Eksperiment 3 Učinak feniletanol glikozida Cistanche Deserticola na model perimenopauze pacova Ⅲ

Eksperiment 3 Učinak feniletanol glikozida Cistanche deserticola na model perimenopauze štakora

1 Eksperimentalni materijali

1.1 Eksperimentalne životinje

Wistar pacovi, SPF stepen, ženke, obezbjeđen od Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., broj certifikata za pacove za ovu seriju: 0017216; laboratorijski certifikat broj SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Eksperimentalni lijekovi

Cistanche deserticola feniletanol glikozidpripremljen je prema metodi Eksperimenta 1, a sadržaj je dostigao 66,47%. Gengnian'an kapsula, sastojci: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, kora božura, Poria cocos, sedef, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polyvineum u multiflora, polygonum multiflorum he. . Funkcije i indikacije:Negujte jin i savladajte jang, osloboditi nevoljei smiri um. Koristi se za valunge i znojenje u menopauzi, vrtoglavicu, tinitus, razdražljivost i nesanicu. Specifikacije: 0.3g po kapsuli. Upotreba i doziranje: Oralno, po 3 kapsule, 3 puta dnevno. Proizvođač: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Broj serije proizvodnje: 121104. Broj odobrenja: National Drug Approval No. Z14021848.

Sojini izoflavoni i vitamin E meke kapsule, lista sastojaka: izoflavoni soje u prahu, vitamin E, suncokretovo ulje, želatin, glicerin, voda, tartrazin, titanijum dioksid. Ikonični sastojci i sadržaj: Svakih 100 g sadrži 55,2 mg sojinih izoflavona (izračunatih kao genistein) i 608,5 mg vitamina E. Zdravstvene funkcije: Povećava gustinu kostiju. Uputstvo i doziranje: Uzimati 1 kapsulu 2 puta dnevno sa toplom vodom. Specifikacije: 500mg×100 kapsula. Proizvođač: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Broj serije proizvodnje: 13070302. Broj odobrenja: National Food Health G20080032.

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi?

1.3 Eksperimentalni reagensi

Carboxymethylcellulose sodium, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., serijski broj: 20120418; penicilin natrijum za injekcije, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikacija: 4 miliona jedinica, proizvodna serija: c1206807;

Rastvor formaldehida (analitički čist), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., proizvodna serija broj: 20130902; 0,9% injekcija natrijum hlorida, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikacija: 250ml, proizvodna serija: 13082405B;

Hloralhidrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, serijski broj 20120827; Pacov E2 ELISA komplet za detekciju, kompanija za istraživanje i razvoj, serijski broj: 20140101A; Rat T ELISA komplet za detekciju, R&D Company, serijski broj: 20140101A; Pacov LH ELISA komplet za detekciju, kompanija za istraživanje i razvoj, broj serije: 20140101A; Komplet za detekciju FSH ELISA za pacove, kompanija za istraživanje i razvoj, broj serije: 20140101A;

2 Eksperimentalne metode

2.1 Modeliranje i administracija lijekova

Metoda modeliranja: Uzmite 100 ženku wistar štakora tjelesne težine 210~230g, nasumično odaberite 12 pacova kao praznu grupu i podvrgnite se lažnoj operaciji, a preostali štakori će se koristiti za stvaranje menopauze modeli. Nakon što su pacovi izvagani, pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 10% hloral hidrata (0,3ml/100g) i fiksiran je abdominalni položaj. Zatim su štakori podrezani ispod zadnjeg rebra na leđima na presjeku srednje aksilarne linije i oko 2 cm od bočne strane kičme, a zatim dezinficirani. Koža i leđni mišići su urezani oko 1 cm, a u vidnom polju reza se vidi mlečno bijela sjajna masna masa u koju je ugrađen jajnik. Malom pincetom lagano uhvatite masnu masu i izvucite je iz reza, odvojite masnu masu i vidjet ćete grupu tankih, nepravilnih, žutocrvenih jajnika. Prilikom rezanja prvo podvezite jajovod (uključujući masnoću) ispod jajnika tankim koncem, potpuno uklonite lijevi jajnik i uklonite 80% desnog jajnika. Nakon operacije, rogovi materice su vraćeni u trbušnu šupljinu, mišići i koža su zašiveni, a oba jajnika su uklonjena na isti način. Nakon operacije, životinje su pažljivo odgajane i intramuskularno im je davano 200,000 u/kg penicilina (0,1ml svaka) kako bi se spriječila infekcija, jednom dnevno tokom 3 uzastopna dana. 5 dana nakon operacije pristupilo se vaginalnom pregledu pacova jedan po jedan, jednom dnevno 5 uzastopnih dana. Pacovi sa estrusnim reakcijama u razmazu su odbačeni. Odabrano je 72 potpuno kastrirana štakora koji su nasumično podijeljeni u 6 grupa. Za eksperimentalne svrhe, to su grupa modela, grupa Gengnianan, grupa sojinih izoflavona i grupa velikih, srednjih i malih doza Cistanche deserticola feniletanol glikozida.

