Izraziti receptori slični Toll-u Ekspresija gena i glialni odgovor u različitim regijama mozga prirodnog scrapie-a, 2. dio

2.2. Neuropatološke karakteristike hipokampusa ovaca prirodno zaraženih serapijom

Kod ovaca zaraženih scrapie i kontrolnih ovaca, četiri sljedeća hipokampalna područja su detaljnije ispitana na sve patološke markere: piramidalni slojevi ćelija CA1, CA3 i CA4 i SLM (Slika 3).

Nedavne studije su pokazale da piramidalni sloj ćelija igra važnu ulogu u pamćenju. Piramidalni stanični sloj je neuronski u mozgu koji je uglavnom odgovoran za percepciju vanjskog okruženja i skladištenje memorije.

Tokom učenja i pamćenja, sloj piramidalnih ćelija oslobađa neke neurotransmitere, koji mogu stimulirati komunikaciju između neurona, čime se poboljšava skladištenje i vraćanje memorije. Osim toga, sloj piramidalnih ćelija također može pregledati i integrirati informacije u proces učenja i pamćenja, pomažući nam da brzo savladamo nova znanja i vještine.

Studije su također otkrile da funkcija i zdravlje sloja piramidalnih stanica imaju veliki utjecaj na performanse pamćenja. Ako je sloj piramidalnih ćelija oštećen ili pod jakim stresom, pamćenje može biti jako pogođeno. Stoga moramo obratiti pažnju na zdravlje i održavanje sloja piramidalnih stanica kako bismo održali dobre sposobnosti učenja i pamćenja.

Preporuke za zdravlje i održavanje sloja piramidalnih ćelija uključuju dijetu, vježbanje i san. Na primjer, ishrana bogata masnim kiselinama i antioksidansima može pomoći u promicanju zdravlja piramidalnog staničnog sloja; redovno vježbanje može poboljšati funkciju i otpornost nervnog sistema; i dobre navike spavanja mogu pomoći u smanjenju stresa na sloju piramidalnih stanica i promovirati konsolidaciju i vraćanje pamćenja.

Ukratko, piramidalni sloj ćelija igra važnu ulogu u učenju i pamćenju. Trebamo obratiti pažnju na zdravlje i održavanje sloja piramidalnih stanica kako bismo poboljšali naše sposobnosti učenja i pamćenja.

Kliknite Znaj kratkoročno pamćenje kako poboljšati

Istovremeno, treba izbjegavati pretjerani umor i stres, omogućiti mozgu adekvatan odmor i vrijeme oporavka, te omogućiti da se naše pamćenje kontinuirano poboljšava i usavršava.

Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer ima antioksidativne, protuupalne i anti-age efekte, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime se štiti zdravlje nervnog sistema. Osim toga, Cistanche također može promovirati rast i popravak nervnih ćelija, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronske mreže.

Ovi efekti mogu pomoći u poboljšanju pamćenja, sposobnosti učenja i brzine razmišljanja, a također mogu spriječiti pojavu kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

Slika 3. Distribucija neuropatoloških lezija (HE), taloženja PrPSc, astroglioze (GFAP) i mikroglioze (Iba1), u četiri različite regije hipokampusa kod ovce inficirane scrapie i kontrolnih ovaca: slojevi piramidalnih ćelija CornuAmmonis (CA) 1, 3 i 4 , i stratum lacunosum-moleculare (SLM).

Grafikoni prikazuju polukvantitativne vrijednosti procjene za svaki analizirani parametar. (A) Uočene su blage spongiformne promjene u svim analiziranim regijama hipokampusa. (B) Intraneuronski PrPSc uzorak (L42) u CA1, CA3 i CA4 i široko rasprostranjeni fino granularni PrPSc uzorak u SLM. (C) Povećano bojenje Iba1 kod ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolne ovce.

Uvećane slike pokazuju neke od uočenih morfoloških razlika. (D) Znaci umjerene reaktivne astroglioze kod ovaca zaraženih scrapie u usporedbi s kontrolama. Rezultati se kreću od 0 (negativno) do 5 (maksimalni intenzitet).

Značajne razlike su utvrđene korišćenjem Studentovog t-testa ili Mann-Whitney U testa za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno. * p < 0.05, ** p < 0.01. Skala bar=200 µm.

Spongioza u hipokampusu bila je vrlo blaga, a povremene vakuole su uočene u CA1, CA3 i CA4 i SLM (Slika 3A). Ovaj ograničeni gubitak neurona bio je u suprotnosti sa rijetkim, ali žarišno intenzivnim taloženjem PrPSc u CA1 i CA3 (slika 3B).

