Dijetalni kakao flavanoli poboljšavaju mitohondrijalnu funkciju u skeletnim mišićima i modificiraju metabolizam cijelog tijela kod zdravih miševa

za više informacija kontaktirajte:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Mitohondrijska disfunkcija se često javlja kod raznih bolesti i doprinosi njihovoj patogenezi. Procijenili smo efekatkakao flavanoladodatak na mitohondrijalnu funkciju i cjelokupni metabolizam, te smo istražili da li je mitohondrijska deacetilaza sirtuin-3 (Sirt3) uključena ili ne. Istražili smo efekte 15 dana suplementacije CF kod divljeg tipa i Sirt3-/miševa. Metabolizam u cijelom tijelu je procijenjen indirektnom kalorimetrijom, a urađen je oralni test tolerancije glukoze da bi se procijenilometabolizam glukoze. Mitohondrijska respiratorna funkcija je procijenjena u permeabiliziranim vlaknima i kvantificiran je sadržaj piridin nukleotida (NAD plus i NADH). Kod divljeg tipa, suplementacija CF značajno je modificirala metabolizam cijelog tijela promicanjem upotrebe ugljikohidrata i poboljšanom tolerancijom na glukozu. Suplementacija CF-om izazvala je značajno povećanje mitohondrijalne mase, dok je došlo do značajne kvalitativne adaptacije za održavanje proizvodnje H2O2 i ćelijskog oksidativnog stresa. Dodatak CF-u doveo je do značajnog povećanja sadržaja NAD plus i NADH. Svi gore navedeni efekti su otupljeni kod Sirt3-7 miševa. Zajedno, suplementacija CF-om je pojačala metabolizam NAD koji stimulira metabolizam sirtuina i poboljšala mitohondrijalnu funkciju, što je vjerovatno doprinijelo uočenoj adaptaciji metabolizma cijelog tijela, uz veću sposobnost korištenja ugljikohidrata, barem djelomično kroz Sirt3.

Ključne riječi: kakao flavanoli; NAD metabolizam; mitohondrijalna masa; metabolizam glukoze; skeletnog mišića

kliknite da biste dobili više informacija

1. Uvod

Mitohondrije su subćelijske organele koje su uključene u višestruke ćelijske funkcije, kao što je transdukcija energije kroz mitohondrijsku oksidativnu fosforilaciju i u mitohondrijskoj proizvodnji vodikovog peroksida ili mitohondrijalno posredovanoj aktivaciji ćelijske smrti [1-3]. Novi dokazi sugeriraju da je mitohondrijska disfunkcija uključena u mnoge patologije i igra središnju ulogu u njihovoj patogenezi [4]. Naša grupa je prijavila oštećenje mitohondrija kod pacijenata sa dijabetesom tipa 1 mnogo prije kliničkih komplikacija [5]. Štaviše, smanjenje mitohondrijalnog oksidativnog kapaciteta javlja se sa starenjem čak i kod zdravih ljudi [6]. Stoga su identifikacije strategija za ublažavanje ovih disfunkcija ili povećanje mitohondrijalne mase prilike za prevenciju ili barem smanjenje učestalosti mnogih poremećaja ili povećanje aerobnog kapaciteta zdravih subjekata.

U ovom kontekstu, od interesa je identifikacija sigurnih i prirodnih spojeva koji poboljšavaju funkciju mitohondrija i metabolizam cijelog tijela sa ili bez ograničenih nuspojava. Među prirodnim jedinjenjima,kakao flavanola(CF) se smatraju obećavajućim molekulima jer se pokazalo da njihova potrošnja pozitivno utječe na kardiovaskularno zdravlje, otpornost na inzulin ili imunološku funkciju [7]. Zaista, pokazalo se da CF poboljšava metabolizam glukoze, a kratkotrajna primjena CF je praćena povećanjem osjetljivosti na inzulin, čak i kod hipertenzivnih pacijenata koji ne podnose glukozu [8,9].

