Elastaza i pogoršanje urođenog imuniteta neutrofila su uključeni u multivisceralne manifestacije COVID-a-19

Abstract

Pozadina:

Mnogi argumenti sugeriraju da bi neutrofili mogli igrati istaknutu ulogu u COVID-19. Međutim, uloga ključnih komponenti urođenog imuniteta neutrofila u teškim oblicima COVID-19 nije zaslužila dovoljno pažnje. Cilj nam je bio procijeniti učešće neutrofilne elastaze, histonske DNK i DNaze u sistemskim i višeorganskim manifestacijama COVID-19.

Broj i aktivnost neutrofila su važni pokazatelji koji odražavaju imunološki status organizma. Kada je tijelo stimulirano infekcijom ili upalom, neutrofili će se brzo povećati i ući u oštećeno tkivo ili mjesto upale, oslobađajući dovoljno enzima i proteina za uklanjanje štetnih tvari. Ova sposobnost brzog odgovora čini neutrofile važnim dijelom imunološke odbrane tijela. Istovremeno, neutrofili takođe učestvuju u procesu imunološke regulacije. Oni mogu sarađivati ​​sa drugim imunim ćelijama kako bi regulisali imuni odgovor tela i održavali ravnotežu imunog sistema. U nekim bolesnim stanjima, kao što su autoimune bolesti, alergijske reakcije, itd., abnormalno povećanje ili aktivnost neutrofila će negativno utjecati na imunološki sistem tijela, izazivajući nepotrebne upalne reakcije i oštećenje tkiva. U svakodnevnom životu moramo obratiti pažnju i na svoj imunitet. Cistanche može poboljšati naš imunitet u svakodnevnom životu. Polisaharidi u mesu mogu regulisati imuni odgovor ljudskog imunog sistema i povećati stres imunoloških ćelija. Sposobnost pojačavanja baktericidnog djelovanja imunoloških stanica.

Kliknite na zdravstvene prednosti cistanchea

Metode:

Izvršili smo multicentrično istraživanje markera urođenog imuniteta na neutrofile u 155 slučajeva uzastopno regrutovanih u skrining centru, lokalnim bolnicama i dvije regionalne univerzitetske bolnice. Slučajevi su evaluirani prema kliničkim i biološkim markerima težine i multiorganskih manifestacija i upoređeni sa 35 zdravih kontrola.

Rezultati:

Elastaza neutrofila u krvi, histon-DNK, mijeloperoksidaza-DNK i slobodna dsDNK su dramatično povećani, a aktivnost DNaze je smanjena 10-putu u poređenju sa kontrolama. Neutrofilna elastaza i histon-DNK bili su povezani sa prijemom na intenzivnu njegu, tjelesnom temperaturom, oštećenjem pluća, markerima kardiovaskularnih ishoda, zatajenjem bubrega i povećanim interleukinom-6 (IL-6), IL-8 i CXCR2. Neutrofilna elastaza bila je nezavisni prediktor rezultata kompjuterske tomografije oštećenja pluća COVID-19 i broja zahvaćenih organa, u multivarijantnim analizama. Povećane koncentracije NE i ekstracelularnih zamki neutrofila u krvi bile su povezane s pogoršanjem stimulacije neutrofila kroz povećane koncentracije IL-8 i CXCR2 i povećanjem serumskih DAMP-a, te s poremećenom degradacijom NET-a kao posljedicom dramatičnog smanjenja DNaze u krvi aktivnost.

zaključak:

Naši rezultati ukazuju na ključnu ulogu pogoršanja urođenog imuniteta neutrofila kod bolesti COVID-19. Neutrofilna elastaza i Dnaza mogu biti potencijalni biomarkeri i terapeutske mete za teške sistemske manifestacije COVID-19.

GRAFIČKI SAŽETAK

Nivoi neutrofilne elastaze i histon-DNK u krvi su povezani sa teškim i sistemskim i višeorganskim manifestacijama COVID-19. Povećane koncentracije neutrofilne elastaze i ekstracelularnih zamki neutrofila u krvi povezane su sa pogoršanjem stimulacije neutrofila putem aktiviranog IL-8/CXCR2 puta. Neutrofilna elastaza i Dnaza mogu biti potencijalni biomarkeri i terapeutske mete za teške sistemske manifestacije COVID-19.

1|UVOD

Koronavirusna bolest 2019. (COVID-19) proizvodi tromboembolijske događaje i višeorganske manifestacije, uključujući srce, jetru i bubrege.1,2 One su dijelom rezultat prekomjernog uključivanja urođenog imuniteta3 i citokinske oluje koju proizvode limfociti i aktivacija makrofaga.4–6 Argumenti sugeriraju da neutrofili također igraju istaknutu ulogu u teškim i po život opasnim oblicima bolesti.6–9 Međutim, učešće neutrofila u sistemskim i višeorganskim ishodima COVID-a-19 zaslužio je nedovoljnu pažnju.8

Neutrofili imaju arsenal odbrambenih strategija koje uključuju oslobađanje antimikrobnih granula i neutrofilne elastaze (NE), i formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki (NETs).6,8 NET su histon-DNK komponente umirućih neutrofila uključene u odbranu domaćina od patogeni.6,8 Studija je objavila da su dva markera NET-a, DNK bez ćelija i DNK mijeloperoksidaze (MPO) povećana kod hospitaliziranih pacijenata sa COVID-19 u poređenju sa 30 kontrola i da su u korelaciji sa C-reaktivnim proteinom, D-dimer, laktat dehidrogenaza i apsolutni broj neutrofila.9

Druga studija iz naše grupe pokazala je da je nivo MPO-DNK povećan u ranoj fazi infekcije koronavirusom 2 (SARS-CoV-2), u ambulantnim slučajevima.10 Homeostaza cirkulirajućih NET zavisi od NE i DNase 1 i DNase 11L3.6 Prekomjerni NE i NET u krvi proizvode vaskularne i tkivne lezije kod akutne virusne pneumonije, koje liče na one uočene kod infekcije COVID-19.6,11,12 Uprkos ovim dokazima, da li je NE, DNaze i histon-DNK uključeni su u multi-visceralne manifestacije COVID-19 do danas nisu procijenjene.

Ova studija je prva, koja je proučavala NE, ukupnu aktivnost DNaze i histon-DNK u slučajevima COVID-19 regrutovanih u centrima za skrining, lokalnim bolnicama i regionalnim bolnicama kako bi ih procijenila prema težini bolesti i više organa manifestacije. Otkrili smo da je NE bio nezavisni prediktor višeorganske ozljede uzrokovane COVID-19. Oslobađanje NE i NET je povezano sa aktivacijom neutrofila molekularnim obrascima povezanim sa oštećenjem seruma (DAMP) i putem IL-8/CXCR2.

