Ehinakozid modulira CGAS-STING put za ublažavanje upalnih ozljeda izazvanih LPS-om u alveolarnim epitelnim stanicama (A549)

 

Autori:Jianfeng Luo; Tao Bai
pripadnost:Odjeljenje 1, odjel za infektivne bolesti, bolnica Wuhan Jinyintan, Wuhan 430000, Hubei, Kina

 

Key Takeaways (za čitaoce istraživanja i razvoja prirodnih sastojaka i dodataka)

Izlaganje LPS-u je oštetilo A549 alveolarne epitelne ćelije, smanjujući markere proliferacije i povećavajući apoptozu i upalne citokine.

Ehinakozid (ECH) pokazao je zaštitu ovisno o dozi: poboljšana vitalnost/proliferacija ćelija i smanjena apoptoza i inflamatorni medijatori.

Mehanički, koristi su bile povezane saregulacija naniže signalne ose cGAS–STING–TBK1–IRF3na nivou mRNA i proteina.

aktivator cGAS-STING puta (RocA) oslabio/antagonizirao zaštitne efekte ECH-a, podržavajući uključenost u put.

Relevantnost za botanički razvoj: Cistanche(肉苁蓉) je naširoko prepoznat kao botanički lijek bogat ehinakozidom, što ga čini praktičnim materijalom uzvodno koje treba uzeti u obzir za istraživanje i razvoj proizvoda - a pritom se sjećamo da je ova studijain vitroi koristi pročišćeni ECH.

Tabela 1. Učinci različitih koncentracija ECH i RocA na A549 ćelije (OD570_{570}570​, xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Koncentracija (μmol/L)	ECH (OD570_{570}570​)	RocA (OD570_{570}570​)
0	0.45 ± 0.03	0.43 ± 0.04
3	0.42 ± 0.05	0.45 ± 0.06
6	0.43 ± 0.04	0.42 ± 0.05
9	0.46 ± 0.06	0.46 ± 0.07
12	0.44 ± 0.05	0.44 ± 0.05
24	0.47 ± 0.06	0.20 ± 0.03¹

F/P vrijednost:ECH: 0,857 / 0,521; RocA: 22.050 /<0.001
Napomena:U poređenju sa 0 μmol/L: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Sažetak (prepisan na engleskom, tačka po tačku)

Cilj

Da proceni da liehinakozid (ECH)štiti ljudske alveolarne epitelne ćelije odupalne ozljede izazvane lipopolisaharidom (LPS).i da li je ova zaštita povezana sa regulacijomcGAS–STINGsignalni put.

Metode (dizajn studije)

Model ćelije:Ljudska alveolarna epitelna ćelijska linijaA549.

Skrining citotoksičnosti/viabilnosti:MTT test za testiranje ECH i cGAS-STING aktivatora puta (RocA) za toksičnost.

Grupisanje:

Kontrola (standardna kultura)

LPS (30 mg/L)

LPS + ECH niska/srednja/visoka doza (9, 12, 24 μmol/L)

LPS + ECH (24 μmol/L) + RocA (12 nmol/L)

Krajnje tačke:

Proliferacija:EdU bojenjeiPCNA(Western blot)

apoptoza:Protočna citometrija (Annexin V-FITC/PI); Bax/Bcl‑2(Western blot)

upala:TNF‑, IL‑6u supernatantu (ELISA)

Očitavanje putanje:cGAS, STING mRNA(qRT-PCR);cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteini(Western blot)

 