Među flavanolima, (-)-epikatehin (EPI) je najčešće pronađen monomer u CF, a EPI se smatra glavnim bioraspoloživim i bioaktivnim molekulom CF [10]. Konzistentan skup dokaza ukazuje da suplementacija EPI poboljšava funkciju mitohondrija i/ili sadržaj u skeletnim mišićima [11]. EPI suplementacija stimuliše višestruke puteve koji konvergiraju na gama koaktivator receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma 1-alfa(PGCl) i glavne nuklearne transkripcijske komplekse. EPI direktno pojačava stvaranje dušikovog oksida, koji stimulira mitohondrijalnu biogenezu [11]. Istovremeno, sirtuini 1 i 3 su takođe stimulisani suplementacijom EPI [11]. Upotreba proantocijanidina, oligomernihflavonoidikoji sadrže EPI, pokazalo se da povećavaju intracelularne nivoe nikotinamid adenin dinukleotida (NAD plus ) kroz povećanje nekoliko prekursora za biosintezu NAD i regulišu nivoe sirtuin{0}} mRNA u jetri štakora [12]. Porodica sirtuina (Sirt), NAD-ovisna deacetilaza, sastoji se od sedam članova koji se razlikuju po svojoj subćelijskoj distribuciji, specifičnosti supstrata i ćelijskim funkcijama [13]. Sirt1, opširno proučavan član ove porodice, stimuliše mitohondrijalnu biogenezu promovišući deacetilaciju PGCl, čime se povećava njegova transkripciona aktivnost [14]. Sirte, ključni metabolički senzor, stimuliran je nakon primjene EPI [12,15-17]. Međutim, uticaj EPI na druge sirtuine nije istražen. Procjena efekta EPI bit će posebno zanimljiva na sirtuinima koji se nalaze unutar mitohondrija (Sirt3, Sirt 4 i Sirt5), za koje je poznato da moduliraju aktivnost Krebsovog ciklusa i enzima respiratornog lanca [18]. Sirt3, koji je visoko eksprimiran u tkivima s visokim metaboličkim prometom i sadržajem mitohondrija, je od posebnog interesa s obzirom na njegovu kritičnu ulogu u održavanju normalne mitohondrijalne funkcije kroz reverzibilnu deacetilaciju proteina lizina [19-21] Štaviše, Sirt3 igra važnu ulogu u regulacija metabolizma cijelog tijela [20. Pokazalo se da je Sirt3 izmijenjen u skeletnim mišićima modela dijabetesa tipa 1 i tipa 2 i kardiovaskularnih bolesti [22,23]. Nadalje, sugerirano je da bi aktivacija Sirt3 mogla predstavljati obećavajuću terapijsku strategiju za poboljšanje mitohondrijalne funkcije i metabolizma [23,24]. Stoga je od interesa određivanje da li Sirt3 leži u osnovi korisnih efekata suplementacije CF na metabolizam cijelog tijela i funkciju mitohondrija.

U ovoj studiji, koristili smo integrativni pristup da istražimo, na miševima, efekat suplementacije CF 15- dana. Pretpostavili smo da bi suplementacija CF: (i) modificirala metabolizam cijelog tijela imetabolizam glukoze, (ii) povećava mitohondrijalnu funkciju u oksidativnim i glikolitičkim mišićima u permeabiliziranim vlaknima i (ii) pojačava metabolizam NAD. Također smo istražili navodnu uključenost Sirt3 u mitohondrijalnu biogenezu izazvanu CF i metabolizam cijelog tijela. Naše hipoteze su bile da bi efekti CF-a na metabolizam cijelog tijela i mitohondrijalnu masu bili prigušeni kod Sirt3-7 miševa.

2. Metode

2.1. Životinje i ishrana

Za ovu studiju, 129S1/SvlmJ 10-sedmično stari mužjaci miševa kupljeni su od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, SAD). Da bismo utvrdili da li su sirtuini uključeni u prilagodbu mitohondrijalne mase i funkcije izazvanu primjenom CF, također smo koristili 10-sedmično stare Sirt3 nokautirane mužjake miševa na istom soju kao i divlji tip [25]. Sirt3/miševi su korišteni za istraživanje uključenosti Sirt3 u mitohondrijalnu biogenezu izazvanu CF i adaptacije metabolizma cijelog tijela. Miševi su držani u prostoriji na regulisanoj temperaturi od 23-25 stepeni i kontrolisanom osvjetljenju (12-h svjetlosni i tamni ciklusi). Životinje su imale pristup hrani za glodare i vodi iz slavine ad libitum.

Nakon najmanje nedelju dana navikavanja u objektu za životinje, eksperimentalne životinje su dobile suplementaciju CF oralnom sondom prirodnog ekstrakta (302,1 mg/kg telesne težine dva puta dnevno tokom 15 dana) resuspendovanog u karboksimetilcelulozi (Sigma-Aldrich, St. Louis). , Mo, SAD). Sastav kakao praha je opisan u tabeli 1 i dobijen je od Naturex-a (Quart de Poblet, Španija). Sastav je utvrđen metodom tečne hromatografije visokih performansi i 100 mg ekstrakta je ekvivalentno prosječno 475 mg suhih sjemenki kakaa. Kontrolni miševi su oralnom sondom primili vehikulum sastavljen od sličnog sadržaja teobromina i kofeina otopljenog u karboksimetilcelulozi. Dnevna doza je određena prema smjernicama industrije koje pretvaraju dozu za ljude u doze ekvivalentne životinjama na osnovu površine tijela, a mi smo pomnožili dozu za ljude sa 12,3 [26]. Oralnu sondu je obavio iskusni tehničar.

2.2. Sakupljanje tkiva1

Dvadeset četiri sata nakon posljednje oralne sonde, životinje koje nisu bile natašte su anestezirane ketaminom i ksilazinom (respektivno: 100 i 10 mg/kg). Sakupljanje tkiva je obavljeno odmah nakon postignute anestezije. Izrezan je soleus i bijeli dio gastrocnemiusa. Uzorci su ili odmah zamrznuti u tečnom azotu i pohranjeni na -80 stepenu za naknadnu analizu ili korišćeni za pripremu mišićnih vlakana sa kožom.