2|MATERIJALI I METODE

2.1|Regrutacija pacijenata i kliničke karakteristike ispitivane populacije

NICO studiju (Neutrophil innate Immunity in COvid-19) registrovao je Institucionalni odbor za klinička istraživanja (DRCI) Univerzitetske bolnice u Nancyju (br. 2020PI087) i odobrio ju je Etički komitet. Izvršili smo uzastopnu studiju poprečnog presjeka na 155 pozitivnih pacijenata regrutiranih nakon informiranog pristanka u skrining centru, lokalnim bolnicama, te odjelima medicine i intenzivne njege dva univerzitetska bolnička centra u periodu najveće pandemije COVID-19 u Francuska. Pratili smo smjernice EQUATOR i BRISQ za izvještavanje o kliničkim i biološkim podacima i korištenje bioloških uzoraka. Infekcija je okarakterizirana RT-PCR uzorcima nazalnih briseva. 34 uzastopna ambulantna subjekta prisustvovala su skrining centru u prvoj sedmici bolesti, kao što je prethodno opisano.10 Regrutovali smo dodatnih 121 pacijenta hospitaliziranog zbog COVID-19 u medicinskim odjelima lokalnih bolnica regije Tours (n { {11}}) i Regionalne univerzitetske bolnice u Marseilleu i Nancyju (n=78).

Među njima, 13 je liječeno na jedinicama intenzivne nege. Medijan kašnjenja između pojave simptoma i uzorkovanja krvi bio je 7 dana (IQR: 4–13) na medicinskim odjelima i 13 dana (IQR: 4–14) u jedinicama intenzivne njege. Izvijestili smo o kliničkim karakteristikama i ishodima hospitaliziranih pacijenata koji su navedeni u Tabeli S1. Bodovanje oštećenja pluća procijenjeno je kompjuterskom tomografijom u 5 stupnjeva (CT skor), kako je opisano.13 Kontrolna grupa je uključivala zdrave subjekte, bez prijavljenog kontakta sa zaraženim slučajevima i negativan na COVID{10}} skrining.

2.2|Uzimanje krvi i biološka procjena

Serumi su korišteni nakon završetka biohemijskog testiranja koje je naručio kliničar. Preostali uzorci su pohranjeni u istim uslovima među grupama, na -20 stepeni u 24 h nakon uzimanja krvi. Rutinski biohemijski markeri su analizirani u analizatorima Cobas 8000 (Roche Diagnostics, Švajcarska) i Atellica (Eschborn, Nemačka).

2.3|Mjerenje elastaze, MPO-DNK, DNKhiston kompleksa, dsDNA i citokina u serumu

Cirkulirajući nivoi kompleksa histon-DNK mjereni su u serumu pomoću ELISA kompleta za otkrivanje smrti ćelije (Roche Diagnostics, Sigma-Aldrich, SAD), kao što je prethodno opisano.14 Vrijednosti su prijavljene u jedinicama apsorpcije od 450 nm. DNK-MPO kompleksi su mjereni zamjenom antihistonskog antitijela sa zečjim poliklonskim antitijelom protiv mijeloperoksidaze (Merck, Darmstadt, Njemačka). Koncentracija NE određena je korištenjem Neutrophil Elastase Human ELISA Kit (Invitrogen, Carlsbad, SAD). Vrijednosti su navedene u ng/ml. dsDNK bez ćelija je kvantifikovan korišćenjem Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit, nakon oduzimanja pozadine (Invitrogen). IL-6, IL-8 i CXCR2 su analizirani ELISA kompletima iz Reagentbio Ireland Ltd, Dublin, Irska, IL-1 od Invitrogena, HMGB1 od strane Novus Biologicals (Centennial, SAD) i TNF- by ELISA Kit iz R&D Systems Inc. (Minneapolis, SAD).

2.4|Ukupna aktivnost deoksiribonukleaze (DNase) u serumu testom jednostruke radijalne difuzije enzima (SRED)

Aktivnost DNaze je kvantificirana na agaroznom gelu koji sadrži 0.13 mg. mL-1 DNK iz sperme lososa u puferu koji sadrži 100 mM MES pH 6,5, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 i SYBR bezbednu DNK gel boju (Invitrogen, Life Technology) kako je opisano.15,16 Dva mikrolitra seruma su locirana u bunari. Gelovi su inkubirani 24 h na 37 stepeni u vlažnoj komori. Fluorescencija DNK-SYBR snimljena je fluorescentnim skenerom.

2.5|Kvantifikacija NET-ova vezanih za ćelije u neutrofilima inkubiranim sa serumom pacijenta

Da bi se utvrdilo da li serum COVID-19 pacijenata utiče na NET-ove vezane za ćelije, krv jednog zdravog donora je pomiješana (1:1 vol/vol) sa serumom pacijenta prije tretmana PMA i inkubirana 6 h, kako je opisano.14 Liza crvenih krvnih zrnaca postignuta je dodavanjem 1 ml FACS Lyse reagensa (BD Biosciences; razrjeđenje 1:10) tokom 5 minuta. Zatim je dodat goveđi serumski albumin (BSA, 1 ml na 2 procenta) u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) i smeša je centrifugirana na 1000 g 10 minuta. Pelet resuspendovan u PBS analiziran je pomoću Gallios protočnog citometra (Beckman Coulter, Villepinte, Francuska). Strategija gajtinga se uzastopno fokusirala na (i) CD66-pozitivne ćelije i zatim (ii) H3Cit-pozitivne i MPO-pozitivne ćelije.

2.6|Test za in vitro NET DNK oslobađanje neutrofila serumom pacijenta

Izolovani neutrofili su resuspendovani u RPMI 1640, a 1 × 105 ćelija je zasijano u 96-ploče za kulturu tkiva, kao što je opisano.14 Ploče su inkubirane na 37 stepeni da bi se omogućilo ćelijama da prianjaju. Nakon stimulacije sa 100 µl 0,1 ng/ml PMA tokom 4 h, jažice su inkubirane sa 1 U/ml MNaze ili DNaze 1 (oboje iz Worthingtona) 10 minuta ili 10 µl seruma pacijenta ili kontrolnog seruma 6 h, a zatim 2 mM EDTA je dodat da zaustavi aktivnost nukleaze. Sadržaj DNK oslobođen u supernatantu je kvantificiran pomoću Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Invitrogen). Količina oslobođene DNK smatrana je 100 posto u nestimulisanim neutrofilima zdravih donora.