Tabela 2. Poređenje stope EdU-pozitivnosti, ekspresije PCNA, stope apoptoze, ekspresije Bax/Bcl-2 i nivoa TNF- /IL-6 u ćelijama A549 među grupama (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Grupa	EdU-pozitivna stopa	PCNA/GAPDH	Stopa apoptoze (%)	Bax/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	TNF- (ug/ml)	IL-6 (ng/ml)
Kontrola	57.38 ± 3.24	1.67 ± 0.15	4.38 ± 1.09	0.37 ± 0.06	1.63 ± 0.12	4.65 ± 1.08	18.47 ± 1.19
LPS	27.51 ± 1.68¹	0.49 ± 0.08¹	36.75 ± 2.31¹	1.59 ± 0.13¹	0.28 ± 0.06¹	30.71 ± 1.68¹	49.23 ± 2.75¹
ECH-L	33.72 ± 1.96²	0.86 ± 0.10²	29.16 ± 2.27²	1.24 ± 0.11²	0.67 ± 0.08²	22.58 ± 1.52²	41.78 ± 2.46²
ECH-M	40.59 ± 2.40²,³	1.27 ± 0.13²,³	21.93 ± 1.64²,³	0.85 ± 0.09²,³	1.08 ± 0.10²,³	15.83 ± 1.16²,³	32.64 ± 2.18²,³
ECH-H	48.21 ± 2.57²,³,⁴	1.58 ± 0.14²,³,⁴	13.86 ± 1.45²,³,⁴	0.49 ± 0.08²,³,⁴	1.35 ± 0.11²,³,⁴	7.91 ± 1.13²,³,⁴	23.59 ± 1.57²,³,⁴
RocA	35.79 ± 2.38⁵	0.92 ± 0.11⁵	25.74 ± 1.69⁵	0.93 ± 0.10⁵	0.74 ± 0.09⁵	19.76 ± 1.20⁵	36.78 ± 2.61⁵

F vrijednost: 118.927; 85.600; 245.724; 131.552; 159.598; 321.852; 161.353
P vrijednost:sve<0.001

Napomene (više poređenja):
U poređenju saKontrola: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05
U poređenju saLPS: ² P<0.05P<0.05P<0.05
U poređenju saECH-L: ³ P<0.05P<0.05P<0.05
U poređenju saECH-M: ⁴ P<0.05P<0.05P<0.05
U poređenju saECH-H: ⁵ P<0.05P<0.05P<0.05

 

 

Rezultati (glavni nalazi)

U poređenju sa Kontrolom,LPS:

SmanjenaEdU-pozitivna stopa,PCNA, iBcl‑2

Povećanostopa apoptoze,TNF‑, IL‑6

UpregulatedcGAS i STING na nivou mRNA

PovećanoProteini Bax i cGAS–STING puta (cGAS, STING, TBK1, IRF3)
(Svi statistički značajni, P<0.05P<0.05P<0.05.)

U poređenju sa samim LPS-om,ECH (9→12→24 μmol/L)ovisno o dozi:

Obnovljena proliferacija(viša stopa EdU-pozitivnosti i PCNA)

Smanjena apoptoza(manja stopa apoptoze, niži Bax, viši Bcl-2)

Potisnuta upala(niži TNF‑ i IL‑6)

Sniženo regulisana cGAS–STING signalizacija(niži cGAS/STING mRNA; niži cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteini)
(Zavisno od doze, P<0.05P<0.05P<0.05.)

RocA se suprotstavioECH-ova zaštita u uslovima povrede LPS (P<0.05P<0.05P<0.05), consistent with cGAS–STING pathway involvement.

Zaključak

ECHpovećana održivost i proliferativna aktivnostalveolarnih epitelnih ćelija izazvanih LPS-om ipotisnuta apoptoza i upalni odgovori. Zaštitni mehanizam je vjerovatno povezan sainhibicija/blokada prekomjerno aktivirane cGAS–STING signalizacije.

 

Pozadina (zašto je ovo važno)

Kod pacijenata koji su izloženi ili inficirani LPS-om (glavnom gram-negativnom bakterijskom komponentom),akutna ozljeda pluća (ALI)i njegov teški oblikARDSsu ključni pokretači morbiditeta i mortaliteta. Karakteristična patologija uključuje difuznu ozljedualveolarnog epitelaikapilarnog endotela, što dovodi do curenja barijere i plućnog edema.

Uprkos napretku u suportivnoj njezi,efikasne ciljane terapije ostaju ograničene, pa je identifikacija novih kandidata i meta za drogu važna.

ehinakozid (ECH)je feniletanoidni glikozid sa prijavljenim aktivnostima uključujući antioksidativne, antiinflamatorne, citoprotektivne i antiapoptotičke efekte.
Za programere prirodnih proizvoda:Cistanche (肉苁蓉)je tradicionalna botanička biljka koja se često ističe kao bitakbogat ehinakozidom, što ga čini praktičnim izvornim materijalom kada se istražuju formulacije orijentisane na ECH – dok takođe zahteva pažljivu standardizaciju i rad na prevođenju izvan ćelijskih testova.

ThecGAS–STING putje os citosolne DNK koja promiče proizvodnju interferona tipa I i medijatora upale. Dokazi to govorepretjerana aktivacijacGAS-STING doprinosi inflamatornoj i autoimunoj patologiji i da suzbijanje ove prekomjerne aktivacije može pomoći u ublažavanju upalnih ozljeda pluća.

 

Materijali i metode (sažetak prilagođen istraživanju i razvoju)

Ćelijska linija i kultura

A549 ćelije su uzgajane uDMEM sa niskim sadržajem glukozesa10% FBSi1% antibiotika, sa srednjim promjenama svaka 2 dana. Eksperimenti su izvedeni na~80–90% ušća.

Reagensi (visoki nivo)

ECH(informacije o prodavcu navedene u originalnom dokumentu)

LPS

RocA(ovdje se koristi kao acGAS–STING aktivator puta)

Kompleti za analizu: MTT, EdU, komplet za apoptozu (Annexin V-FITC/PI), ELISA kompleti za TNF- i IL-6

Molekularni testovi: ekstrakcija RNK, reverzna transkripcija, qRT-PCR reagensi; antitela za Western blot (PCNA, Bax, Bcl‑2, cGAS, STING, TBK1, IRF3, GAPDH)

Odabir doze (skrining održivosti)

ECH (0–24 μmol/L)pokazaonema značajne citotoksičnostiu ćelijama A549 i stoga9/12/24 μmol/Lsu korišteni.

RocAbio netoksičan iznutra0–12 nmol/L, dok je veća koncentracija smanjila vitalnost;12 nmol/Lje odabrano.

Indukcija i grupiranje LPS ozljeda

Povreda LPS-a je izazvana sa30 mg/L LPS.

Terapijske ruke su bile kao što je opisano u sažetku (kontrola; LPS; LPS+ECH nizak/srednji/visok; LPS+ECH visoki+RocA).

Mjerenja ishoda

Proliferacija:EdU-pozitivne ćelije fluorescentnom mikroskopijom; PCNA metodom Western blot.

apoptoza:Protočna citometrija (Aneksin V-FITC/PI); Nivoi proteina Bax i Bcl‑2.

Medijatori upale:TNF‑ i IL‑6 u supernatantu kulture pomoću ELISA.

Izraz putanje:cGAS i STING mRNA pomoću qRT-PCR koristeći GAPDH kao internu kontrolu; proteini (cGAS, STING, TBK1, IRF3) Western blot-om.

Statistika:ANOVA sa SNK‑q post-hoc testiranjem (GraphPad Prism 9.0), značajnost postavljena na P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Rezultati (šta se promijenilo sa LPS, ECH i RocA)

1) Vijabilnost ćelije / prozor toksičnosti

ECH se dobro podnosio do testiranog opsega korištenog za mehanička ispitivanja.

RocA je zahtijevao oprezno doziranje; odabrana je netoksična radna koncentracija.

Slika 1. Proliferacija A549 ćelija u svakoj grupi (EDU bojenje, ×200)

 

2) Proliferacija je potisnuta LPS-om i obnovljena ECH

LPS smanjenEdU incorporationiPCNAekspresija, što ukazuje na smanjenu proliferativnu aktivnost.

ECH je povećao stope pozitivnih na EdU i PCNAna način ovisan o dozi.

Dodavanje RocA smanjilo je ove dobitke, što sugerira da put doprinosi ECH-ovom učinku za preživljavanje/proliferaciju.

3) Apoptoza se povećala sa LPS-om i inhibirala je ECH

LPS je povećao stopu apoptoze, povećaoBax, i smanjenaBcl‑2.

ECH je preokrenuo ove promjene ovisno o dozi (niža stopa apoptoze i Bax, viši Bcl-2).

RocA je pomaknuo fenotip natrag prema apoptozi, oslabivši ECH zaštitu.

Slika 2. Western blot analiza ekspresije PCNA, Bax i Bcl-2 u svakoj grupi

 

4) Inflamatorni citokini (TNF‑, IL‑6) smanjeni su ECH

LPS je povećao TNF‑ i IL‑6 u supernatantima.

ECH je smanjio oba citokina dozno-ovisno.

RocA ih je povećao u odnosu na samu visoku dozu ECH, u skladu s reaktivacijom puta koja pojačava upalu.

5) transkripciju cGAS i STING inducirao je LPS i potisnuo ECH

LPS povećancGAS i STING mRNA.

ECH je smanjio njihovu ekspresiju (zavisno od doze).

RocA je povećao ekspresiju u poređenju sa visokom dozom ECH.

Slika 3. Poređenje apoptoze A549 ćelija u svakoj grupi

 

6) Proteini cGAS-STING puta su bili smanjeni od strane ECH

LPS povećancGAS, STING, TBK1 i IRF3ekspresija proteina.

ECH je smanjio ove proteine ​​ovisno o dozi.

RocA je povećao nivoe proteina na putu u odnosu na samu visoku dozu ECH.

 

Tabela 3. Poređenje ekspresije cGAS/STING mRNA i cGAS–STING puta proteina u A549 ćelijama među grupama (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Grupa	cGAS mRNA	STING mRNA	cGAS/GAPDH	STING/GAPDH	TBK1/GAPDH	IRF3/GAPDH
Kontrola	1.00 ± 0.12	1.00 ± 0.11	0.32 ± 0.07	0.36 ± 0.08	0.29 ± 0.05	0.25 ± 0.06
LPS	2.15 ± 0.16¹	2.28 ± 0.17¹	1.68 ± 0.13¹	1.85 ± 0.16¹	1.57 ± 0.13¹	1.62 ± 0.14¹
ECH-L	1.74 ± 0.13²	1.83 ± 0.14²	1.34 ± 0.12²	1.42 ± 0.13²	1.24 ± 0.11²	1.23 ± 0.12²
ECH-M	1.36 ± 0.11²,³	1.31 ± 0.12²,³	0.82 ± 0.09²,³	1.03 ± 0.11²,³	0.86 ± 0.09²,³	0.78 ± 0.09²,³
ECH-H	0.73 ± 0.09²,³,⁴	0.62 ± 0.08²,³,⁴	0.45 ± 0.08²,³,⁴	0.57 ± 0.09²,³,⁴	0.47 ± 0.08²,³,⁴	0.38 ± 0.07²,³,⁴
RocA	1.58 ± 0.12⁵	1.69 ± 0.15⁵	1.17 ± 0.11⁵	1.28 ± 0.14⁵	1.12 ± 0.10⁵	0.97 ± 0.10⁵

F/P vrijednosti:

cGAS mRNA: 103.612 /<0.001

STING mRNA: 124.857 /<0.001

cGAS/GAPDH: 160.066 /<0.001

STING/GAPDH: 124.141 /<0.001

TBK1/GAPDH: 150.139 /<0.001

IRF3/GAPDH: 158.576 /<0.001

 

Slika 4. Ekspresija proteina puta cGAS-STING u ćelijama svake grupe

 

Diskusija (tumačenje za čitaoce proizvoda i mehanizama)

LPS se obično koristi za modeliranje upalnih ozljeda pluća. Ovdje je LPS direktno oslabio proliferativni kapacitet alveolarnih epitelnih stanica i promovirao apoptozu, praćeno povišenim TNF‑ i IL‑6-dva citokina koji su široko povezani s upalnim oštećenjem pluća.

ECH je djelovao kao acitoprotektivno i protuupalno sredstvou ovom in-vitro okruženju, u skladu s prethodnim izvještajima da ECH može ublažiti oksidativni stres, upalu i apoptozu u kontekstu ozljede pluća.

Osa cGAS–STING (i nizvodno TBK1/IRF3) izgleda kao mehanički čvor:ECH je snizio cGAS–STING markere puta, iRocA je umanjila prednosti ECH-a, podržavajući hipotezu da ECH barem djelomično štiti ćelijeblokiranje prekomjerne aktivacije cGAS-STING-a.

Šta ovo sugerira za prirodni botanički razvoj (kontekst Cistanche)

JerCistanche (肉苁蓉)je poznat povisok sadržaj ehinakozida, to je logičan botanički kandidat kada istražujete formulacije usmjerene na ECH koje imaju za cilj teme upalne ravnoteže i zaštite epitela.

Međutim, prevođenje ovoga na dodatke zahtijeva oprez: ovo djelo jestebaziran na ćelijskoj liniji, koristiLPS povredaiprečišćeni ECH, i ne utvrđuje efikasnost kod ljudi, oralnu bioraspoloživost, metabolizam ili klinički relevantno doziranje.

Ograničenja i sljedeći koraci (kako impliciraju autori)

Nalazi zahtevaju validaciju uin vivo ALI/ARDS modeliza potvrdu efikasnosti i mehaničke veze sa cGAS-STING u fiziološkim uslovima.

Dalji rad bi bio potreban da bi se mapirali uzvodni okidači i potvrdili da li su efekti direktna inhibicija puta u odnosu na sekundarno smanjeni ćelijski stres.

 

Reference (sačuvane kompletne, kako je navedeno)

Li N, Liu B, Xiong R, et al. Nedostatak HDAC3 štiti od akutne povrede pluća održavanjem integriteta epitelne barijere kroz očuvanje kontrole kvaliteta mitohondrija.Redox Biol, 2023;63(1):102746-61.

Long ME, Mallampalli RK, Horowitz JC. Patogeneza pneumonije i akutne ozljede pluća.Clin Sci (Lond), 2022;136(10):747-69.

Mokrý AD. Akutna ozljeda pluća - od patofiziologije do liječenja.Physiol Res, 2020;69(Suppl 3):S353-66.

Wang W, Jiang S, Zhao Y, et al. Ehinakozid: obećavajući aktivni prirodni proizvodi i farmakološka sredstva.Pharmacol Res, 2023;197(1):106951-66.

Pan Y, Liu Y. Echinacoside ublažava remodeliranje disajnih puteva i upalu kod neonatalnog mišjeg modela astme izazvanog ovalbuminom modulacijom SIRT1-NF-κB puta.Allergol Immunopathol (Madr), 2023;51(4):71-7.

Cui YH, Li KF, Jin B, et al. Ehinakozid inhibira bleomicinom induciranu ozljedu epitelnih stanica pluća i upalni odgovor.Kineski časopis za patofiziologiju, 2021;37(11):2024-30.

Xie W, Deng L, Lin M, et al. Sirtuin1 posreduje u zaštitnim efektima ehinakozida protiv akutne ozljede pluća izazvane sepsom regulacijom osi NOX4-Nrf2.Antioksidansi (Bazel), 2023;12(11):1925-45.

Alonso Paiva IM, Santos AR, Brito CB, et al. Uloga cGAS/STING puta u kontroliBrucella abortusinfekcija dobijena respiratornim putem.Front Immunol, 2023;14:1116811.

Zhao J, Zhen N, Zhou Q, et al. MREŽE promoviraju upalne ozljede aktiviranjem cGAS-STING puta kod akutne ozljede pluća.Int J Mol Sci, 2023;24(6):5125-45.

Wu X, Jiang Y, Li R, et al. Fikolin B koji luče egzosomi alveolarnih makrofaga pogoršava ozljedu pluća uzrokovanu bleomicinom putem feroptoze kroz cGAS-STING signalni put.Cell Death Dis, 2023;14(8):577-92.

Zhang SW, Cheng SL, Xing QF. Pahimična kiselina ublažava ozljedu epitelnih stanica debelog crijeva kod pacova s ​​ulceroznim kolitisom inhibiranjem cGAS-STING signalnog puta.Journal of Immunology(Kina), 2023;39(8):672-80.

Zhang JJ, Li YY, Qin J. lncRNA LUCAT1 cilja miR-203a-3p da utječe na apoptozu i upalni odgovor u LPS-induciranim alveolarnim epitelnim stanicama tipa II.Journal of Immunology(Kina), 2023;39(8):689-95.

Li J, Deng SH, Li J, et al. Obacunone ublažava feroptozu tokom akutne ozljede pluća izazvane lipopolisaharidom tako što povećava regulaciju antioksidativnih odgovora zavisnih od Nrf2.Cell Mol Biol Lett, 2022;27(1):29-48.

Hong H, Lou S, Zheng F, et al. Hydnocarpin D ublažava akutnu ozljedu pluća izazvanu lipopolisaharidom putem MAPK/NF-κB i Keap1/Nrf2/HO-1 puta.fitomedicina, 2022;101(1):154143-50.

Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y, et al. Interfazna kultura zraka i tekućine daje SARS-CoV-2 osjetljivost na A549 alveolarne epitelne stanice.Biochem Biophys Res Commun, 2021;577:146-51.

Wang Y, Fan Y, Huang Y, et al. TRIM28 reguliše ulazak u SARS-CoV-2 ćelije ciljajući ACE2.Cell Signal, 2021;85:110064.

Yang X, Ma L. Post-tretman propofolom inhibira upalni odgovor u LPS-induciranim epitelnim stanicama alveolarnog tipa II.Exp Ther Med, 2022;23(4):249.

Duan XY, Sun Y, Zhao ZF, et al. Baicalin ublažava ozljedu A549 epitelne ćelije alveolarnog tipa II izazvanu LPS-om slabljenjem signalnog puta FSTL1 povećanjem ekspresije miR-200b-3p.Inate Immun, 2021;27(4):294-312.

Lei X, Liu X, Yu J, et al. 3-metiladenin ublažava akutnu ozljedu pluća inhibiranjem oksidativnog oštećenja i apoptoze.Heliyon, 2024;10(13):e33996.

Li M, Song J, Tang X, et al. Kritična uloga PAI-1 u akutnoj ozljedi pluća izazvanoj lipopolisaharidom.Adv Med Sci, 2024;69(1):90-102.

Jiang T, Yuan D, Wang R, et al. Ehinakozid, obećavajući inhibitor sortaze A, u kombinaciji sa vankomicinom protiv mišjih modela pneumonije izazvane MRSA.Med Microbiol Immunol, 2023;212(6):421-35.

Yang Y, Liu Y, Wang Y, et al. Regulacija SIRT1 i njegova uloga u upali.Front Immunol, 2022;13(1):831168-83.

Jiang Z, Jiang Y, Fan J, et al. Inhibicija cGAS-a ublažava akutnu ozljedu pluća izazvanu nanočesticama cink oksida.Toxicol Lett, 2023;373(1):62-75.

Domizio JD, Gulen MF, Saidoune F, et al. Put cGAS-STING pokreće imunopatologiju IFN tipa I kod COVID-19.Priroda, 2022;603(7899):145-51.

Messaoud-nacer Y, Culerier E, Rose S, et al. STING agonist diABZI izaziva PANoptozu i DNK posredovan sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS).Cell Death Dis, 2022;13(3):269-85.

Wen J, Qin S, Li Y, et al. Flavonoidi dobijeni iz sladića suzbijaju LPS-indukovanu akutnu ozljedu pluća kod miševa inhibiranjem cGAS-STING signalnog puta.Food Chem Toxicol, 2023;175(1):113732.

 

O proizvođaču ekstrakta Cistanche (肉苁蓉) (za programere proizvoda)

Za timove koji istražujuCistanche-basedrazvoj prirodnih sastojaka - posebno standardizovani ekstrakti pozicionirani okoloechinacoside-pozadina proizvođača i informacije o mogućnostima možete pronaći ovdje:
https://www.xjcistanche.com/about-us