2.3. Procjene metabolizma i fizičke aktivnosti

Indirektna kalorimetrija i spontana fizička aktivnost mjereni su korištenjem Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Miševi su smješteni pojedinačno u komore na 28 stepeni, sa svjetlom od 07h00 do 19h00 i ad libitum pristupom hrani za glodare i vodi iz slavine. Miševi su se aklimatizirali na metaboličke kaveze tri dana prije prvog dana prikupljanja podataka. Prikupljanje podataka obavljeno je petnaestog dana suplementacije. Potrošnja kiseonika (VO2), proizvodnja ugljen-dioksida (VCO2) i omjer disajne izmjene (RER) izmjereni su sa protokom zraka od 0.5 L/min i uzorkom zraka od 0.4 L/ min. Procenat relativne kumulativne frekvencije (PCRF) RER-a je određen tokom perioda od 24-h kao što su ranije opisali Riachi et al. (20{29}}4). Ukratko, PCRF je određen dodavanjem frekvencije svake tačke podataka prethodnoj sekvenci inkrementa (od 0,65 do 1,20 sa prirastom od 0,01)[27]. Metabolička fleksibilnost određena je nagibom nagiba (H vrijednost) i 50. percentilom (EC50) PRCF krive i mjerenjem RER amplitude tokom 24 h (Riachi et al. 2004). Opća fizička aktivnost je praćena korištenjem senzorskog sistema upravljanog infracrvenim snopom koji je detektirao aktivnost po x i z osi. Procijenjeni su i ukupni broj (svaki put kada se greda pokvari) i ambulantni broj (svaki put kada se pokvari nova greda). Ukupni X (X-TOT) broj se registruje kada se životinja pomiče horizontalno više od 0,5 in i predstavlja manje aktivnosti koje se ponavljaju, kao što su grebanje i njegovanje. X-ambulatorno brojanje (X-AMB) mjeri stvarnu lokomociju tako što registruje broj samo kada životinja prekine novi snop. Z-totalni (Z-TOT) broj se registruje kada dođe do 1,5 inča vertikalnog pomeranja, tj. uzgoja (Abreu-Vieira 2016). Za procjenu ugljikohidrata i mastioksidacijaod VO2 i VCO2, koristili smo tablicu neproteinskih respiratornih kvocijenata od Péronnet-a i Massicottea koja je prethodno korištena kod miševa [28,29].

2.4. Ukupna tjelesna i masna masa

Ukupna masa masti i ukupna nemasna masa određivani su kod neanesteziranih miševa kvantitativnom analizom interferencije rezonance pomoću EchoMRI analizatora magnetne rezonance cijelog tijela (Echo Medical System, Houston, TX, SAD). Ukupna masna masa predstavlja zbir svih masti u tijelu. Ukupna čista masa uključuje uglavnom mišiće i unutrašnje organe. Poznato je da skeletna mišićna masa čini najveći dio ukupne čiste mase.

2.5. Oralni test tolerancije glukoze (OGTT)

Glikemija je mjerena pomoću kapi krvi sakupljene iz repa glukometrom (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT je izveden na miševima koji su gladovali 5 do 6 sati. Mjerenje je obavljeno posljednjeg dana suplementacije CF. Nakon mjerenja bazalne glikemije (vrijeme O), miševima je per os ubrizgan rastvor od 20 posto glukoze u sterilnoj vodi u dozi od 1,5 g glukoze·kg tjelesne težine-1. Glikemija je mjerena 15, 30, 60, 90 i 120 minuta nakon injekcije otopine glukoze. Zatim je izračunata inkrementalna površina krivulje glukoze kao mjera tolerancije glukoze.

2.6.qRT-PCR analiza

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA je sintetizirana iz ukupne RNK (2 μL) korištenjem iScript supermiksa za reverznu transkripciju za RT-qPCR (Biorad, Hercules, Kalifornija, SAD). Ukupni RT proizvodi su analizirani kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze (PCR) upotrebom 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG prema specifikacijama proizvođača (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Bicikliranje je postignuto u CFX96 biciklistu (Biorad, Hercules, Kalifornija; uslovi: 95 stepeni C za 10 min i 40 ciklusa od 95 stepeni za 30 s, 55 stepeni za 45 s i 72 stepena za 45 s). Na kraju svake serije, odsustvo formiranja prajmer-dimera i prisustvo jedinstvenog amplikona potvrđeno je pomoću krivulje topljenja. Vrijednosti praga ciklusa (Ct) korištene su slijedeći 2-A△Ct metod za analizu qPCR podataka, sa ili ß-Actin ili HPRT1 kao genom za održavanje kućanstva【30】. Kvantitativne RT-PCR vrijednosti bile su povezane s onima iz kontrolne grupe, koje su bile postavljene na 1.

2.7. Enzimske aktivnosti

Mjerenje specifične aktivnosti kompleksa lanca transporta elektrona i citrat sintaze izvedeno je spektrofotometrijski kao što je prethodno opisano [31]. Smrznuti bijeli gastrocnemius mišići (~30 mg) homogenizirani su homogenizatorom vibrirajućih mikrozrna u 500 uL pufera za homogenizaciju (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 5 mg B·mL-I , pH7,4) nakon čega slijedi dodavanje 500 μL hipotonične podloge (25 mM kalijum fosfata i 5 mM MgCl, pH 7,2). Uzorci su zatim podvrgnuti tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja u tečnom azotu. Uzorci su centrifugirani 10 minuta na 600×g na 4 stepena, a supernatant je držan na ledu do analize. Sadržaj proteina je određen u supernatantu u tri primjerka koristeći Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, SAD).