Način pripreme: Način pripreme: {{0}}.5% CMC Način pripreme: Izvagati 4g natrijum karboksimetil celuloze i pomiješati sa destilovanom vodom da dobijete 800ml. Doze velikih, srednjih i malih doza Cistanche deserticola feniletanol glikozida grupe bile su 133,33mg/kg, 66,67mg/kg, odnosno 33,33mg/kg (zapremina primjene 1ml/100g). Način pripreme: Izmeriti 1333,3mg, 666,7mg, odnosno 333,3mg ukupnih flavonoida maline, rastvoriti ih sa malom količinom 0,5% CMC, zatim prilagoditi zapreminu na 100ml, dobro promešati i to je to. Gengniangan kapsule (450 mg/kg, pomešane sa destilovanom vodom do 45 mg/ml, 1ml/100g, što odgovara 10 puta većoj kliničkoj dozi); Način pripreme: Uzmite 15 Gengnianan kapsula, prvo ih otopite u maloj količini od 0,5% CMC-a, zatim podesite volumen na 100 ml i dobro promiješajte, što je doza Gengnianan kapsule suspenzije (450 mg/kg). Meke kapsule sojinog izoflavona vitamina E (166,67mg/kg, koristite destilovanu vodu da napravite 16,67mg/ml, 1ml/100g, što odgovara 10 puta većoj od kliničke doze); Način pripreme: Uzmite 4 meke kapsule vitamina E izoflavona soje, prvo otopite s malom količinom 0,5% CMC, zatim podesite volumen na 120 ml i dobro promiješajte da dobijete dozu suspenzije mekih kapsula vitamina E sojinog izoflavona (16,67 mg/kg ).

Način primjene: Životinjama u svakoj grupi su davani odgovarajući lijekovi 10 dana nakon operacije. Grupa slepih uzoraka i grupa modela su davane istom zapreminom 0,5% rastvora CMC (volumen gavaže je bio 1ml/100g), a Gengnianan grupi je davana suspenzija Gengnianan kapsule (450mg/kg, što je 10 puta veća od kliničke doze). ). ), grupa sa sojinim izoflavonom primala je oralno suspenziju meke kapsule vitamina E sojinog izoflavona (166,67 mg/kg, što odgovara 10 puta većoj od kliničke doze), a velike, srednje i male dozeCistanche deserticola feniletanol glikozidgrupe su oralno davane prema grupi. Velike, srednje i male doze feniletanol glikozida Cistanche deserticola (doze su 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg, odnosno 33,33 mg/kg, zapremina doze je 1 ml/100 g), koje se daju jednom dnevno, kontinuirano intragastrično . lijeka 30 dana.

2.2 Stavke posmatranja i metode detekcije

Horizontalno-vertikalni rezultati kretanja štakora u svakoj grupi mjereni su 29 dana nakon primjene. 2 sata nakon posljednje primjene u želucu (15 sati natašte), izvadite očne jabučice da prikupite krv, odvojite serum iplazmai izmjeriti sadržaj E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP u serumu i sadržaj -EP u plazmi; pacovi su secirani. Uklonite timus, slezenu, matericu i preostalih 20% tkiva jajnika, izmjerite njihovu vlažnu težinu i izračunajte indeks organa timusa, slezene i materice (indeks organa=mokra težina organa mg/težina štakora g) , a zatim izvaditi mozak Za hipotalamus i hipofizu pripremljeni su homogenati tkiva iz hipotalamusa, hipofize i 1/2 materice, te sadržaj estrogenskih receptora u hipotalamusu, hipofizi i homogenati tkiva materice i androgena Određen je sadržaj receptora u homogenatima hipotalamusa. Timus, slezena, materica i jajnik su fiksirani u 10% rastvoru formaldehida, stavljeni u parafin, izrezani i obojeni HE. Thehistomorfološke promjeneu svakoj grupi posmatrani su pod svetlosnim mikroskopom.

