Ekspresija neuronske sintaze dušikovog oksida i renina u displastičnim bubrezima mladih pasa

SAŽETAK.

Renin ineuronske sintaze dušikovog oksidau bubrezima kontrolišurenin-angiotenzinitubuloglomerularni povratni sistemi. Ova studija je istraživala ekspresiju renina i neuronasintaza dušikovog oksidaudisplastični bubreziod tri mlada psa. Reninimunoreaktivnost, koja se javlja u jukstaglomerularnim i tubularnim stanicama displastičnih bubrega, nije se razlikovala od one u normalnim bubrezima mladih pasa. Ćelije guste makule u normalnim bubrezima pokazale su neuronalnu imunoreaktivnost sintaze dušikovog oksida, ali one u displastičnim bubrezima nisu pokazale očigledne signale. Ovo zapažanje može biti povezano s patološkim mehanizmima zatajenja bubrega kod mladih pasa.

KLJUČNE RIJEČI: hronična bolest bubrega, displastični bubreg, imunohistohemija, neuronske sintaze dušikovog oksida, renin

Zatajenje bubregapovremeno se javlja kod mladih pasa. U takvim slučajevima, histološki pregled često pokazuje displastične lezije bubrega. Međutim, patofiziološki mehanizmi koji se javljaju u displastičnim bubrezima pasa ostaju nejasni. Nedavno smo demonstrirali slabljenje ciklooksigenaze (COX)-2 kod kroničnih bolesti bubrega kod mladih pasa s displastičnim bubrezima pomoću imunohistohemijske analize [19].

Cistanche Supplement SupportDodatak za funkciju bubrega

COX-2 je inducibilni inflamatorni enzim koji je neophodan za normalan razvoj bubrega u fetalnom i neonatalnom stadiju [12, 15]. Nakon rođenja, COX-2 se konstitutivno eksprimira u bubregu i koncentriše u ograničenom području macula densa (MD) debelih uzlaznih udova [1, 4, 22]. MD je specijalizovana regija uz vaskularni pol glomerula. Kontroliše lučenje renina i sistem tubuloglomerularne povratne sprege (TGF). COX-2 eksprimiran u MD ćelijama reguliše ove mehanizme [6, 8]. Pored COX-2, neuronska sintaza azot oksida (nNOS), koja je takođe eksprimirana u MD ćelijama, poznata je kao glavni regulator TGF sistema [3, 18]. Poznato je da ova dva molekula, koji su ko-eksprimirani u MD, međusobno djeluju [2, 5, 9]. U ovoj studiji smo imunohistohemijski istraživali ekspresiju renina i nNOS u displastičnim bubrezima kako bismo utvrdili da li slabljenje COX-2 u displastičnim bubrezima izaziva poremećaj renin-angiotenzinskog sistema i TGF sistema kod mladih pasa.

Formalinom fiksirani parafinski blokovi displastičnih bubrega mladih pasa (n=3), normalnih bubrega mladih pasa (n=3) i normalnih bubrega odraslih pasa (n=4) su isti kao oni korišteni u našoj prethodnoj studiji, u kojoj je prethodno opisana klinička anamneza i priprema tkiva [19]. Studiju je odobrio Komitet za eksperimentiranje na životinjama Univerziteta Kagoshima, Japan (VM15020). Presjeci su pripremljeni debljine 3-µm, a imunohistohemijska analiza na renin i nNOS urađena je prema sljedećim protokolima: (1) deparafinizacija; (2) uzimanje antigena mikrotalasnim zagrevanjem u 10 mM citratnog pufera (pH 6,0) za nNOS; (3) inkubacija sa 3% H2O2 tokom 30 min; (4) blokiranje sa 3% goveđeg serumskog albumina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) za renin ili 0,25% kazeina (Sigma-Aldrich) za nNOS, razrijeđen u fosfatnom puferu, 30 minuta; (5) inkubacija preko noći na 4 stepena sa 1:3,000 razblaženjem zečjeg antirekombinantnog renin poliklonskog antiseruma (dobavlja Dr. Murakami, Univerzitet Tsukuba, Japan) ili 1:3,{{32 }} razblaživanje zečjeg anti-nNOS poliklonskog antiseruma (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, SAD), u rastvoru za blokiranje; (6) inkubacija 30 minuta na sobnoj temperaturi sa univerzalnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom i polimerom (anti-mišji imunoglobulin (Ig) G i anti-zečji IgG; jednostavna boja MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokio, Japan) ; i (7) detekcija imunosignala korišćenjem 3,3'-diaminobenzidin sistema (3,3'-diaminobenzidin pufer tableta; Merck, Darmstadt, Nemačka). Za sekcije negativne kontrole korišćen je normalan zečji IgG (Lab Vision, Fremont, Kalifornija, SAD) umjesto primarnog antitijela.