Aktivnost citrat sintaze (CS) određena je spektrofotometrijski na 412 nm nakon redukcije 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzojeve kiseline) u prisustvu 0.1 mM acetila -CoA i 12 mM oksalosirćetne kiseline u 200 mM Tris puferu (pH 7,4). Test NADH-decylubikinon oksidoreduktaze (kompleks I) osjetljiv na rotenon izveden je na 340 nm koristeći akceptor 2,3-dimetoksi-5-metil-6-n-decyl-14-benzokinon （ 80 μM） i NADH kao donor elektrona (200 μM) u 10 mM Tris puferu (pH 8,0). Dodatak 4 μM rotenona je korišten za kvantifikaciju aktivnosti osjetljive na rotenon. Aktivnost citokrom oksidaze (kompleks IV) izvedena je na 550 nm korištenjem 10 µM redukovanog citokroma c kao donora i 2,5 mM n-dodecil-ß-maltozida da permeabilizira obje mitohondrijalne membrane u 100 mM phosphate70 pufera.

Svi enzimski testovi određeni su u tri primjerka, a rezultati su povezani s onima iz kontrolne grupe, koja je postavljena na 100.

2.8. Mitochondrial Assessment

Mitohondrijalno disanje i proizvodnja mitohondrijalnog H2O2 proučavani su in situ u saponin permeabiliziranim vlaknima pomoću bijelih mišića gastrocnemiusa i soleusa|1]. Ukratko, vlakna su odvojena pod binokularnim mikroskopom u rastvoru A na 4 stepena (u mM:2.77 CaK2 EGTA, 7.23 K, EGTA, 6.56 MgCl2, 20 taurina,0.5 DTT,5{ {50}} K-metan sulfonati, 20 imidazola, 5,7 Na2 ATP i 15 kreatin-fosfat, pH 7,1) i permeabilizirani u rastvoru A sa 50 ug·mL-I saponina 30 minuta na 4 stepena. Mitohondrijalna respiratorna funkcija je određena u oksimetru opremljenom Clark elektrodom (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Komora je napunjena sa 1 mL rastvora B (u mM:2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl,, 20 taurina, 0,5 DTT, 50 K-metan sulfonata i 20 imidazola, nakon snimanja pH 7,1) osnovnog sadržaja kiseonika u komori, jedan snop od 1-2 mg suhe težine permeabiliziranih miofibrea stavljen je u komoru, koja je potom zatvorena. Nakon baznih očitanja, slijedeći dodaci su uzastopno napravljeni: palmitoil karnitin i malat (160 μM∶5 mM), glutamat (10 mM), sukcinat (25 mM), rotenon （0,5 μM anti (0,5 μMnko) -A (8 uM) i N, N', N'-tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorid i askorbat (0,9:9 mM). Respiracija je mjerena na 23 stepena uz kontinuirano miješanje. Na kraju svakog testa, vlakna su pažljivo uklonjena iz ksilografske ćelije, obrisana i sušena najmanje 24 h na ~80°C radi određivanja težine vlakana. Stope potrošnje O2 (JO2) su izražene u nmol O2 min-1.(mg suhe težine)-I. Sva mjerenja su obavljena barem u duplikatu.

Neto oslobađanje H2O2 mitohondrijama koje dišu mjereno je u permeabiliziranim snopovima vlakana sa fluorescentnom sondom Amplex Red (20 μM∶emisija ekscitacije∶563-587 nm), kao što je prethodno opisano [32]. Nakon pripreme permeabiliziranih vlakana, uzorci

namijenjeni za mjerenja H2O2 isprani su tri puta u puferu Z (u mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O i 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7,3 na 4 stepena). Snopovi vlakana ({{20}}.3-1.0 mg suhe težine) su inkubirani na 37 stepeni u kvarcnoj mikrokiveti uz kontinuirano magnetsko miješanje u 600 uL pufera Z (pH 7,3 na 37C) dopunjen sa 1,2 U·mL-I peroksidaze iz hrena. Osnovna očitanja fluorescencije su uzeta u odsustvu egzogenih respiratornih supstrata. Zatim su uzastopno napravljeni sljedeći dodaci: glutamat (5 mM), sukcinat (5 mM), rotenon (0,5 uM), ADP (10 mM) i antimicin-A (8 μM). Na kraju svakog testa, vlakna su bila pažljivo izvaditi iz kivete, umočiti i osušiti kako bi se odredila težina vlakana. Stope proizvodnje H2O2 izražene su u AU·min-1.(mg suve težine)-I i po kapacitetu okfosa koji je odgovarao maksimalnom mitohondrijskom disanju u stanju fosforilacije. Sva mjerenja su obavljena barem u duplikatu.