2.2.1 Ispitivanje metode otvorenog polja

Eksperimentalni uređaj je kubična otvorena kutija visine 40 cm i dužine i širine 80 cm. Okolni zidovi i dno su crni. Dno se sastoji od 25 blokova jednake površine, podijeljenih bijelim linijama. Tokom eksperimenta, štakor je stavljen u kvadratić u sredini otvorene kutije, a rezultat horizontalne aktivnosti je broj blokova koje je štakor prešao na dnu u roku od 5 minuta (mogu se izbrojati kvadrati sa unesene sve četiri šape), i koliko su puta zadnji udovi stajali uspravno (dvije prednje šape su bile u zraku). (ili držeći se za zid) rezultat vertikalne aktivnosti. Izmet se mora potpuno ukloniti nakon svakog eksperimenta, a svaki štakor se mjeri jednom 2 sata nakon primjene. Ovaj eksperiment je sproveden u tihoj prostoriji.

2.2.2 Metoda određivanja kompleta

Uzmite uzorke seruma: Koristite epruvete koje ne sadrže pirogene i endotoksine. Izbjegavajte bilo kakvu ćelijsku stimulaciju tokom operacije. Nakon prikupljanja krvi, centrifugirajte je na 3000 o/min 10 minuta kako biste brzo i pažljivo odvojili serum i crvena krvna zrnca. Uzmite uzorke plazme: antikoagulantne heparinskim antikoagulansnim epruvetama. Centrifugirajte na 3000 o/min 30 minuta i uzmite supernatant. Uzmite uzorke homogenata tkiva: Dodajte odgovarajuću količinu fiziološke otopine u tkivo i zgnječite. Centrifugirajte na 3000 o/min 10 minuta i uzmite supernatant.

Metoda određivanja ELISA kompleta estradiola (E2) štakora je ista kao u eksperimentu 2. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pmol/L.

Metoda analize testosterona (T) ELISA kompleta za pacov (pacov) ista je kao i metoda ispitivanja ELISA kompleta za estradiol. Koncentracije standarda (S{{0}}S5) su {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 i 320 pg /mL. Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje luteinizirajućeg hormona (LH) štakora (pacova) je ista kao i metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje estradiola. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 3, 6, 12, 24 i 48 ml/ml. Metoda analize ELISA kompleta za folikul stimulirajući hormon (FSH) štakora (pacova) je ista kao i metoda ispitivanja ELISA kompleta za estradiol. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 0,75, 1,5, 3, 6 i 12 IU/L. Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje gonadotropin-oslobađajućeg hormona (GnRH) štakora (pacova) ista je kao i metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje estradiola. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 5, 10, 20, 40 i 80 mlU/ml.

Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje osteokalcina (BGP/OCN) pacova (pacova) ista je kao i metoda određivanja kompleta za otkrivanje ELISA estradiola. Koncentracije standarda (S{{0}}S5) su 0, 0.75, 1.5, 3, 6 i 12 ng/ml. Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje pacova (Rat) -endorfina ( -EP) ista je kao i metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje estradiola. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 3, 6, 12, 24 i 48 pg/mL. Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje estrogenskog receptora (ER) štakora (pacova) je ista kao i metoda određivanja kompleta za otkrivanje ELISA estradiola. Koncentracije standarda (S{{20}}S5) su 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pg/mL. Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje androgenog receptora (AR) pacova (pacova) ista je kao i metoda određivanja kompleta za ELISA detekciju estradiola. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 25, 50, 100, 200 i 400 pg/mL.

2.3 Metode statističke obrade

Za analizu podataka korišten je medicinski statistički paket SPSS17.0 za statističku obradu podataka. Podaci mjerenja izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (-x±s). Za poređenje između grupa korištena je jednosmjerna analiza varijanse. LSD metoda je korištena za testiranje homogenosti varijansi. , Games-Howell test je korišten za neujednačene varijanse, a Ridit test je korišten za podatke o ocjenama.

Iz tabele 11 i slike 14 može se vidjeti da su u poređenju sa slijepom grupom, indeks timusa, indeks slezine i uteralni indeks pacova u modelnoj grupi značajno smanjeni (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Efekti na nivoe biohemijskog indeksa u krvi kod pacova u perimenopauzi

Sadržaj E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP u serumu i sadržaj EP u plazmi pacova u svakoj grupi prikazani su u tabelama 12-13 i slikama 15-17.