Slika 1. Imunohistohemija za renin u displastičnom psećem bubregu. O: Renin-pozitivni signali su uočeni u jukstaglomerularnim ćelijama blizu vaskularnih polova i nekim glomerularnim ćelijama (strelice). Šipka: 50 µm. B: Različiti region preseka je prikazan na panelu A. Tubuli u neidentifikovanom segmentu nefrona pokazuju imunoreaktivnost na renin. Šipka: 50 µm.

Randomizirana morfometrijska analiza imunoreaktivnosti renina obavljena je prema prethodno opisanoj metodi [20]. Ukratko, renin indeks je definiran kao omjer ukupnog broja renin pozitivnih arteriola prema ukupnom broju glomerula i izražen na 100 glomerula. Razlike između grupa su analizirane korišćenjem Bonferronijeve metode višestrukog poređenja sa SPSS verzijom 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, Njujork, SAD).

Histopatološka dijagnoza je urađena prema mikroskopskim kriterijima displazije bubrega kod pasa Picuta i Lewisa [14]. U histološkim sekcijama sva tri slučaja prikazana je asinhrona diferencijacija, što ukazuje na prisustvo lezija sa fetalnim/nezrelim glomerulima. Sekundarne promjene promjenjive težine kao što su oštećenje tubula, intersticijska fibroza i sklerotični glomeruli uočene su unutar zrelog bubrežnog tkiva.

U displastičnim bubrezima, signali reninske imunoreaktivnosti uočeni su u jukstaglomerularnim ćelijama (JGC) (slika 1A), a tubularne ćelije su locirane u distalnim nefronima (slika 1B). U nekim glomerulima, nekoliko ćelija pokazalo je renin-pozitivne signale u blizini vaskularnih polova (slika 1A). U mladim kontrolnim bubrezima, signali renina su također otkriveni u JGC i distalnim tubulima, uključujući MD ćelije. U kontrolnim bubrezima odraslih, renin-pozitivni signali bili su ograničeni na JGC. Statistički, broj renin-pozitivnih područja u displastičnim bubrezima nije pokazao značajne razlike u odnosu na one u mlađim i odraslim bubrezima.

Poznato je da stimulacija proizvodnje renina igra ulogu u signalizaciji COX-2, a prethodne studije su pokazale da su aktivnost i koncentracija renina u plazmi smanjene nakon primjene inhibitora COX-2 ili u nokautu COX-a -2 gen [10, 11]. Kako displastični bubrezi ispitani u ovoj studiji nisu pokazali ekspresiju renalnog COX-2 [19], u početku se sumnjalo na smanjenje imunosignala renina u JGC-ima kao moguću fiziološku abnormalnost u displastičnim bubrezima. Međutim, sadašnja imunohistohemijska analiza nije mogla potvrditi ovu hipotezu i nije predloženo očigledno smanjenje renina u JGC. Iako fiziološka uloga tubularnog renina nije ranije razjašnjena, bubrežno rukovanje natrijem može biti moguća uloga tubularnog renina, budući da je pojačanje ekspresije renina inducirano u distalnom nefronu nakon hranjenja pacova ishranom s malo soli. [16], a displastični bubrezi pasa koji su ispitivani u ovoj studiji mogli su održati ovu tubularnu funkciju.

COX-2 je također važan u regulaciji TGF sistema, koji je važan za održavanje brzine glomerularne filtracije. Studija na pacovima metodom mikropunkture pokazala je supresiju TGF odgovora nakon tretmana COX-2 inhibitorom [2]. TGF odgovor u displastičnim bubrezima može biti oslabljen zbog nedostatka renalne ekspresije COX-2. Međutim, nikakvi relevantni nalazi nisu ranije prijavljeni. U bubrezima, nNOS se eksprimira u MD ćelijama i pomaže u regulaciji TGF sistema [18].

U sadašnjoj nNOS analizi, nisu otkriveni očigledni signali u MD regionima svih slučajeva (slika 2). Ovo smanjenje nNOS se smatralo etiopatogenim događajem u displastičnim bubrezima, a ne stečenim nakon zatajenja bubrega u slučajevima. Naša prethodna studija koja je koristila OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) štakore, kao model dijabetesa tipa 2, pokazala je da je nNOS prekomjerno eksprimiran u MD i oko tubularnih stanica u kasnijoj fazi dijabetičke nefropatije [21]. U regulaciji TGF sistema, funkcija nNOS-a je slična i u interakciji je s onom COX-2. Neke studije sugerišu da je nNOS pozicioniran uzvodno od signalnog puta i stimuliše ekspresiju COX-2 [5, 9]. S druge strane, druge studije su sugerirale suprotno da je COX-2 pozicioniran uzvodno od NOS [2, 13]. Bez obzira na razliku u signalnom putu, nedostatak nNOS-imunosignala u MD ćelijama može izazvati smanjenje regulacije renalne ekspresije COX-2 u displastičnim bubrezima.