Kapacitet zadržavanja mitohondrijalnog kalcijuma (CRC) je procijenjen u bijelim gastrocnemius mišićnim ghost vlaknima kao što je prethodno opisano [33]. Ukratko, vlakna su inkubirana u kvarcnoj mikrokiveti uz kontinuirano miješanje u 600 μL CRC pufera （u mM∶250 saharoze, 10 MOPS, 0,005 EGTA i 10P;-Tris, pH7,3). Vlakna su zatim izložena jednom impulsu od 20 nM Ca2 plus. Promjene u ekstramitohondrijskoj koncentraciji kalcija praćene su fluorometrijski korištenjem Calcium green 5N (1 mM: ekscitacija-emisija: 505-535 nm). Osjetljivost pora prelaza permeabilnosti (PTP) procijenjena je mjerenjem vremena potrebnog za otvaranje PTP-a, a CRC je uzet kao ukupna količina Ca' akumuliranog u mitohondrijima prije njegovog oslobađanja. Na kraju svakog testa, vlakna su pažljivo uklonjena iz kivete, obrisana i osušena da bi se odredila težina vlakana. CRC vrijednosti su izražene u nM Ca2 plus po mg suhe težine.

2.9. Western blot analiza

Proteini iz bijelih mišića gastrocnemiusa i soleusa razrijeđeni su u Laemmli puferu i razdvojeni na Mini-PROTEAN TGX bez mrlja 10 posto gotovih poliakrilamidnih gelova (Biorad); interni standard je stavljen na svaki gel. Elektroforetsko odvajanje je urađeno na 200 V tokom 35 minuta u migracionom puferu (25 mM TrisBase,0.2 M glicin, i 1 posto SDS (p/v)). Tehnologija bez mrlja (SF) sadrži vlasnički tri halo spoj koji reaguje s proteinima, čineći ih vidljivim kroz izlaganje UV zračenju. Snimanje SF-a je izvedeno pomoću softvera ChemiDoc MP Imager i Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, Kalifornija, SAD) sa 5-minimalnim vremenom aktivacije mrlje, te su stoga vizualizirani ukupni proteinski obrasci. Proteini su zatim prebačeni na nitrocelulozni list od 0,2 um koristeći Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Kvalitet prijenosa je kontroliran membranama za snimanje pomoću SF tehnologije. Nakon koraka transfera, karbonil proteini su derivatizovani dinitrofenilhidrazinom razblaženim u 2N HCL i na kraju su opsežno isprani metanolom. Membrane su blokirane sa 5% nemasnog suhog mlijeka u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini koja sadrži Tween-20 (TBST:15 mM Tris/HCl, pH7,6,140 mM NaCl i 0,05% Tween-20) za 1 h na sobnoj temperaturi. Membrane su zatim inkubirane na 4 stepena preko noći ili 2 sata na sobnoj temperaturi sa sljedećim primarnim antitijelima: proteinsko karbonil primarno antitijelo (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) i SOD2 (#Ab13533, Abcam). Nakon tri 10-minutna ispiranja u TBST-u, membrane su ispitane sekundarnim antitijelima na protein karbonil (HRP-konjugat;#STA-308, Cell Biolabs) i SOD2 (povezan anti-zečji IgG-HRP;#7074, Cell Signalling) u rastvoru za blokiranje 2 h na sobnoj temperaturi i na kraju su opsežno isprani sa TBST. Razrjeđivanje primarnih i sekundarnih antitijela je optimizirano za svako antitijelo. Detekcija hemiluminiscencije je izvršena pomoću ECL Clarity (Biorad), a snimanje slika je urađeno pomoću ChemiDocMP. Sve slike su analizirane pomoću softvera Image Lab 4.0.1. Normalizacija intenziteta proteinskog signala je izvršena nakon kvantifikacije odgovarajućih ukupnih nivoa proteina na SF slikama, kontroli uzorka i internim standardima.

2.10. NAD Measurement

Ukupni nivoi NAD i NADH mjereni su u homogeniziranom bijelom gastrocnemiusu korištenjem komercijalnog kompleta (#K337-100, Biovision, SAD) i slijedeći uputstva proizvođača. Ukratko, ukupni skup NAD (NADt= NADt i NADH) je ekstrahovan. Za svaki od ekstrahovanih uzoraka, polovina uzorka je zagrevana na 60 stepeni tokom 30 minuta da bi se razgradio NADt, dok je NADH ostao netaknut. I NADt i NADH uzorci su pomiješani sa NAD cikličnim enzimom, a apsorbancija je mjerena na 450 nm. NADt i NADH su kvantificirani poređenjem sa standardnom krivom NADH i normalizacijom na mg proteina. Konačno, izračunat je omjer NAD plus (NADt-NADH) prema NADH. Svi testovi su izvedeni u tri primjerka.

2.11. Statistika

Podaci se prikazuju kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Normalnost podataka je procijenjena korištenjem D'Agostino-Pearsonovog testa normalnosti. Analiza podataka je izvršena korišćenjem Studentovog t-testa i dvosmerne ANOVA (grupa i vreme) za ponovljena merenja, praćena Bonferronijevim post hoc testom korišćenjem Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Dijego, Kalifornija, SAD). Primijenjen je dvostrani nivo od 5 posto za grešku tipa I.

3. Rezultati

3.1. Sastav tijela i metabolizam cijelog tijela

Petnaest dana suplementacije CF kod miševa divljeg tipa (WT) nije promijenilo tjelesnu težinu (p=0.091), nemasnu masu (p=0.{{24} }73)i masnu masu procijenjenu EchoMRI (p=0.89; Slika 1A). Stope potrošnje O2 izražene po nemasnoj masi bile su značajno veće u tamnom ciklusu (8±8 procenata, p=0.042), dok su ostale slične u ciklusu svjetlosti (p =0 .392; Slika 1B.). Nije bilo promjena u lokomotornoj aktivnosti (podaci nisu prikazani). CF miševi su pokazali značajno povećanje potrošnje energije cijelog tijela za 15±15 posto (p =0.042; Slika 1C) iu unos hrane (0,08±0,01 vs.0,11±0,01 g po nemasnoj tjelesnoj masi, respektivno CF grupa i WT, p=0.013, Slika 1D).