2.7|Statističke analize

Sve kvantitativne varijable su prikazane kao medijan i interkvartilni raspon (IQR, 25–75. percentil), a kvalitativne varijable kao procenti i 95-postotni interval povjerenja (95 posto CI). Neparametarski testovi su korišteni kada distribucija podataka nije bila normalna. Univarijantne analize su izvršene korištenjem hi-kvadrat testa ili Fisherovog egzaktnog testa za kategoričke varijable i Mann-Whitney U i Kruskal-Wallis testova i Spearmanove rang korelacije za kontinuirane varijable. Post hoc poređenje u paru između podgrupa izvršeno je pomoću Conoverovog testa. Nakon toga smo izvršili analizu operativnih karakteristika prijemnika (ROC) kako bismo potražili optimalne pragove povezane s ishodima bolesti.17 Nakon toga smo izvršili analizu operativnih karakteristika prijemnika (ROC) kako bismo potražili optimalni prag povezan s ishodima bolesti, prema DeLongu et al.17 Klasifikaciona varijabla korištena u ROC analizi bio je proučavani ishod bolesti.

For each ROC analysis, we reported the area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) and the associated p-value. The exact binomial method was applied to estimate the 95% confidence intervals (CIs) of the AUROC. The optimal diagnostic cutoff was defined using the Youden index J. Bias-corrected and accelerated (BCa) bootstrap interval after 10,000 iterations for the Youden index and its associated values was performed.18 Clinical and biological criteria were used to define organ injuries (see the Methods section in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Bias-corrected and accelerated (BCa) bootstrap interval after 10,000 iterations for the Youden index and its associated values were performed.18 In step #2, using multivariable logistic regression analysis, we assessed whether the ROC-defined threshold defined for elastase (>593 ng/L) bio je povezan sa "brojem zahvaćenih organa većim ili jednakim 2" nakon uračunavanja potencijalnih zbunjujućih faktora. Procijenili smo diskriminaciju modela koristeći ROC analizu (AUROC i 95 posto CI) i kalibraciju modela koristeći Hosmer i Lemeshow test dobrog uklapanja i Nagelkerke R2 statistiku.19

In step #3, we assessed the association between elastase level (>ili Manje ili jednako 593 ng/L) i demografiju pacijenata, istoriju bolesti i ishode bolesti. Veličina uzorka od 7 pacijenata po grupi bila je potrebna da se otkrije povećanje veće od ili jednako 200 posto i 38 pacijenata da se otkrije povećanje veće od ili jednako 100 posto srednje elastaze između grupa , sa 1- na 80 posto i na 0,05. Statističke analize su obavljene korišćenjem MedCalc, verzija 19.1 (MedCalc Software, Ostende, Belgija) i Stata SE, verzija 12.1 (College Station, Teksas, SAD), na osnovu dvostrane greške tipa I sa alfa nivoom od 0,05.

3|REZULTATI

3.1|NE, MPO-DNK i histon-DNK su dramatično povećani, a aktivnost DNaze je dramatično smanjena u COVID-19 ambulanti i hospitalizaciji

pacijenata

34 ambulantna slučaja imala su srednju starost (plus /-SD) od 42 plus /-17 godine i omjer spolova (M/Ž) od 0.88. Svi su imali najmanje dva simptoma, uključujući groznicu, suhi kašalj i dispneju manje od jedne sedmice. Nijedna nije imala teški oblik u ovoj fazi bolesti. Kliničke karakteristike 122 hospitalizirana slučaja prikazane su u Tabeli S1, njihovi biološki markeri, uključujući IL-6, IL-8, CXCR2, TNF- , IL-1 i HMGB1, navedeni su u tabeli S2, a karakteristike 35 zdravih kontrola prikazane su u tabeli S3. Nivoi NE, MPO-DNK, histon-DNK i dsDNK u krvi ambulantnih i hospitaliziranih pacijenata sa COVID-19 prikazani su u Tabeli S4. Oni su bili dramatično veći od onih prijavljenih kod kontrolnih subjekata. Nasuprot tome, globalna aktivnost Dnaze bila je 10-putostruko niža u slučajevima COVID-19 (Slika 1A, B).

Koncentracije NE i NET komponenti u serumu nisu bile povezane sa dobi i polom među grupama, a serumska koncentracija 1 antitripsina (AAT), glavnog krvnog inhibitora NE, bila je normalna (Tabela S2). Koncentracija NE bila je značajno veća u hospitaliziranim u odnosu na ambulantne slučajeve i pacijentima liječenim na intenzivnoj njezi u odnosu na lokalne bolnice i medicinske odjele univerzitetskih bolnica (Slika 1A). NE je raspoređen u dva klastera visoke i niže koncentracije u ambulantnim slučajevima i pacijentima hospitalizovanim na medicinskim odeljenjima regionalnih univerzitetskih bolnica. Klasteri s najvećim koncentracijama imali su slične vrijednosti kao i oni prijavljeni u jedinicama intenzivne njege (Slika 1A). Kao što je uočeno za komponente NE i NET, koncentracija dsDNK bila je viša kod pacijenata primljenih na jedinice intenzivne njege (Slika 1B). Osim toga, serumske koncentracije NE i NET komponenti bile su povezane s brojem zahvaćenih organa (Slika 1C).

3.2|NE, histon-DNK i ukupna aktivnost Dnaze povezani su sa ozbiljnošću i multi-visceralnim manifestacijama COVID-a-19

Proučavali smo povezanost između elastaze, DNK konjugirane mijeloperoksidazom, kompleksa histon-DNK i kliničkih i bioloških karakteristika pacijenata (Tablica 1). Izvijestili smo o značajnim korelacijama NE sa histon-DNK, MPO-DNK, biomarkerima težine bolesti, SaO2 na prijemu u bolnicu, leukocitima, neutrofilima, omjerom neutrofila i limfocita, LDH, markerima kardiovaskularnog i trombotičkog rizika, uključujući Troponin-T ( cTnT), fibrinogen i D-dimer, te markeri zatajenja bubrega, uključujući ureu i kreatinin (Tabela 1 i Slika 2). Također smo primijetili značajnu povezanost NE sa IL-6, IL-8 i CXCR2, ali ne i sa TNF, IL-1 i HMBG1 (Slika 3). Prijavljena je značajna povezanost histonske DNK s rezultatom kompjuterizirane tomografije (CT rezultat) oštećenja pluća,13 markera kardiovaskularnog i trombotičkog rizika13 (Tabela 1) uključujući cTnT i fibrinogen, markere zatajenja bubrega, uključujući ureu i kreatinin, i markeri upale, uključujući C-reaktivni protein, feritin i tjelesnu temperaturu (slika S1). Za razliku od toga, MPO-DNK je bila povezana samo sa leukocitima (p=0.005) i neutrofilima (p=0.004), i sa slabijim značajem, sa D-dimerom (p=0 .045) i fibrinogen (p=0.047). Ukupna aktivnost DNaze bila je povezana sa alkalnom fosfatazom (PAL) i ukupnim bilirubinom, dok je dsDNA bila povezana samo sa feritinom (Tabela 1).