Uočeno je vrlo blago PrPSc bojenje u CA4 i SLM. U ovim područjima mozga uočeni su različiti obrasci PrPSc (Slika S2). Dok su intraneuronski i PrPSc obrasci povezani s neuropilom prevladavali u CA1 i CA3, intraglijalna depozicija je bila glavni morfološki obrazac uočen u SLM.

Blagi intraneuronski i PrPSc obrasci povezani s neuropilom konzistentno su uočeni u CA4, iako je intenzitet bio niži od onog uočenog u CA1 i CA3. Iba1 je bio konstitutivno izražen i slabo raspoređen u kontrolnim uzorcima. Uz kontrast, izražena mikroglioza je uočena u CA1, CA3 i CA4 i SLM kod ovaca zaraženih scrapie.

Međutim, mikroglijalne morfološke karakteristike značajno su se razlikovale između ovih regija mozga. U piramidalnom sloju CA1 većina mikroglijalnih ćelija pokazala je kratke procese sa uvećanim ćelijskim tijelima, karakterističnim za hipertrofičnu morfologiju.

U CA4, mikroglijalne ćelije su takođe bile hipertrofične, ali su pokazivale duže i tanje grane od CA1 mikroglijalnih ćelija. U međuvremenu, hipertrofična mikroglija u SLM-u pokazala je kratke i tanke procese s natečenim ćelijskim tijelima. Nasuprot tome, u CA3 smo uočili gore spomenutu morfologiju štapića i mikroglije [42].

Ove mikroglijalne ćelije imale su izdužena ćelijska tela, sa dugim paralelnim primarnim procesom orijentisanim okomito na sloj piramidalne ćelije CA3, i pomoćnim granama koje su bile kraće od dugih primarnih procesa.

GFAP imunobojenje je značajno povećano u slojevima piramidalnih ćelija CA1 i CA3 kod ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolnu ovcu. Zanimljivo je da su PrPSc rezultati bili najviši u CA1 i CA3. Nisu uočene razlike u CA4 piramidalnom ćelijskom sloju ili SLM.

2.3. Neuropatologija miševa inficiranih scrapie tg338

Isti neuropatološki markeri spongioze, taloženja PrPSc, mikroglioze i astroglioze analizirani kod ovaca ispitani su u talamusu klinički pogođenih miševa tg338 koji su intracerebralno inficirani scrapieom (Slika 4).

U poređenju sa kontrolama, uočene su značajne razlike (p < 0.05) u spongiozi kod talamusa miševa inficiranih scrapie, kod kojih su vakuole bile ograničene na neuropil.

PrPSc depoziti bili su široko rasprostranjeni na nivou citoplazme i neuropila. Procjena glioze otkrila je značajne razlike u imunobojanju Iba1 i GFAP između miševa inficiranih scrapie i kontrolnih miševa, pri čemu i astrociti i mikroglija pokazuju hipertrofičnu morfologiju.

Akumulaciju PrPres-a je također procijenio WB kod svih miševa inficiranih scrapie-om, otkrivajući konstantan uzorak trake od 19 kDa (Slika 5). Intenzitet PrPres signala kod tg338 miševa bio je homogeniji među pojedincima nego kod ovaca, kao što se očekivalo za eksperimentalnu infekciju u kojoj su kontrolirani doza, starost inokulacije i vrijeme žrtvovanja.

Kod kontrolnih miševa inokuliranih normalnim moždanim homogenatom nije otkriven signal, što se ne slaže s negativnim IHC rezultatima.

Slika 4. Isječci talamusa kod kontrolnih miševa inficiranih scrapie (intracerebralna inokulacija) i tg338 kontrolnog miša prilagođenog starosti, imuno obojeni za procjenu spongioze (hematoksilin-eozin), taloženja PrPSc (R486 antitijela), astrocita (glijalni fibrilarni kiseli protein; GFAP), i GFAP. -vezujući adapter molekul-1; (A, E) Teške spongiformne lezije locirane uglavnom u neuropilu kod miševa inficiranih scrapie u odnosu na kontrolne miševe. (B, F) Nekoliko PrPSc-pozitivnih neurona je evidentno kod miševa inficiranih scrapie, ali ih nema u kontrolama. (C, G) Aktivirana mikroglija koja pokazuje intenzivnije imunološko bojenje i guste procese kod miševa inficiranih scrapie u odnosu na kontrole. (D, H) Povećana astroglioza s hipertrofičnim ćelijskim tijelima i procesima kod miševa inficiranih scrapie u odnosu na kontrole. Rezultati se kreću od 0(negativno) do 5 (maksimalni intenzitet).