Dodatak CF značajno je modificirao metabolizam cijelog tijela: glavni efekat većeg RER-a u grupi sa CF uočen je tokom 24 h (p=0.023, Slika 2A) i srednji RER tokom 12 h je bio veći u CF grupi u ciklusima svjetla i tame ( plus 5±3 procenta ,p=0.035 i plus 9±4 procenta, respektivno, p=0.026). Štaviše, suplementacija CF-om je promovirala upotrebu ugljikohidrata (CHO) (51±13 posto potrošnje energije ovisilo je o oksidaciji CHO u CF grupi naspram 37 ±12 posto u kontrolnoj grupi tokom svjetlosnog ciklusa, p=0.108 i 71±21% u grupi CF naspram 47±24% u kontrolnoj grupi tokom mračnog ciklusa,p=0.004; Slika 2B.). Međutim, kada se izrazi u kJ, nije bilo razlike u oksidaciji CHO niti u oksidaciji masnih kiselina (CHOoksidacija: 3,7±1,4 kcal·d-1 u kontroli naspram 4,4±1,7 kcal. nemasne tjelesne mase-1. d-1 u CF,p=0.33 i oksidacija masnih kiselina: 2,3±1,0 kcal·d-Iin kontrola naspram 2,6±0,87 kcal. nemasne tjelesne mase-1.d{{ 50}}u CF,p=0.608). Analiza PRCF-a RER-a otkrila je povećanje vrijednosti EC50 u CF grupi (p=0,009; Slika 2D) što znači da CF izaziva pomak ka većoj upotrebi ugljenih hidrata. Smanjenje nagiba brda uočeno je u CF grupi (H vrijednosti: 25,16±4,44 u kontrolama naspram 12,79±3,96 u CF grupi, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Mitochondrial Bioenergetics

Testirali smo učinak suplementacije CF na energiju mitohondrija u bijelom gastrocnemius i soleus mišiću kod WT miševa. Uočeno je veće mitohondrijalno disanje korištenjem kompleksnih IV supstrata u bijelim mišićima gastrocnemiusa i soleusa (p=0.004 i p=0.028, respektivno; Slika 3A, B). Nisu uočene modifikacije omjera disanja CII/CI i CIV/CI (p =0.899 i p =0.701 za bijeli gastrocnemius i p=0.693 i p{{ 11}}.912 za mišiće soleusa, respektivno, podaci nisu prikazani). Štaviše, aktivnosti kompleksa, I, IV i citrat sintaze su značajno povećane u bijelom gastrocnemius mišiću (respektivno: plus 31 ± 27 posto ,p=0.004; plus 28 ± 38 posto,p=0 .027; plus 35±38 procenata ,p= 0.009; plus 14±13 procenata,p=0.040;Slika 3C). Sposobnost mitohondrija da oksidiraju palmitoil-karnitin ima tendenciju povećanja u bijeli gastrocnemius ( plus 24±12 posto ,p =0.096; Slika 3D), dok nikakva razlika nije uočena u soleusu (p =0.363). Relativna stopa disanja stimuliranog palmitoil-karnitinom bila je nepromijenjena kada je izražena u funkciji disanja kompleksa I (62±11 u kontrolnoj grupi naspram 64±20 u CF grupi u bijelom gastroknemijusu i 70 ± 18 naspram 72±16 u soleusu). Zatim smo istražili osjetljivost na otvaranje PTP-a izazvano Ca plus u bijelom gastrocnemijusu. Kao što je prikazano na slici 3E, ni vrijeme do otvaranja PTP-a ni kapacitet zadržavanja Ca² nisu modificirani nakon dodavanja CF (p=0.608 i p=0.943, respektivno).

Procjena mRNA gena uključenih u mitohondrijalnu biogenezu pokazala je povećanje regulacije NRF1 mRNA za 70 posto, dok za PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa i Cox2 nije prijavljena razlika (Tabela 3). Istražili smo, na nekoliko uzoraka, efekat suplementacije CF na mitohondrijalne superkomplekse (Slika S1, Dodatni materijali). Denzitometrijska analiza sugerira da suplementacija CF povećava ukupni sadržaj superkompleksa bez kvalitativne adaptacije ili preuređivanja. Zaista, respiratorna gustina je poboljšana za 58 posto korištenjem kompleksnih I i kompleksnihⅡ sondi i za 93 posto korištenjem sonde kompleksa I. Slično, sadržaj kompleksa I i kompleksa III ugrađen u superkomplekse bio je veći u CF grupi.