Iz tabela 12-13 i slika 15-18 može se vidjeti da su u poređenju sa slijepom grupom, nivoi E2 i T u serumu pacova u grupi modela bili značajno smanjeni (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabela 14. Utjecaj feniletanol glikozida Cistanche deserticola na nivoe GnRH u serumu i -EP u plazmi u perimenopauzalnom modelu štakora (-x±s)

Iz tabele 14 i slika 19-20 može se vidjeti da je u poređenju sa slijepom grupom, nivo GnRH u serumu pacova u modelnoj grupi bio značajno povećan, a nivo -EP u plazmi značajno smanjen (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Efekti na sadržaj ER i AR u tkivima pacova modela perimenopauze

Sadržaj ER i AR u relevantnim tkivima pacova u svakoj grupi prikazan je u tabelama 16-17 i slikama 22-23.

Iz tabele 17 i slike 23 može se vidjeti da je u poređenju sa slijepom grupom, nivo AR u hipotalamusu modelne grupe bio značajno niži (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Efekti na morfologiju tkiva organa kod pacova modela u perimenopauzi

Patološki i histološki rezultati posmatranja materice, timusa i slezene pacova u svakoj eksperimentalnoj grupi su sljedeći. Patološke fotografije su prikazane u Dodatku 1 za patološke fotografije modela pacova u perimenopauzi.

5.1. Utjecaj na morfologiju tkiva materice kod pacova modela perimenopauze

Prema različitom stepenu promjena u endometrijumu, žlijezdama i miometriju štakora u svakoj eksperimentalnoj grupi, korišćeni su polukvantitativni standardi za podjelu patološke morfologije tkiva na četiri nivoa, a materice štakora u svakoj eksperimentalnoj grupi su izmjereno. Rezultati posmatranja prikazani su u tabeli 18.

"-" Epitelne ćelije endometrijuma, žlezde, miometrijum i seroza su normalne; "+" epitelne ćelije i žlezde endometrijuma su atrofirane, a miometrijum i seroza su normalni; "++" epitel endometrijuma Ćelije i žlijezde su djelimično atrofirane, mišićni sloj je blago atrofiran, a seroza je normalna; "+++" epitelne ćelije i žlezde endometrijuma su značajno atrofirane, a seroza je normalna.

Nakon Ridit testa, iz tabele 18 se može vidjeti da je u poređenju sa slijepom grupom, materica pacova u modelnoj grupi pokazala značajne patološke lezije tkiva (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2. Utjecaj na morfologiju tkiva jajnika kod pacova modela perimenopauze

Prema različitim stupnjevima promjena u folikulima, žutom tijelu, ćelijama granuloze i krvnim sudovima u jajnicima pacova u svakoj grupi eksperimenata, korišteni su polukvantitativni standardi za podjelu patološke morfologije tkiva na četiri nivoa. Izmjereni su i promatrani jajnici pacova u svakoj grupi eksperimenata. Rezultati su prikazani u tabeli 19.

Tabela 19. Utjecaj feniletanol glikozida Cistanche deserticola na patološke promjene jajnika kod pacova modela perimenopauze Jedinica: samo

"-" može pokazati rastuće folikule, zrele folikule i žuto tijelo na svim nivoima. Žuto tijelo je dobro razvijeno, sa mnogo slojeva granuloza ćelija, bogatom folikularnom tekućinom i bogatim krvnim sudovima; "+" može pokazati rastuće folikule, zrele folikule i žuto tijelo, ali je broj zrelih folikula i žutog tijela mali. , folikuli su manji, a ćelije granuloze su manje slojevite; "++" može prikazati zrele folikule i žuto tijelo, s više žutog tijela, manje granuloze ćelija i manje krvnih sudova; "+++" nema folikule, više žutog tijela, a jajnik atrofičan, avaskularni.

Nakon Ridit testa, može se vidjeti iz tabele 19 da su u poređenju sa slijepom grupom, jajnici pacova modelne grupe pokazali značajne patološke lezije tkiva (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Učinci na timus i morfologiju tkiva slezene kod pacova modela u perimenopauzi

Pomoću mikrometra izmjerite debljinu najdebljih i najužih dijelova korteksa timusa svakog štakora u svakoj eksperimentalnoj grupi kako biste dobili prosjek; Koristite osnovnu liniju mikrometra da padnete na čvorove slezene, izmjerite debljinu čvorova slezene s obje strane sa centralnom arterijom kao centrom i izračunajte prosek. Izmjereni rezultati prikazani su u tabeli 20 i slici 24.

Iz tabele 20 i slike 24 može se vidjeti da su u poređenju sa slijepom grupom debljina korteksa timusa i volumen čvorova slezene u grupi modela značajno smanjeni (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).