SLIKA 1 Neutrofilna elastaza (NE), mijeloperoksidaza-DNK (MPO-DNA), histon-DNK i (B) dsDNK bez ćelija i ukupna aktivnost Dnaze u serumu 155 COVID-19-pozitivnih slučajeva. Simptomatski ambulantni slučajevi (n=34) su regrutovani u centrima za skrining i hospitalizirani pacijenti (n=122) ​​u lokalnim bolnicama (n=43) i medicinskim odjelima (n=65) i jedinice intenzivne njege (n=13) dvije regionalne univerzitetske bolnice. P-vrijednosti koncentracija NE između grupa bile su sljedeće: zdrav u odnosu na ambulantno<0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.7870; ambulatory versus medical department 0.0028; ambulatory versus intensive care <0.0001; proximity hospital versus medical department 0.0003; proximity hospital versus intensive care <0.0001; and medical department versus intensive care 0.0239. The p-values of MPO concentrations between groups were healthy versus ambulatory <0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.1237; ambulatory versus medical department 0.8589; ambulatory versus intensive care 0.1276; proximity hospital versus medical department 0.1463; proximity hospital versus intensive care 0.5811; and medical department versus intensive care 0.1482. 

P-vrijednosti histon_DNK vrijednosti između grupa bile su zdrave u odnosu na ambulantne<0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.0013; ambulatory versus medical department 0.0525; ambulatory versus intensive care <0.0001; proximity hospital versus medical department 0.2740; proximity hospital versus intensive care 0.0.0033; and medical department versus intensive care 0.0003. The thresholds (dotted lines) were evaluated in healthy controls recruited several months before the epidemy. 

Prag NE je procijenjen na 73 ng/ml, a MPO-DNK na 0.562 AU (450 nm apsorbančne jedinice), histon-DNK na 0.591 AJ, ukupna aktivnost DNaze na 9,94 U/ml, a dsDNK u serumu na 95,60 ng/ml (C) NE, MPO-DNK i histon-DNK prema broju organa zahvaćenih COVID-19. Podaci iz (A), (B) i (C) upoređeni su Mann-Whitney testom. Isprekidane linije predstavljaju granične vrijednosti definirane srednjom vrijednosti plus 2 standardne devijacije za NE, MPO-DNK, histon-DNK i DNK bez ćelija, a srednja vrijednost—2 standardne devijacije za aktivnost DNaze.

3.3|Dijagnostička tačnost NE, MPO-DNK, histon-DNK, dsDNA, aktivnosti Dnaze i srodnih citokina za otkrivanje ishoda bolesti u analizama operativnih karakteristika prijemnika (ROC)

Izvršili smo ROC analize kako bismo procijenili dijagnostičku tačnost NE, MPO-DNK i histon-DNK za predviđanje ishoda povezanih sa bolešću (Tabela S5 i Forest dijagram na slici 4). NE je imao značajne pragove za prijem u jedinice intenzivne nege, pojavu respiratorne insuficijencije, zasićenje krvi kiseonikom<85%, and the presence of at least two affected organs (Figure 4). The latter was best predicted with a cutoff at 593 ng/ml of NE. Histone-DNA had significant thresholds for admission into intensive care units, kidney injury, and blood oxygen saturation <85%. MPO-DNA had significant thresholds for heart decompensation, kidney injury, respiratory failure, and blood oxygen saturation <85%. The ROC analyses identified also very significant cutoffs for IL-6, IL-8, and CXCR2 for admission into intensive care units, heart decompensation, kidney injury, and respiratory failure. In contrast, we did not observe these associations with IL-1β and TNF-α.

3.4  |  Associations between NE >593 ng/ml i karakteristike i ishodi pacijenata

In univariate analyses, NE >593 ng/ml was significantly associated with CT score, blood oxygen saturation, respiratory failure, presence of at least two affected organs, and admission into the intensive care unit (Table S6). We retained chronic kidney disease, diabetes, and hypertension as potential confounders in multivariable analyses (Table S7). In the multivariable models that were used to account for the collinearity issue, NE >593 ng/ml je nezavisno povezano sa CT rezultatom i prisustvom najmanje dva zahvaćena organa (Tabela S8). Optimalni multivarijabilni model imao je površinu ispod operativnih karakteristika prijemnika (AUROC) od 0.876 (95 posto CI, 0.758–0.950) i postotak slučajeva ispravno klasifikovano od 85 posto. Izvršili smo analizu konkordancije između graničnih vrijednosti NE i citokina u predviđanju najmanje dva zahvaćena organa. Izvijestili smo o 70,4 posto i 72,7 posto podudarnosti NE sa CXCR2 i IL-6, respektivno (Slika 3).

3.5|Serumi pacijenata smanjuju zadržavanje NET i povećavaju oslobađanje dsDNA u izolovanim kontrolnim neutrofilima

Proučavali smo ćelijske NET-ove kontrolnih neutrofila inkubiranih sa serumima pacijenata koristeći protočnu citometriju. Uočili smo smanjeno zadržavanje NET-ova vezanih za ćelije, što je odražavalo povećano oslobađanje, iz ćelija inkubiranih sa serumom pacijenta u odnosu na kontrolni serum (Slika 5A). Dalje smo proučavali oslobađanje dsDNK iz kontrolnih neutrofila proizvedenih serumom pacijenata. Primijetili smo povećano oslobađanje dsDNK iz neutrofila inkubiranih sa serumom pacijenta u odnosu na kontrolni serum (Slika 5B). Inhibicija NE i drugih serumskih serinskih proteaza sa 10 μM aprotinina imala je slab inhibicijski učinak na oslobađanje dsDNA (slika 5C). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da su serumi pacijenata povećali oslobađanje komponenti NET-a, s ograničenom ulogom NE.

4|DISKUSIJA

Our study showed that NE, global DNase activity, and components of NETs are involved in the early and later steps of COVID-19. NE and histone-DNA were associated with clinical manifestations and biomarkers related to pulmonary damage, cardiovascular manifestations, renal insufficiency, and inflammation. Elastase >593 ng/ml je bio nezavisni prediktor višeorganske povrede u multivarijantnoj analizi.