Značajne razlike su utvrđene korištenjem Studentovog t-testora Mann–Whitney U testa za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno. * p < 0.05,** p < 0.01. Skala bar=200 µm.

Slika 5. Western blot detekcija akumulacije PrPres u CNS-u klinički pogođenih tg338 miševa intracerebralno inokuliranih scrapie u poređenju sa odgovarajućim kontrolama.

Ekvivalentne količine proteina su napunjene radi adekvatnog poređenja i imunoblotovi su rađeni korištenjem SHA31 monoklonalnog antitijela. Markeri molekularne težine (kDa) su naznačeni na lijevoj strani imunoblota.

Povećana regulacija ekspresije TLR kao odgovor na Prpsc je ranije prijavljena u eksperimentalnim in vivo i in vitro uslovima, stoga smo, nakon karakterizacije prisustva glavnih neuropatoloških promjena izazvanih prionima u CNS-u u kontekstu prirodne i eksperimentalne bolesti, istražili da li su ove promjene u korelaciji sa promjenama u ekspresiji TLR gena.

U tu svrhu, izveli smo qPCR koristeći uzorke iz četiri regiona mozga ovaca da procenimo ekspresiju MyD8g i Trif, dva glavna adapterska proteina uključena u TLR signalizaciju; CD36, receptor za čišćenje koji sarađuje sa TLR; i TLR mRNA.

Osim toga, izmjerili smo nivoe četiri pro- i anti-. inflamatornih citokina u talamusu i hipokampusu ovaca za dalju procjenu upalnog odgovora. Kod tg338 miševa izmjerili smo nivoe mRNA MyD88 i TLR1-9 u talamusu.

Geni za koje su uočene značajne razlike u pogledu kontrola, i odgovarajuće promjene nabora, prikazani su u Tabeli $l, a vrijednosti ACt iz kontrolne i scrapie-inficirane ovce prikazane su na slici $3.

Broj izmijenjenih gena se smanjio u kaudalno-rostralnom smjeru. Oblongata medulla kod ovaca zaraženih scrapie je regija u kojoj su uočene najveće promjene u ekspresiji TLR gena (Slika 6). U ovoj regiji, ekspresija TLR2, 3, 4, 6,7, 8, 9 i CD36 bila je značajno viša (p < 0.01) kod životinja zaraženih scrapie u odnosu na kontrolne životinje.
U talamusu, TLR6, MyD88 i CD36 su bili značajno povećani u grupi zaraženoj scrapie (p < 0.05), dok su TLR2 i TLR3 pokazali tendenciju ka povećanju regulacije (p < {{12} }.1). U frontalnom korteksu (najviše rostralno područje), TLR4 i CD36 su bili jedini prekomjerno eksprimirani geni (p < 0,05).

Zanimljivo je da su kontrastni obrasci ekspresije pronađeni u hipokampusu ovaca zaraženih scrapie-om, kod kojih su TLR2 i MyD88 bili smanjeni (p < 0.01) i TLR1 je pokazao tendenciju smanjenja (p < 0,1) .

Osim toga, hipokampus je bio jedino područje u kojem ekspresija CD36 nije povećana. Sve u svemu, TLR4 je bio gen koji je bio najviše reguliran kod ovaca inficiranih scrapie u odnosu na kontrolne ovce u sva četiri regiona mozga, iako nisu uočene značajne razlike u talamusu ili hipokampusu zbog intra-individualne varijabilnosti.

Analiza nivoa citokina otkrila je prekomjernu ekspresiju TGF-, IL-10 i IL-6 u talamusu kod ovce zaražene scrapie u odnosu na kontrolnu ovcu, ali bez promjena u hipokampusu (Slika 7).

Slika 6. Ekspresija gena TLR 1-10, MyD88, Trif i CD36 u produženoj moždini (A), talamusu (B), frontalnom korteksu (C) i hipokampusu (D) kontrolne i scrapie inficirane ovce .

Podaci su predstavljeni kao srednji broj ± SEM povećanje za kontrolne ovce (izraženo kao rezultat od 1). Prosječni rezultati su upoređeni korištenjem Studentovog t-testa ili Mann-Whitney U testa za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0.01.

Slika 7. Ekspresija gena protuupalnih citokina TGF- i IL-10, i proinflamatornih citokina TNF- i IL-6, u talamusu (A) i hipokampusu (B) kontrolnog i prirodnog scrapia -zaražene ovce.

Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM promjena puta u odnosu na kontrole (izražena kao rezultat 1). Srednji rezultati su upoređeni korišćenjem Studentovog t-testa ili Mann–Whitney U testa za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno. * p < 0.