Dodatak CF smanjuje emisiju ROS mitohondrija. Dok je emisija H2O2 ostala nepromijenjena iu bijelom gastrocnemiusu i soleusu kada je izražena po suhoj težini (Slika 4A, B, respektivno), stope su smanjene kada su izražene po mitohondrijskom sadržaju (Slika 4C). Glavni pozitivan efekat suplementacije CF uočen je u različitim stanjima u bijelom gastroknemijusu (str<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Markeri oksidativnog stresa u skeletnim mišićima

Na nivo ćelijskog proteina oksidativnog stresa kod WT miševa nije uticala suplementacija CF jer je ćelijski sadržaj SOD2 bio sličan u eksperimentalnoj i kontrolnoj grupi u belom gastroknemijusu i soleusu (slika 4E). Štaviše, nije uočena razlika u karbonilaciji proteina u bijelom gastrocnemiusu i soleusu (slika 4F). Dodatno, nije uočena razlika u ekspresiji mRNA katalaze i MnSod nakon dodavanja CF (Tabela 3).

3.4.NAD Metabolizam

Ukupni skup piridin nukleotida se povećao nakon suplementacije CF za 36±33 posto (p=0.012). Konkretno, sadržaj NAD i NADH se povećao u bijelom gastrocnemiusu (respektivno za 69±60 posto, p{{6) }}.026 i 29±42 procenta ,p=0.017;Slika 5A,B)i NAD plus/NADH omjer je imao tendenciju povećanja u CF grupi (p =0.084).Ne značajan efekat je uočen za Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094) i Sirt1 mRNA (p =0.869; Tabela 3 ).

3.5. Odgovor cijelog tijela i ćelijskog metabolizma nakon suplementacije CF kod Sirt3-/ miševa

Ispitivali smo efekat suplementacije CF kod Sirt{{0}} miševa. Tjelesni sastav kao težina, nemasna masa i masna masa nisu se razlikovali između CF i kontrolne grupe (p= 0.52,p=0.66,p=0.45, respektivno; Slika 6A). Slično tome, dnevna potrošnja energije nije bila pod uticajem suplementacije CF ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal.lean body masa-1.dan-1 u kontrolama u odnosu na 0.39 ± 0.01 Kcal·lean body mass-1.dan-1 u CF, p=0.502; Slika 6B). RER je bio sličan između obje grupe u ciklusima svjetla i tame (p=0.301; Slika 6C), a na oksidaciju supstrata nije utjecao dodatak CF (44 ± 17 posto potrošnje energije ovisilo je o CHO oksidaciji u kontrolna grupa naspram 50 ± 11 posto u CF grupi tokom svijetle faze, p=0.209 i 65 ± 19 posto u kontrolnoj grupi naspram 77 ± 21 posto u grupi CF tokom tamne faze, p=0.395; Slika 6D). Metabolička fleksibilnost procijenjena amplitudom RER tokom 24 h ostala je slična između dvije grupe (0,19±0,05 u kontrolnoj naspram 0,20±0,03 u CF,p=0.604), dok je nagib PRCF smanjen u CF grupi (H vrijednosti:17,77±4,38 u kontrolnoj naspram 12,79±3,93 u CF, p=0.039).

Zatim smo uporedili efekat suplementacije CF na aktivnosti mitohondrijalnih enzima. Dodatak CF nije uspio povećati aktivnost enzima kompleksa I,I,IV i CS kod Sirt3-/miševa kao što je ranije uočeno u WT (respektivno: p=0.623,p=0 .629,p=0.283, i p=0.791, Slika 6E). Veća aktivnost enzima kompleksa i IV uočena je u WT u poređenju sa Sirt3-7 miševima nakon suplementacije CF ( redom: p=0.027 i P=0.045)

4. Diskusija

U ovoj studiji pružamo integrativnu analizu efekta ingestije CF. Primijetili smo da je kronično uzimanje CF poboljšalo disanje mitohondrija i smanjilo proizvodnju H2O2, procijenjeno u njihovom okruženju miofibre, dok je osjetljivost na otvaranje PTP-a ostala nepromijenjena. Gutanje CF pojačalo je NAD metabolizam, podržavajući uključivanje sirtuinskih puteva na uočene mitohondrijalne adaptacije. Također smo primijetili promjene metabolizma u cijelom tijelu prema većoj sposobnosti korištenja ugljikohidrata kao glavnog supstrata što sugerira da su mitohondrijalne adaptacije vjerovatno doprinijele uočenoj adaptaciji metabolizma cijelog tijela.

4.1.Metabolizam

Dijetalna primjena kakao flavanola je identificirana kao efikasna strategija za ublažavanje intolerancije na glukozu, omogućavajući mogućnosti za poboljšanje metaboličkih bolesti [34]. Naši rezultati su u skladu sa prethodnim studijama koje su prijavile povećanu toleranciju na glukozu nakon unosa flavanola [35,36]. Mehanizmi predloženi za ovaj efekat uključuju povećanje translokacije GLUT4 prema ćelijskoj membrani, povećanje fosforilacije AMPK i povećanje ekspresije UCP-2 gena u skeletnim mišićima [8,37] . Štaviše, ingestija CF je bila povezana sa poboljšanjem insulinske osetljivosti kod ljudi[8]. Nakon 15 dana konzumacije tamne čokolade, kod zdravih osoba uočeno je smanjenje procjene indeksa inzulinske rezistencije na modelu homeostaze uz povećanje kvantitativnog indeksa inzulinske osjetljivosti i indeksa osjetljivosti na inzulin [8]. Također smo primijetili istovremeni porast tolerancije na glukozu i metaboličke fleksibilnosti kod WT miševa, što se odnosi na sposobnost organizma da prilagodi oksidaciju goriva dostupnosti goriva [38]. Zanimljivo je da su smanjeni oksidativni kapacitet mitohondrija i srodna oksidacija supstrata povezani sa rezistencijom na inzulin 39, trening izdržljivosti povećava sadržaj mitohondrija, osjetljivost na inzulin i metaboličku fleksibilnost [38]. Stoga su sadašnji rezultati specifični za suplementaciju CF i na njih ne utiče spontana aktivnost.