Dramatično povećanje nivoa NE i NET u krvi u ambulantnim slučajevima pokazuje njihovu uključenost u rani odgovor domaćina na SARS-CoV-2, kao što je ranije uočeno za druge virusne pneumonije.4,6,11,20 Povećanje NE i NET se još uvijek primjećuje u kasnijoj fazi infekcije, što se vidi u hospitaliziranim slučajevima, posebno onima koji su primljeni u jedinicu intenzivne njege dvije sedmice nakon pojave simptoma. Alveolarne epitelne ćelije iz pluća inficiranih virusom gripe stimulišu NETozu.21 Međutim, postoji debata o štetnim i zaštitnim efektima NET u akutnom respiratornom distres sindromu (ARDS).22,23 Citrulinirani H3 i DNK bez ćelija odražavaju proizvodnja ekstracelularnih zamki od strane neutrofila, granulocita i monocita.23,24 Dramatično povećanje koncentracije NE u krvi odražava preciznije aktivaciju neutrofila.24,25 Treba napomenuti da koncentracija NE korelira bolje s alveolarnom upalom nego brojem neutrofila, u akutnom respiratorni distres sindrom.25,26.

NE, ali ne histon-DNK i MPO-DNK, bio je nezavisni prediktor oštećenja više organa kod pacijenata sa COVID-19. Ovaj rezultat odražava istaknutu ulogu NE u oslobađanju NET komponenti i mehanizama urođenog imuniteta neutrofila.24 NE se distribuira u tkivima i krvi degranulacijom ili oslobađanjem s NET.24,27–29 Indukcija ROS virusnom infekcijom aktivira MPO , koji zatim aktivira oslobađanje NE.29,30 Veoma značajna korelacija između NE i histon-DNK i MPO-DNK ilustruje ulogu NE u formiranju NET. Nakon stimulacije neutrofila, NE se translocira u jezgro, gdje učestvuje u degradaciji histona prije nego što se oslobodi s DNK/hromatinskim materijalom NETs.6,30 Važno je da NE povezan s NET ostaje aktivan i izbjegava endogenu anti-proteaznu aktivnost AAT. 31 NE može izazvati oštećenje tkiva u plućima, srcu, jetri, žilama i bubrezima i ispoljava protrombotičke efekte kod virusne infekcije.6,26,31–37

Degradacija komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM) od strane NE proizvodi iste povrede pluća i krvnih žila kao one uočene na obdukcijskim uzorcima pacijenata sa COVID-19.34–39 Povezanost NE i histon-DNK sa SaO2 pri prijemu u bolnicu i CT rezultat oštećenja pluća od COVID-18 je u skladu s njihovim efektima na druge virusne infekcije pluća.6,12,40 Njihova povezanost s troponinom-T, D-dimerom i fibrinogenom sugerira njihovu ulogu u protrombotičkim efektima prijavljenim u COVID-19.39–41 Povreda miokarda tokom COVID-19 nije jasno shvaćena.42–44 Mehanizmi uključuju direktnu virusnu infekciju, trombozu, mikrovaskularne i ozljede miokarda povezane sa smanjenom isporukom kisika i oslobađanjem citokini.34,43,45 Povećani cTnT povezan sa NE može biti sekundarno posledica koronarne tromboze i infarkta miokarda i/ili miokarditisa.34,43,44 NE i NET takođe mogu doprineti povezanosti srčanih povreda kroz sistemske efekte u bubrezima. i drugi organi.2,45,46 Povezanost NE i histon-DNK sa ureom i kreatininom sugerira njihovu uključenost u akutnu ozljedu bubrega prijavljeno kod oko 30 posto pacijenata sa COVID-19.33,47-49 .

Naša studija doprinosi boljem razumijevanju patoloških mehanizama COVID-19 ukazujući na ključnu ulogu poremećaja urođenog imuniteta neutrofila tokom i nakon replikacije virusa, kao što je sažeto u grafičkom sažetku. IL-6, IL-8 i TNF- računaju za citokine koji su pretežno povezani sa ozbiljnošću COVID-19.50 Potvrdili smo ovu povezanost za IL-6 i IL{{7} }. Povećane koncentracije IL-1 bile su u pozitivnoj korelaciji sa ozbiljnošću bolesti u nekoliko studija.51 Međutim, nismo pronašli nikakvu povezanost IL-1 s ishodima težine COVID-19, kao što je ranije objavljeno u nedavna meta-analiza.52 Ovi rezultati su u skladu sa nedavnom velikom studijom, u kojoj je IL-1 bio loše otkriven i, kao rezultat toga, imao je samo marginalnu prediktivnu vrijednost ozbiljnosti bolesti.50 IL{{17 }} i IL-8 nastaju nakon aktivacije NF-κB inficiranih alveolarnih makrofaga putem mehanizama koji vjerovatno uključuju Bruton tirozin kinazu (BTK).53 Ovo je ilustrovano obećavajućim kliničkim efektima koje proizvodi BTK inhibitor acalabrutinib kod pacijenata sa teški COVID-19.53 IL-8 djeluje kao hemokin koji aktivira neutrofile kroz vezivanje za CXCR2, koji je glavni kemokinski receptor neutrofila.15 Stoga, dramatično povećanje NE kod teškog COVID{{27 }} može biti povezan sa aktivacijom neutrofila putem IL-8/CXCR2 puteva.16 LDH, feritin i D-dimer su u velikoj korelaciji sa NE i mogu odražavati aktivaciju makrofaga COVID-19.49, 54

Suprotno tome, NE i NET bi također mogli igrati ulogu u aktivaciji makrofaga i procesiranju proinflamatornih citokina.3,6,36–38 Izvijestili smo o dramatičnom smanjenju globalne aktivnosti DNaze u serumu, koja bi mogla sudjelovati u NETozi kroz smanjenu degradaciju cirkulirajući fragmenti DNK hromatina (grafički sažetak).55–58 Važno je napomenuti da mišji model Dnase1–/– Dnase1 l3–/– izložen patogenima proizvodi lezije pluća slične onima uočenim kod pacijenata sa respiratornim distresom i/ili sepsom i autopsijama COVID-19 pacijenata.40,59 U skladu s tim, nedavna studija je izvijestila o smanjenoj aktivnosti DNaze I kod bakterijske i virusne pneumonije kod djece.60.

