi trebala ispitati efekte ovariektomije i glukokortikoida na ekspresiju klotoa, s obzirom na njegovu ulogu u starenju i kroničnoj bolesti bubrega.
TRPV5 je epitelni kalcijumski kanal koji je uglavnom izražen u distalnim zavijenim tubulima i povezujućim tubulima bubrega [20,33]. TRPV5 kanal je konstitutivno otvoren, ali podliježe inaktivaciji ovisnoj o kalciju u vezi s kalmodulinom, proteinom koji osjetljiv na kalcij [34]. Ekspresija TRPV5 može biti povećana PTH i 1,25(OH)D3 [35]. Jedna ovca koja je bila na glukokortikoidima 2 mjeseca, a zatim eutanazirana nakon 5 mjeseci bila je hipokalcemična, a koncentracije kalcija u serumu bile su značajno niže kod ovaca u ovoj grupi u odnosu na druge grupe. Stoga je vjerovatno da je povećana ekspresija TRPV5 rezultat smanjene koncentracije kalcija u serumu kod ovih životinja. Pokazalo se da glukokortikoidi smanjuju intestinalnu apsorpciju kalcija smanjujući ekspresiju TRPV6 i CalD9k [36,37] i povećavajući izlučivanje kalcija u urinu [14], ali klinički značajna hipokalcemija kod zdravih osoba nije uobičajena. Slično, ovce sa niskom koncentracijom kalcija u serumu nisu pokazivale kliničke znakove hipokalcemijske tetanije. Alternativno, povećana ekspresija TRPV5 kod ovaca na glukokortikoidima tokom 2 mjeseca, a zatim eutanazirana nakon 5 mjeseci može odražavati proces oporavka, pri čemu je potrebna povećana resorpcija kalcija iz bubrega za zamjenu oporavljene trabekularne BMD, površine i mineralnog sadržaja kostiju.
Kod ovaca liječenih glukokortikoidima tokom 5 mjeseci, ekspresija PTH1R je povećana u poređenju sa drugim grupama. Dodatno, u poređenju sa drugim grupama, bilo je malih varijacija u ekspresiji između ovaca u grupi. Iako nisu uočene razlike u koncentraciji kalcija u serumu kod ovaca liječenih glukokortikoidima tokom 5 mjeseci, možda bi to moglo biti povezano s pojačanim djelovanjem PTH i njegovih receptora. Učinci glukokortikoida na lučenje i djelovanje PTH nisu jasni. Neke studije na ljudima otkrile su da pacijenti liječeni glukokortikoidima imaju povećane koncentracije PTH u serumu, zajedno sa smanjenom apsorpcijom kalcija, povećanim izlučivanjem kalcija u urinu i smanjenom koštanom masom [38,39]. Međutim, većina studija nije pronašla promjene u koncentraciji PTH u serumu kod ljudi na terapiji glukokortikoidima [38,40,41]. Jedna studija je pokazala da je možda utjecaj glukokortikoida na promjenu sekrecije PTH, uz povećano pulsirajuće lučenje PTH kod osoba koje su liječene glukokortikoidima[4]. Drugi su takođe pokazali povećanu ekspresiju PTH1R u mezenhimalnim matičnim ćelijama i ćelijama sličnim osteoblastima kao odgovor na tretman deksametazonom[43,44]. Kao takvo, povećanje renalne ekspresije PTH1R kod ovaca liječenih glukokortikoidima tokom 5 mjeseci vjerovatno je posljedica 5 mjeseci liječenja glukokortikoidima.
Dok je ovariektomija u kombinaciji s ishranom s blago niskim sadržajem kalcija rezultirala minimalnim promjenama u ekspresiji gena, čini se da je promijenila ekspresiju VDR-a, pri čemu su ovce koje su bile podvrgnute ovariektomiji na ishrani s blago niskim sadržajem kalcija imale veću ekspresiju VDR u odnosu na kontrolne ovce. Ovo je u suprotnosti sa studijom na štakorima sa ovariektomijom u kojoj su oni koji su hranjeni hranom sa normalnim nivoima kalcija pokazali povećanu ekspresiju VDR bubrega, dok su oni hranjeni dijetom sa niskim sadržajem kalcija imali smanjenu ekspresiju VDR [45]. Teško je u ovoj studiji sa ovacama odvojiti efekat ovariektomije na bubrežnu ekspresiju VDR-a od efekta ishrane sa niskim sadržajem kalcijuma. Međutim, nije bilo značajnih razlika u koncentraciji kalcija u serumu između grupa (sa izuzetkom glukokortikoidne grupe) što sugerira da je dijeta s blagim niskim sadržajem kalcija imala minimalan učinak i možda su efekti na VDR posljedica ovariektomije. Međutim, biće potrebna dalja istraživanja kako bi se istražili ovi odnosi.
Dvije prethodne studije ispitivale su odvojene odnose između gena koji reagiraju na vitamin D i gena povezanih s fosfatiranjem u bubrezima ovaca [20,21]. Međutim, veze između vitamina D i puteva fosfatiranja nisu ispitane. Zanimljivo je da najznačajnije korelacije između gena objavljene u ova dva rada vrijede i za odnose gena u ovoj studiji o ovcama, što ukazuje na konzistentnost rezultata između studija i odnosa između ovih gena.ekstrakt cistanche salsaOd zanimljivih veza koje nisu ranije objavljene, kao što bi se moglo očekivati s obzirom na njegovu ključnu ulogu u metabolizmu kalcija, ekspresija PTH1R je u visokoj korelaciji sa CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho i NPT2c. Ekspresija klotho-a bila je u snažnoj korelaciji sa ekspresijom gena TRPV5, što je u skladu sa drugom literaturom koja pokazuje da klotho pojačava regulaciju TRPV5 i promoviše bubrežnu reapsorpciju kalcijuma [46,47].
Nažalost, različite grupe se nisu mogle razdvojiti na osnovu ekspresije gena koji reaguje na vitamin D i gena za fosfatiranje pomoću PCA analize. Ovo je vjerovatno zbog glavnog ograničenja ove studije - male veličine uzorka. Sa samo 3-6 životinja u svakoj od grupa, ovo je vjerovatno ograničilo mogućnost otkrivanja razlika u ekspresiji gena između grupa.
5. Zaključci
Rezultati ove studije pokazuju da su najizraženije razlike u ekspresiji gena bile u renalnoj kloto ekspresiji kod ovaca koje su liječene glukokortikoidima 2 mjeseca nakon čega je uslijedio period oporavka od 5 mjeseci. S obzirom na to da je klotho hormon "protiv starenja" i ima ključnu ulogu u metabolizmu kalcija i fosfata, moguće je da je ovaj hormon kritično uključen u oporavak mineralne gustine trabekularne kosti i površine u tretiranim ovcama i stoga može biti potencijalno cilj liječenja osteoporoze kod ljudi. Međutim, potrebno je više istraživanja o efektima glukokortikoida i ovariektomije na kloto.
Ovaj članak je preuzet iz Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals
