1. dio Učinci feniletanozida Cistanche Deserticola na ekspresiju -amiloidnog proteina u hipokampusu APP / PS1 transgenih miševa

1. dio Djelotvorni sastojci Cistanchea: terapeutski učinak ukupnih fenetil alkoholnih glikozida i verbaskozida na Alchajmerovu bolest

Za više informacija: Ali.ma@wecistanche.com

JU Bo-wei1 ,YANG Jian-hua2 ,HU Jun-ping3*

1 Peta pridružena bolnica Medicinskog univerziteta Xinjiang, Urumqi 830000, Kina;

2 Prva pridružena bolnica Medicinskog univerziteta Xinjiang, Urumqi 830054, Kina;

3 Farmaceutski fakultet, Medicinski univerzitet Xinjiang, Urumqi 830011, Kina

sažetak:

Da bi se proučavao učinak feniletanoida Cistanche deserticola na ekspresiju -amiloidnog proteina u hipokampusu miševa s Alchajmerovom bolešću,60 6-mjesečni APP/PS1 dvostruki transgeni AD miševi su nasumično podijeljeni u modelske grupe, donepezil grupu ( 0． 65 mg/kg), visoke, srednje i niske dozeukupni glikozidiCistanche deserticola (250,125 62． 5 mg/kg) i akteozid (125 mg/kg) su davani lijekovi i destilovana voda tokom 3 mjeseca. U dobi od 9 mjeseci, Morrisov vodeni lavirint i testovi pasivnog izbjegavanja korišćeni su za određivanje poremećaja učenja i pamćenja, hipokampalne lezije miševa su uočene HE bojenjem i izrazi A 1-42 i A {{ 7}} proteina u hipokampusu miševa detestirano je imunohistohemijskom metodom i Western-blot metodom.Cistanche deserticola feniletanoidmože značajno poboljšati sposobnost učenja i pamćenja te oštećenje hipokampalnih neurona kod APP/PS1 dvostrukih transgenih miševa. U poređenju sa grupom modela, broj A 1-42, A 1-40 pozitivnih ćelija u hipokampusu CA1Cistanche deserticolagrupa i kontrolna grupa je značajno smanjena, a rezultati Western blot-a su pokazali da je ekspresija proteina A 1-42, A 1-40 u hipokampusu Cistanche deserticola u svakoj grupi doziranja i interventnoj grupi bila znatno niže od one u grupi modela. Cistanche deserticola glikozid može zaštititi neurone i antagonizirati AD tako što smanjuje ekspresiju A 1-42, A 1-40 proteina u hipokampusu mozga miševa. U ovoj studiji, feniletanoid je identificiran kao glavna djelotvorna supstanca zaCistanche deserticolada ispoljava svoju anti-AD aktivnost koja pruža teoretsku podršku njegovom daljem razvoju kao novog lijeka protiv AD.

Ključne riječi:Cistanche deserticola; feniletanoid;Alchajmerova bolest; APP/PS1 dvostruki transgeni miševi; -amiloidni protein

Click to Cistanche tubulosa prah za Alchajmerovu bolest

Alchajmerova bolestje degenerativna bolest centralnog nervnog sistema koju karakteriše progresivni gubitak pamćenja i kognitivna disfunkcija. Trenutno, dobro poznata kaskadna hipoteza -amiloidnog proteina (A ) vjeruje da normalni metaboliti A 1-42 i A 1-40 monomeri u fiziološkim uslovima nisu neurotoksični, ali kada naiđu na egzogene medijatore APP, oni uzrokuju abnormalnosti. Nakon taloženja, akumulirani A 1-42 formira rastvorljive A oligomere (ADDL), koji sprečavaju monomere da proizvedu zaštitnu aktivnost i uzrokuju degeneraciju neurona, gubitak sinapse i oštećenje aksona, i konačno uzrokuju neuronsku apoptozu u mozgu da izazove demenciju , pa je istraživanje ekspresije njegovih ključnih meta A 1-42 i A 1-40 proteina u mozgu od velikog značaja za istraživanje prevencije i liječenjaCistanche feniletanoidni glikozidiu AD. U isto vrijeme, proučavanje histopatološkog pregleda hipokampusa karakterističnih lezija u mozgu AD životinjskih modela može uistinu odražavati poboljšanje lijekova na lezijama u mozgu iz makroskopskog pogleda.

Tradicionalna kineska medicina u mojoj zemlji to vjerujeCistanche, tradicionalna kineska medicina koja hrani bubrege i hrani esenciju, ima efekte protiv starenja, protiv starenja i poboljšanja pamćenja. Veliki broj preliminarnih studija je potvrdio da je ukupnofeniletanoidni glikozidi Cistanche i Acteoside, reprezentativni monomer glikozida fenetil alkohola, pokazuju očigledne antagonističke efekte na AD u in vivo ili in vitro modelima AD konstruisanih tradicionalnim metodama, te imaju određenu prevenciju i liječenje neurodegeneracije. Potencijal seksualnih bolesti. Međutim, primjena APP/PS1 dvostrukog transgenog modela Cistanche Acteoside nije korištena za sprovođenje istraživanja o prevenciji i liječenju AD iz perspektive -amiloida.

Ukratko, ova studija se temelji na klasičnoj hipotezi o AD patogenezi – hipotezi kaskadne reakcije, uz pomoć idealnog i pouzdanog AD životinjskog modela APP / PS1 dvostrukih transgenih miševa kao in vivo istraživačke platforme, koristeći Morrisov vodeni labirint i HE metoda bojenja, Western blot, imunohistohemija i druge napredne tehničke metode, iz perspektive ponašanja životinja, histopatologije i molekularne biologije Kako bi se pronašli novi ciljevi za prevenciju i liječenje AD, to će pružiti referencu za proučavanje specifičan mehanizam djelovanja Cistanche feniletanoidnih glikozida u prevenciji i liječenju AD.

1. Reagensi i instrumenti

1.1 Reagens

Cistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(samostalno izradila istraživačka grupa, sadržaj feniletanoidnih glikozida je 87,6 posto);Acteoside; titanijum dioksid; HE komplet za bojenje; neutralna guma; SDS-PAGE komplet za pripremu gela; Komplet za kvantifikaciju BCA proteina; A 1-40; A 1-42; -aktin; Alkalna fospaza označena zečjim anti-kozjim IgG (H plus L); 4 × pufer za punjenje proteina Sadrži -merkaptoetanol; 10 × TBST; PVDF membrana; SDS; Tris; glicin; obrano mlijeko u prahu; BCIP /NBT komplet; sekundarno antitelo; Tween 20.

1.2 Životinje

60 6-mjesečni APP/PS1 dvostruki transgeni AD model miševa

I 10 negativnih miševa, mužjaka i ženki, tjelesne težine 20 ± 10 g, životinje slobodno jedu i piju tokom eksperimenta.

1.3 Aparati

MT{0}} Morris vodeni labirint; gel imager; RM2016 bolest

Microtome; SIM-F124 ledomat; Oprema za gel elektroforezu i prijenosne membrane; čitač mikroploča pune talasne dužine; CO2 inkubator konstantne temperature; 4 stepena i -20 stepena frižider; 67120 instrument ultra čiste vode

; TP{0}} elektronski balans; rashladna centrifuga velike brzine niske temperature; DVKW-D-2 digitalni displej električno grijanje konstantna temperatura vodeno kupatilo; ultrazvučni razbijač ćelija; WD-9405Šejker za uklanjanje boje; podesivo napajanje konstantnog napona i struje; DM4000 fluorescentni invertni mikroskop.

2. Metoda

2.1 Grupisanje životinja i administracija

Prema SPSS18. 0 Slučajni brojevi generirani statističkim softverom, 1156 Natural Products Research and Development Vol. 31AD model miševi su nasumično podijeljeni u modelsku grupu i donepezil grupu (dnevna infuzija)

Želučana doza je 0. 65 mg/kg), Cistanche fenetil alkohol ukupni glikozidi (PhGs) visoke, srednje i niske doze grupe (dnevne doze su 250, 125, 62,5 mg/kg, respektivno), Cistanche verbascoside interventna grupa (125 mg/kg) kg ), 10 po grupi. U dobi od 6 mjeseci, miševi su primali intragastričnu gavažu prema grupama, a miševi su davani intragastrično jednom dnevno tokom 3 uzastopna mjeseca. Normalna grupa se sastojala od netransgenih miševa u istom leglu. Grupi modela i normalnoj grupi dat je jednak volumen destilovane vode putem sonde.

2.2 Eksperiment Morrisovog vodenog lavirinta

Klasični Morrisov vodeni labirint korišten je za testiranje prostornog učenja i sposobnosti pamćenja miševa. Prvog i drugog dana trenirajte miševe da budu upoznati s položajem platforme i vježbajte pronalaženje platforme. Trećeg do petog dana će se provesti formalni test kako bi se promatrala situacija miševa u svakoj grupi koja traži platformu nakon treninga. Šestog dana platforma će biti uklonjena i miševi će biti posmatrani.

Staza za plivanje. Tokom eksperimenta, kamera će istovremeno snimiti vrijeme koje je miš proveo u potrazi za platformom (tj. latentnost bijega) i udaljenost staze za plivanje. Ako miš ne pronađe platformu unutar postavljenog vremenskog raspona (obično postavljeno na 60 s ili 120 s, ovaj eksperiment koristi 60 s), tada se latencija miša za bijeg bilježi kao postavljena vrijednost, a osoblje će ostati uključeno. platformu na nekoliko sekundi (10 s se koristi u ovom eksperimentu) kako bi joj se pomoglo da produbi pamćenje platforme. Nakon eksperimenta, zabilježite vrijeme plivanja miševa od ulaska u vodu do pronalaska platforme. Posljednjeg dana eksperimenta platforma je uklonjena, a sadržaj koji se snima u zadato vrijeme uglavnom je uključivao broj prelaska miša preko platforme, vrijeme boravka ciljnog kvadranta itd., te strategiju pretraživanja analizirane su svake eksperimentalne životinje.

2.3 Ekstrakcija moždanog tkiva i ugradnja parafina

Nakon davanja, miševi su izvagani, a miševi su anestezirani sa 10 posto hloral hidrata. Stavite anesteziranog miša na operacijski sto da popravite udove. Nakon perfuzije i fiksacije paraformaldehida od 4 posto, životinje su žrtvovane, mali mozak i drugo dodatno moždano tkivo su uklonjeni, a cijeli mali mozak i mozak su uklonjeni duž kraja moždane hemisfere.

Prednja polovina centralne krune. Fiksirajte u 4 posto paraformaldehida 24 sata, isperite ultra čistom vodom 10 minuta, a zatim stavite u 30 posto etanol (1 h) → 40 posto etanol (1 h) → 50 posto etanol (1 h) → 75 posto etanol (1 h) ) → 90 posto etanola (1 h) → 95 posto etanola (1 h) → bezvodni etanol I (1 h) → bezvodni etanol II (1 h) → ksilen I (15 min) → ksilen II (15 min ). Nakon uranjanja u parafin tokom 2 sata, tkiva su ugrađena u kontinuirane koronalne preseke u CA1 području hipokampusa mišjeg mozga. Nakon sušenja u rerni na 60 stepeni 48 h čuvati na sobnoj temperaturi.

2.4 HE bojenje

Pecite kriške odabrane u svakoj grupi u rerni na 60 stepeni 40 minuta, a zatim ih stavite u ksilen I (5 min) → ksilen II (10 min) → apsolutni etanol (5 s) → 95 posto etanol I (5 s) → 95 posto etanola II (5 s) → 80 posto etanola (5 s) → destilovana voda

Drugo, koristite komplet za bojenje HE za bojenje i montiranje stakalca neutralnom gumom.

2.5 Imunohistohemijsko bojenje

Pripremljeni rezovi su podvrgnuti imunohistohemijskom bojenju u skladu sa standardnim koracima deparatacije, uzimanja antigena, blokiranja endogene katalaze, blokade seruma, primarne inkubacije antitijela, sekundarne inkubacije antitijela, razvoja DAB boje, dehidracije i montaže. Izaberite 6 odgovarajućih kriški za svaku grupu, posmatrajte finoću neurona pod elektronskim mikroskopom

Morfologija ćelije, boja i broj pozitivnih ćelija hipokampusa pomoću softvera Image J.

2.6 Western blot analiza ekspresije proteina

Aspirirajte supernatant tkiva da odredite sadržaj proteina ekstrahovan iz hipokampusa moždanog tkiva prema BCA metodi kvantifikacije proteina. Pomiješajte ga sa 4× puferom za punjenje proteina u omjeru 4:1, zagrijte ga na 95 stepeni 10 min, ohladite na prirodan način i čuvajte u frižideru na -20 stepeni. Pripremite SDS-PAGE gel, dodajte rastvor za elektroforezu, a zatim dodajte normalnu grupu, grupu za intervenciju leka i druge histone u nizu, i dodajte proteinski marker u otvore gela sa obe strane. Zaustavite elektroforezu u ledenoj kupki do dna gela za odvajanje. Nakon što se tečnost membrane za prijenos izbalansira, izrežite PVDF membranu i filter papir prema veličini ljepila. U stezaljci za prijenos slijedite korake: crna vlaknasta podloga → 3 sloja filter papira → gel → PVDF membrana → 3 sloja filter papira → crna vlaknasta podloga za sastavljanje. Nakon uklanjanja mjehurića, prebacite membranu na konstantan pritisak od 80 V. Nakon što je prijenos filma završen, obrano mlijeko je zatvoreno 2 h. Razrijeđeno antitijelo se dodaje na odgovarajuću membranu i inkubira noć. Nakon inkubacije sekundarnog antitijela 2 h, dodajte BCIP/NBT rastvor za razvijanje boje dok se boja ne razvije. BIO-RAD gel imager snima slike. Koristite softver Image J da kvantitativno analizirate ciljnu traku proteina i koristite IOD da ukažete na relativnu snagu proteinske trake. Rezultat se izražava kao omjer integrirane vrijednosti optičke gustoće ciljnog proteina i kontrolnog proteina -aktina. Rezultat se izražava kao (ID ciljnog proteina/interni referentni ID) × 100 posto.

2.7 Statistička analiza podataka

Koristite SPSS18. 0 Izvršite statističku analizu podataka. Podaci su predstavljeni sa (x± s). Poređenje podataka između grupa koristi One-Way ANOVA test i analizu, a višestruka poređenja između podataka koristi LSD-t-test (najmanje značajna razlika, LSD). ), sa P<0. 05="" or="" p=""><0. 01="" means="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

3 Eksperimentalni rezultati

3.1 Rezultati detekcije Morrisovog vodenog lavirinta

Kako vrijeme treninga nastavlja da raste, vrijeme za svaku grupu miševa da stigne do platforme (latentnost bijega) se značajno skraćuje. Prvi i drugi dan su vrijeme za obuku. Trećeg dana, latencija bijega u grupi modela bila je značajno duža od one normalne kontrolne grupe (P<0.01); the="" fourth="" and="" fifth="" days="" were="" compared="" with="" the="" normal="" control.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" escape="" latency="" of="" the="" mice="" in="" the="" donepezil="" group="" was="" significantly="" shorter="" than="" that="" of="" the="" model="" group="" (p=""><0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" glycosides="" of="">cistanchefenetil alkohol U svakoj grupi doza iActeosidesgrupi, kako se doza povećavala, latencija bijega miševa je značajno skraćena, uz značajne razlike (P<0.05) (see="" table="">

Šestog dana eksperimenta u vodenom lavirintu, platforma je uklonjena za eksperiment istraživanja svemira, a zabilježen je broj puta kada je svaka grupa miševa prešla poziciju platforme u roku od 60 s. Iz rezultata se vidi da je broj puta prelaska platforme u grupi modela u zadatom vremenu značajno smanjen u odnosu na normalnu grupu (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" total="" glucoside="" groups="" and="" mullein="" the="" number="" of="" times="" of="" crossing="" the="" platform="" in="" the="" glycoside="" group="" was="" significantly="" increased="" (p=""><0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 2).="" the="" above="" research="" results="" all="" suggest="" that="">Cistanche feniletanoidni glikozidimože značajno poboljšati sposobnost učenja i pamćenja APP/PS1 dvostrukih transgenih AD miševa i ima određenu dozu ovisnosti.

3.2 Rezultati posmatranja patološkog bojenja tkiva

Rezultati pokazuju da su neuroni u CA1 području hipokampusa u normalnoj grupi raspoređeni uredno i čvrsto, raspoređeni su ravnomjernije, sa jasnim slojevima, a jezgro tjelesnih ćelija pršljenova je veće i oblika približno okruglog. Međutim, CA1 područje hipokampusa miševa modelne grupe je oštećeno, što je rezultiralo očiglednim promjenama neuronskih stanica i morfologije, raspored je bio labav i haotičan, nije postojala očigledna hijerarhija, veze između stanica su bile labave, a neke jezgre pojavila se piknoza i apoptoza, čineći bojenje dubljim. Hipokampalne CA1 ćelije različitih dozaCistanche phenethanolosideinterventna grupa, donepezil grupa i interventna grupa verbaskozida sve su poboljšane u različitom stepenu. Piknotične i duboko obojene neuronske ćelije su značajno smanjene u poređenju sa modelnom grupom, ali veće se i dalje mogu videti u međućelijskom prostoru (vidi sliku 1).

3.3 Rezultati imunohistohemijskog eksperimenta

Nakon tretmana sa Cistanche fenetil alkoholnim glikozidima, uzet je devetomjesečni APP/PS1 dvostruki presek transgenog tkiva mozga miša, a područje CA1 hipokampusa je podvrgnuto imunohistohemijskom bojenju A 1-40. Rezultati su pokazali da su pozitivne ćelije uglavnom bile kružne u vidnom polju. Većina ćelijskih membrana je smeđe-žute boje. U poređenju sa normalnom grupom, broj A 1-40 pozitivnih ćelija u području CA1 hipokampusa modelne grupe značajno se povećao (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" phenethyl="" alcohol="" glycosides="" of="">Cistanche tubulosabila visoka. Broj pozitivnih ćelija u grupi sa srednjom dozom i grupi sa Acteoside glikozidom je značajno smanjen (P<0.01), the="" donepezil="" group,="" and="" the="">Cistanche feniletanoidni glikozidiniske doze.

Broj A 1-40 pozitivnih ćelija u grupi koja je primala dozu je značajno smanjen (P<0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 3,="" figure="">

Nakon intervencije feniletanoidnih glikozida Cistanche, uzeta su moždana tkiva 9-mjesečnih APP/PS1 dvostrukih transgenih miševa, a područje CA1 hipokampusa je obojeno imunohistohemijskim bojenjem A 1-42. Rezultati su pokazali: U poređenju sa grupom modela,Cistanche feniletanoidni glikozidiBroj pozitivnih ćelija u svakoj dozi grupi glikozida i grupi Acteoside glikozida je značajno smanjen, sa značajnom razlikom (P<>

3.4 Rezultati Western blot testa

Western-blot metoda je korištena za otkrivanje ekspresije A 1-40 i A 1-42 proteina u hipokampusu miševa. Rezultati su pokazali da je ekspresija proteina A 1-40 i A 1-42 u hipokampusu modelne grupe značajno povećana u poređenju sa normalnom grupom, i da je postojala značajna razlika (P < {{="" 6}}.="" 05).="" ekspresija="" proteina="" hipokampusa="" a="" 1-40="" i="" a="" 1-42="" kod="" miševa="" u="" interventnoj="">Cistanche feniletanoidni glikozidiverbascosideInterventna grupa bila je značajno smanjena u odnosu na miševe u modelnoj grupi (P<0.01), and="" there="" was="" a="" significant="" difference="" (p=""><0.01). 01),="" see="" figure="">