Serumi pacijenata sa COVID-19 smanjili su zadržavanje ćelija NET i povećali oslobađanje dsDNK neutrofila od zdravih donora. Slični rezultati su prethodno dobijeni sa COVID-19 serumom koristeći ćelijsku boju SYTOX Green za kvantifikaciju NET-a.9 Ovi rezultati pokazuju da NEToza može biti izazvana endogenim stimulansima koje u krv oslobađaju ozlijeđena tkiva kao što su DAMP, uključujući slobodnu dsDNK .61 Čini se da HMGB1 nije uključen u povećanu NETozu, jer njegova koncentracija nije povećana u slučajevima COVID-19, kao što je ranije objavljeno.62

Naša studija otvara terapijske perspektive. Prekomjerna NE aktivnost prijavljena u našoj studiji sugerira procjenu upotrebe moćnih NE inhibitora nove generacije, uključujući lonodelestat (POL6014), alvelestat, CHF6333 i elafin u COVID-19.8,27 Dramatično smanjenje DNaze prijavljeno u naša studija takođe predlaže procenu upotrebe rekombinantne deoksiribonukleaze I (dornaze alfa) i/ili DNaze 1L3.63–65 Jedan od očekivanih efekata je oslobađanje NE iz degradiranih NET, sa povećanim slobodnim NE u krvi i naknadno poboljšanom efikasnošću NE inhibitora. 30 Iz tog razloga, smatramo da bi u liječenju COVID-19 trebalo razmotriti povezanost inhibitora DNaze i NE inhibitora. Druga terapijska opcija koju treba razmotriti mogla bi biti upotreba inhibitora CXCR2 za blokiranje regrutacije i aktivacije neutrofila. Oštećenje NE i/ili oslobađanje NET-a u ranoj fazi COVID-19 moglo bi proizvesti prednosti, ali i rizike vezane za smanjenje urođenog imuniteta domaćina. Nasuprot tome, pretpostavljamo da bi ova strategija mogla smanjiti sistemske manifestacije COVID-19 u fazi nakon replikacije bolesti.

Naša studija je pretrpjela ograničenja. Nismo mogli sistematski prijaviti sve biomarkere kod svih pacijenata. Regrutacija i evaluacija poprečnog presjeka nisu nam omogućili da proučavamo kinetiku NE i NET praćenjem pacijenata. Međutim, uspjeli smo uporediti koncentraciju NE i NET kod ambulantnih simptomatskih pacijenata koji su regrutirani tokom prve sedmice COVID-19 i pacijenata hospitaliziranih tokom druge do četvrte sedmice bolesti. Multicentrično zapošljavanje u lokalnim bolnicama i regionalnim univerzitetskim bolnicama bila je snaga naše studije za procjenu slučajeva s kontrastnom ozbiljnošću bolesti. Iscrpno bilježenje kliničkih podataka omogućilo nam je da izvršimo multivarijantnu analizu povezanosti NE i NET sa ozbiljnošću i višeorganskim oštećenjem COVID-19, nakon prisilnog prilagođavanja anamnezi.

Zaključno, naša studija ukazuje na dramatično povećanje NE, aktivnosti DNaze i NET-a tokom prve faze COVID-19 i njihovu ključnu ulogu u ozbiljnosti sindroma akutnog respiratornog distresa i kardiovaskularnog, bubrežnog i inflamatornog sistema manifestacije u kasnijoj fazi bolesti. Oni predlažu procjenu NE, DNase 1 i NET kao potencijalnih terapijskih ciljeva.

ZAHVALNICE

Studiju NICO registrovao je Institucionalni odbor za klinička istraživanja (DRCI) Univerzitetske bolnice u Nancyju (br. 2020PI087) i odobrio ju je Etički komitet Univerzitetske bolnice u Nancyju. Autori nisu imali sukob interesa za izjavu.

SUKOB INTERESA

Nijedan od autora nije imao nikakve finansijske odnose sa sobom i svojom užom porodicom/značajnim drugima.

DOPRINOSI AUTORA

JL Guéant je imao pun pristup svim podacima, nadgledao je studiju i preuzima odgovornost za integritet i tačnost analize podataka. JL Guéant i V Regnault su osmislili i dizajnirali studiju. JL Guéant, V Regnault, RM Guéant-Rodriguez, A Oussalah i P Lacolley su prikupili podatke, analizirali ih ili interpretirali podatke. JL Guéant je bio uključen u glavnu izradu rukopisa. V Regnault, RM Guéant-Rodriguez i A Oussalah su bili uključeni u djelomičnu izradu određenih dijelova. Svi autori su kritički revidirali rukopis. RM Guéant-Rodriguez, Julien Fromonot i A Oussalah su uključeni u upravljanje bazom podataka. RM Guéant-Rodriguez i A Oussalah su bili uključeni u statističke analize.

REFERENCE

1. Zhou P, Yang XL, Wang XG, et al. Epidemija upale pluća povezana s novim koronavirusom vjerovatnog porijekla slepih miševa. Priroda. 2020;579:270-273.

2. Grasselli G, Zangrillo A, Zanella A, et al. Polazne karakteristike i ishodi 1591 pacijenta zaraženog SARS-CoV-2 primljenim na odjele intenzivnog liječenja u regiji Lombardija, Italija. JAMA. 2020;323(16):1574.

3. Azkur AK, Akdis M, Azkur D, et al. Imunološki odgovor na SARS-CoV-2 i mehanizmi imunopatoloških promjena kod COVID-19. Alergija. 2020;75:1564-1581.

4. McGonagle D, Sharif K, O'Regan A, Bridgewood C. Uloga citokina uključujući interleukin-6 u COVID-19-indukovanoj pneumoniji i bolesti nalik sindromu aktivacije makrofaga. Autoimmun Rev. 2020;19:102537.

5. Mo P, Xing Y, Xiao YU, et al. Kliničke karakteristike refraktorne COVID-19 pneumonije u Wuhanu, Kina. Clin Infect Dis. 2020: ciaa270. [Epub ispred štampanja]. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa270

6. Papayannopoulos V. Neutrofilne ekstracelularne zamke u imunitetu i bolesti. Nat Rev Immunol. 2018;18:134-147.

7. Lagunas-Rangel FA. Omjer neutrofila i limfocita i omjer limfocita i C-reaktivnog proteina kod pacijenata s teškom bolešću od korona virusa 2019. (COVID-19): meta-analiza. J Med Virol. 2020;92(10):1733-1734.

8. Barnes BJ, Adrover JM, Baxter-Stoltzfus A, et al. Ciljanje potencijalnih pokretača COVID-19: ekstracelularne zamke neutrofila. J Exp Med. 2020;217:e20200652.

9. Zuo Y, Yalavarthi S, Shi H, et al. Neutrofilne ekstracelularne zamke u COVID-19. JCI. Insight. 2020;5:e138999.

10. Gueant JL, Fromonot J, Gueant-Rodriguez RM, Lacolley P, Guieu R, Regnault V. Blood Myeloperoxidase-DNA, biomarker ranog odgovora na infekciju SARS-CoV-2? Alergija. 2020. [Epub ispred štampe]. https://doi.org/10.1111/all.14533

11. Cortjens B, de Boer OJ, de Jong R, et al. Neutrofilne ekstracelularne zamke uzrokuju opstrukciju disajnih puteva tokom bolesti respiratornog sincicijalnog virusa. J Pathol. 2016;238:401-411. 12. Twaddell SH, Baines KJ, Grainge C, Gibson PG. Nova uloga ekstracelularnih zamki neutrofila u respiratornim bolestima. Prsa. 2019;156:774-782.

13. Li K, Fang Y, Li W, et al. Vizuelna kvantitativna procjena CT slike i klinička klasifikacija bolesti korona virusa (COVID-19). Eur Radiol. 2020;30:4407-4416.

14. Popović B, Zannad F, Louis H, et al. Povećanje proizvodnje trombina u plazmi uzrokovano endotelom karakterizira novi hiperkoagulabilni fenotip kod akutnog zatajenja srca. Int J Cardiol. 2019;274:195-201.

15. Uddin M, Watz H, Malmgren A, Pedersen F. NETopatska inflamacija u hroničnoj opstruktivnoj plućnoj bolesti i teškoj astmi. Front Immunol. 2019;10:47.

16. Didangelos A. COVID-19 hiperinflamacija: šta je s neutrofilima? mSphere. 2020;5:e00367-e00420.

17. DeLong ER, DeLong DM, Clarke-Pearson DL. Poređenje područja ispod dvije ili više koreliranih krivulja radnih karakteristika prijemnika: neparametarski pristup. Biometrija. 1988;44:837-845. 18. Efron B, Tibhirani RJ. Uvod u bootstrap. CRC press 1994.

19. Nagelkerke NJD. Napomena o opštoj definiciji koeficijenta determinacije. Biometrija. 1991;78:691-692.

20. Funchal GA, Jaeger N, Czepielewski RS, et al. Fuzioni protein respiratornog sincicijalnog virusa potiče formiranje ekstracelularnih zamki neutrofila zavisnih od TLR-4- od strane ljudskih neutrofila. PLoS One. 2015;10:e0124082.

21. Pillai PS, Molony RD, Martinod K, et al. Mx1 otkriva urođene puteve do antivirusne rezistencije i smrtonosne bolesti gripe. Nauka. 2016;352:463-466.

22. Bendib I, de Chaisemartin L, Mekontso Dessap A, Chollet-Martin S, de Prost N. Razumijevanje uloge ekstracelularnih zamki neutrofila kod pacijenata sa teškom pneumonijom i ARDS-om. Prsa. 2019;156:1278-1280.

23. Granger V, Faille D, Marani V, et al. Monociti ljudske krvi mogu formirati ekstracelularne zamke. J Leukoc Biol 2017;102:775-781.

24. Kettritz R. Neutralne serinske proteaze neutrofila. Immunol Rev. 2016;273:232-248.

25. Lengas A, Poletti V, Pacifico L, di Domizio C, Patelli M, Spiga L. Akutna upala pluća: neutrofilna elastaza naspram neutrofila u bronhoalveolarnom lavažu—neutrofilna elastaza odražava bolji intenzitet upale. Intenzivna njega Med. 1994;20:354-359.

26. Polverino E, Rosales-Mayor E, Dale GE, Dembowsky K, Torres A. Uloga inhibitora neutrofilne elastaze u plućnim bolestima. Prsa. 2017;152:249-262.

27. Korkmaz B, Moreau T, Gauthier F. Neutrofilna elastaza, proteinaza 3 i katepsin G: fizičko-hemijska svojstva, aktivnost i fiziopatološke funkcije. Biochimie. 2008;90:227-242.

28. Faurschou M, Borregaard N. Neutrofilne granule i sekretorne vezikule u inflamaciji. Mikrobi inficiraju. 2003;5:1317-1327.

29. Papayannopoulos V, Metzler KD, Hakkim A, Zychlinsky A. Neutrofilna elastaza i mijeloperoksidaza regulišu formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki. J Cell Biol. 2010;191:677-691.

30. Kolaczkowska E, Jenne CN, Surewaard BGJ, et al. Molekularni mehanizmi stvaranja i degradacije NET otkriveni intravitalnim snimanjem u vaskulaturi jetre. Nat Commun. 2015;6:6673.

31. Taylor S, Dirir O, Zamanian RT, Rabinovitch M, Thompson AAR. Uloga neutrofila i neutrofilne elastaze u plućnoj arterijskoj hipertenziji. Front Med (Lozana). 2018;5:217.

32. Nakazawa D, Marschner JA, Platen L, Anders HJ. Ekstracelularne zamke kod bolesti bubrega. Kidney Int. 2018;94:1087-1098.

33. Doring Y, Libby P, Soehnlein O. Neutrofilne ekstracelularne zamke učestvuju u kardiovaskularnim bolestima: nedavni eksperimentalni i klinički uvidi. Circ Res. 2020;126:1228-1241.

34. Bronze-da-Rocha E, Santos-Silva A. Inhibitori neutrofilne elastaze i hronična bolest bubrega. Int J Biol Sci. 2018;14:1343-1360.

35. Alam SR, Newby DE, Henriksen PA. Uloga endogenog inhibitora elastaze, elafina, u kardiovaskularnim ozljedama: od epitela do endotela. Biochem Pharmacol. 2012;83:695-704.

36. Clancy DM, Henry CM, Sullivan GP, ​​Martin SJ. Neutrofilne ekstracelularne zamke mogu poslužiti kao platforme za obradu i aktivaciju citokina porodice IL-1. FEBS J. 2017;284:1712-1725.

37. Alfaidi M, Wilson H, Daigneault M, et al. Neutrofilna elastaza podstiče lučenje interleukina-1beta iz ljudskog koronarnog endotela. J Biol Chem. 2015;290:24067-24078.

38. Korkmaz B, Horwitz MS, Jenne DE, Gauthier F. Neutrofilna elastaza, proteinaza 3 i katepsin G kao terapijski ciljevi u ljudskim bolestima. Pharmacol Rev. 2010;62:726-759.

39. Ackermann M, Verleden SE, Kuehnel M, et al. Plućni vaskularni endotelitis, tromboza i angiogeneza kod Covid-19. N Engl J Med. 2020;383:120-128.

40. Bikdeli B, Madhavan MV, Jimenez D, et al. COVID-19 i trombotična ili tromboembolijska bolest: implikacije na prevenciju, antitrombotičku terapiju i praćenje: JACC pregled stanja tehnike. J Am Coll Cardiol. 2020;75:2950-2973.

41. Drigin E, Madhavan MV, Bikdeli B, et al. Kardiovaskularna pitanja za pacijente, zdravstvene radnike i zdravstvene sisteme tokom pandemije COVID{1}}. J Am Coll Cardiol. 2020;75:2352-2371.

42. Babapoor-Farrokhran S, Gill D, Walker J, Rasekhi RT, Bozorgnia B, Amanullah A. Povreda miokarda i COVID-19: mogući mehanizmi. Life Sci. 2020;253:117723. 43. Doyen D, Moceri P, Ducreux D, Dellamonica J. Miokarditis kod pacijenta sa COVID-19: uzrok povišenog troponina i EKG promjena. Lancet. 2020;395:1516.

44. Renu K, Prasanna PL, Valsala GA. Patogeneza koronavirusa, komorbiditeti i oštećenje više organa—pregled. Life Sci. 2020;255:117839. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.117839

45. Libby P. Srce u COVID-19: primarna meta ili sekundarni promatrač? JACC Basic Transl Sci. 2020;5(5):537-542.

46. ​​Cheng Y, Luo R, Wang K, et al. Bolest bubrega je povezana sa bolničkom smrću pacijenata sa COVID-19. Kidney International. 2020. 97:829-838.

47. Oussalah A, Gleye S, Clerc Urmes I, et al. Dugotrajna upotreba ACE inhibitora/ARB povezana je s teškom disfunkcijom bubrega i akutnom ozljedom bubrega kod pacijenata sa teškim oblikom COVID-19: rezultati su iz grupe referentnih centara na sjeveroistoku Francuske. Clin Infect Dis. 2020;71(9):2447-2456.

48. Cheng Y, Luo R, Wang K, et al. Bolest bubrega je povezana sa bolničkom smrću pacijenata sa COVID-19. Kidney Int. 2020;97:829-838.

49. Liu T, Zhang J, Yang Y, et al. Uloga interleukina-6 u praćenju teških slučajeva korona virusa 2019. EMBO Mol Med. 2020;12:e12421.

50. Del Valle DM, Kim-Schulze S, Hsin-Hui H, et al. Inflamatorni citokinski potpis pomaže u predviđanju težine i smrti COVID-19. Nat Med. 2020;26:1636-1643.

51. Gao YD, Ding M, Dong X, et al. Faktori rizika za teške i kritično bolesne COVID-19 pacijente: pregled. Alergija. 2020; https://doi. org/10.1111/all.14657.

52. Akbari H, Tabrizi R, Lankarani KB, et al. Uloga profila citokina i podskupova limfocita u ozbiljnosti bolesti od korona virusa 2019. (COVID-19): sistematski pregled i meta-analiza. Life Sci. 2020;258:118167.

53. Roschewski M, Lionakis MS, Sharman JP, et al. Inhibicija Bruton tirozin kinaze kod pacijenata sa teškim oblikom COVID-19. Sci Immunol. 2020;5(48):eabd0110.

54. Colafrancesco S, Alessandri C, Conti F, Priori R. COVID-19 se pokvario: novi lik u spektru sindroma hiperferitinemije? Autoimmun Rev. 2020;19:102573.

55. Takeshita H, Yasuda T, Nakajima T, Hosomi O, Nakashima Y, Kishi K. Mišja deoksiribonukleaza I (DNase I): biohemijska i imunološka karakterizacija, cDNK struktura i distribucija tkiva. Biochem Mol Biol Int. 1997;42:65-75.

56. Ueki M, Takeshita H, Fujihara J, et al. Alel specifičan za kavkaske rase u nesinonimnim polimorfizmima jednog nukleotida gena koji kodira deoksiribonukleazu I-like 3, potencijalno relevantan za autoimunost, proizvodi neaktivan enzim. Clin Chim Acta. 2009;407:20-24.

57. Ueki M, Kimura-Kataoka K, Takeshita H, et al. Procjena svih nesinonimnih polimorfizama pojedinačnih nukleotida (SNP) u genima koji kodiraju ljudsku deoksiribonukleazu I i I-like 3 kao funkcionalni SNP potencijalno impliciran u autoimunosti. The FEBS Journal. 2014;281:376-390.

58. Keyel PA. Dnaze u zdravlju i bolesti. Dev Biol. 2017;429:1-11.

59. Jiménez-Alcázar M, Rangaswamy C, Panda R, et al. DNaze domaćina sprečavaju vaskularnu okluziju neutrofilnim ekstracelularnim zamkama. Nauka. 2017;358:1202-1206.

60. Chen D, Yang XL, Shen ZB, et al. Značaj ekstracelularne zamke neutrofila i njenih markera u ranoj dijagnostici pneumonije stečene u zajednici kod djece. Zhongguuoooo.com Na Epizoda I Zhi. 2019;21:868-875.

61. Denning NL, Aziz M, Gurien SD, Wang P. DAMPs and NETs in Sepsis. Front Immunol. 2019;10:2536.

62. Chen L, Long X, Xu Q, et al. Povišeni nivoi S100A8/A9 i HMGB1 u serumu pri prijemu u bolnicu su u korelaciji sa inferiornim kliničkim ishodima kod pacijenata sa COVID-19. Cell Mol Immunol. 2020;17:992-994.

63. Zitter JN, Maldjian P, Brimacombe M, Fennelly KP. Inhalirana dornaza alfa (Pulmozyme) kao neinvazivni tretman atelektaze kod pacijenata na mehaničkoj ventilaciji. J Crit Care. 2013;28(218):e1-e7.

64. Pottecher J, Noll E, Borel M, et al. Protokol za TRAUMADORNAZU: prospektivno, randomizirano, multicentrično, dvostruko slijepo, placebom kontrolirano kliničko ispitivanje aerosolizirane dornaze alfa za smanjenje učestalosti umjerene do teške hipoksemije kod pacijenata sa ventiliranim traumama. Suđenja. 2020;21:274.

65. Fuchs TA, Jimenez-Alcazar M, Göbel J, Englert H. Inženjering enzima DNAse i upotreba u terapiji. 2019.

PODRŽNE INFORMACIJE

Dodatne informacije o podršci mogu se naći na mreži u odjeljku Informacije o podršci.

Za više informacija:1950477648@nn.gmail.com