Da bi se ispitalo da li su promjene u ekspresiji TLR u CNS-u u prirodnoj bolesti uporedive sa onima izazvanim u modelu miša tg338 nakon intracerebralne infekcije scrapie-om, procijenjeni su nivoi transkripcije TLR-a i MyD88 u talamusu miševa oftg338 (Slika 8). Nivoi TLR1 i TLR2 mRNA su značajno povećani (p < 0.01) u poređenju sa kontrolama, a postojala je i tendencija ka povećanju regulacije TLR7 (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Slika 8. Ekspresija gena TLR1-7, TLR9 i MyD88 u talamusu klinički zahvaćenih miševa tg338 intracerebralno inokuliranih inokulumom pozitivnim na scrapie u odnosu na kontrolu (scrapie-negativeinoculum). Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM putanja promjena u odnosu na kontrole (izražena kao rezultat 1). Prosječni rezultati su upoređeni korištenjem Studentovog t-testa ili Mann-Whitney U testa za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno. # p < {{10}}.1, ** p < 0.01.

2.5. Procjena nivoa TLR4 proteina potvrđuje povećanje regulacije otkriveno qPCR-om kod ovaca zaraženih scrapie-om

Da bi se potvrdilo da se uočeno povećanje mRNA TLR4 prevodi u promjene u nivou proteina, TLR4 je procijenjen od strane WB u produženoj moždini, talamusu, hipokampusu i frontalnom korteksu četiri ovce zaražene scrapie i četiri kontrolne ovce (Slika 9).

U skladu sa rezultatima qPCR-a, nivoi proteina TLR4 su značajno povećani (p < 0.05) u sva četiri regiona mozga ovaca zaraženih scrapie-om.

Slika 9. Ekspresija TLR4 proteina u produženoj moždini (Mo), talamusu (Th), hipokampusu (Hc) i frontalnom korteksu (Fc) ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolnu ovcu (n=4 po grupi). -aktin je korišten kao kontrola opterećenja.

Grafikon prikazuje vrijednosti denzitometrije i ukazuje na značajno povećanje ekspresije TLR4 u svim regijama kod ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolne ovce. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Prosječni rezultati su upoređeni korištenjem Studentovog t-testa. * p < 0.05.

3. Diskusija

Posljednjih godina, proučavanje neuroinflamatornog odgovora kod prionskih bolesti dovelo je do boljeg razumijevanja temeljnih mehanizama i posljedica.

Neuroinflamacija uključuje reaktivnu mikrogliozu i astrogliozu [43], a obje se mogu otkriti prije pojave kliničkih znakova i prethode spongiozi i gubitku neurona [7,8,18].

Ostaje pitanje da li je mikroglijalna aktivacija kod prionskih bolesti korisna ili štetna. Neki autori tvrde da mikroglijalna aktivacija i proliferacija doprinose neuroinflamatornom procesu i posljedičnoj neurodegeneraciji [8,18,44].

Međutim, drugi ukazuju na ukupnu zaštitnu ulogu mikroglije, a in vitro studije pokazuju da mikroglija može internalizirati i razgraditi PrPSc [27,45]. U skladu s ovim nalazima, in vivo eksperimenti su pokazali da deplecija mikroglija smanjuje period preživljavanja, vjerovatno zbog smanjenog klirensa PrPSc [46,47].

Stoga je moguće da postoji više reaktivnih mikroglijalnih fenotipova tokom procesa bolesti, ispoljavajući neuroprotektivni efekat u ranim stadijumima bolesti i, kako bolest napreduje, ustupajući mjesto proinflamatornom fenotipu koji izaziva štetne efekte [9,10]. Jedna hipoteza predlaže da TLR signalizacija posreduje u aktivaciji glijalnih ćelija kod prionskih bolesti.

Poznato je da je unos amiloidnih vlakana mikrogijom kod Alchajmerove bolesti podstaknut TLR aktivacijom [48,49]. Stoga, dok aktivacija TLR-a na glijalnim stanicama može igrati ulogu u uklanjanju agregiranih ili abnormalnih proteina (npr. prionski protein), kronična aktivacija može biti štetna za domaćina, što dovodi do neurotoksičnosti i smrti neuronskih stanica [50].

Do danas su podaci o ulozi TLR-a u prionpatogenezi vrlo ograničeni. Nekoliko studija je mjerilo promjene u ekspresiji TLR u CNS-u na mišjim modelima, a jedna je prijavila promjene u ekspresiji TLR u krvi jagnjadi, pri čemu su u svim slučajevima korištene životinje eksperimentalno zaražene prionskom bolešću [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com