Pozitivan efekat CF na metaboličku fleksibilnost, kao i povećanje aktivnosti mitohondrijalnih kompleksa, umanjili su se kod Sirt3-7 miševa, što ukazuje da se pozitivni efekti CF barem djelimično javljaju kroz Sirt3. Ovi rezultati podržavaju prethodne nalaze i ključnu ulogu Sirt3 u regulaciji metaboličke fleksibilnosti [24]. Naši rezultati sugeriraju da povećanje mitohondrijalne funkcije može poboljšati metaboličku fleksibilnost. Međutim, pored mitohondrijske funkcije, bazalni respiratorni kvocijent, brzina odlaganja glukoze, kapacitet skladištenja lipida masnog tkiva i koncentracija slobodnih masnih kiselina u plazmi također su identificirani kao determinantni faktori metaboličke fleksibilnosti i treba ih uzeti u obzir [40]. Buduće studije bi trebale dublje procijeniti ćelijske determinante metaboličke fleksibilnosti kako bi produbile naše razumijevanje osnovnih uzroka poboljšanja metaboličke fleksibilnosti nakon suplementacije CF.

Procjena metabolizma cijelog tijela otkrila je povećanje relativne oksidacije CHO nakon dodavanja CF. Ovaj rezultat je u suprotnosti s prethodnom studijom koja je izvijestila o povećanju lipolize nakon akutnog uzimanja flavanola ili dvonedjeljne suplementacije flavan{2}}olima kod miševa [36]. Osim razlika u sastavu ekstrakta, ovi kontradiktorni nalazi mogu biti rezultat pleiotropnih efekata NO. Dobro je prihvaćeno da gutanje CF stimuliše proizvodnju ili bioraspoloživost metabolizma NO [7]. S jedne strane, NO stimulira transport i unos glukoze u skeletne mišiće. Stimulacija proizvodnje NO u miotubama iz stanične linije inzulinom ili vodonik peroksidom rezultirala je povećanjem translokacije GLUT4, koja je smanjena inhibicijom nNOS [41]. Štaviše, NO može povećati transport glukoze na putu neovisnom o inzulinu što dovodi do povećanja nivoa cikličnog GMP i AMPK [42], što potiče oksidaciju glukoze u skeletnim mišićima štakora neovisno o dostupnosti i oksidaciji masnih kiselina [43]. S druge strane, NO podstiče oksidaciju masnih kiselina smanjenjem nivoa malonil-CoA putem inhibicije acetil-CoA karboksilaze i aktivacije malonil-CoA dekarboksilaze u skeletnim mišićima[44]. Dok smo uočili pomak prema nižem relativnom udjelu korištenja masne kiseline kao supstrata sa CF, nije bilo razlike u pogledu apsolutnih vrijednosti izraženih u kJ. Ovo sugerira da se povećanje potrošnje energije uočeno uz dodatak CF-a oslanja na povećanje oksidacije glukoze. Stoga, ovi rezultati podržavaju ideju da konzumacija CF povećava osjetljivost na inzulin i potiče oksidaciju glukoze bez popratnog efekta na kapacitet oksidacije masnih kiselina. Ovi rezultati postavljaju pitanje važnosti upotrebe kakao flavanola u kontekstu ishrane bogate mastima. Buduće studije bi trebale procijeniti moguće štetne efekte povezanosti suplementacije CF-om i ishrane bogate mastima.

4.2.Mitohondrijska funkcija

Pokazalo se da ishrana kakao flavanola poboljšava funkciju mitohondrija, uključujući (i) mitohondrijalno disanje i aktivnosti enzima u lancu transporta elektrona; (i) mitohondrijalno oslobađanje H2O2, što odražava proizvodnju mitohondrijalnih reaktivnih vrsta kiseonika (ROS); i (i) mitohondrijalni kapacitet zadržavanja kalcijuma koji odražava podložnost otvaranju prelaznih pora mitohondrijalne permeabilnosti (mPTP) (za pregled vidi [11]. Naši rezultati su u skladu s prethodnim studijama; bez obzira na to, naša studija je bila prva koja je procijenila učinak CF suplementacija na mitohondrijalnu funkciju procijenjena in situ u permeabiliziranim vlaknima i u različitim tipovima mišića Za razliku od prethodnih studija na izolovanim mitohondrijama, procjena mitohondrijalne funkcije u permeabiliziranim vlaknima čuva morfologiju mitohondrija, funkcionalne interakcije s drugim intracelularnim komponentama [1] i izbjegava mitohondrijalnu strukturu poremećaj tokom procesa izolacije mitohondrija [32] Zbog toga je važno proučavati mitohondrijalnu funkciju u preparatima tkiva u kojima je očuvana mitohondrijska struktura, a cijeli mitohondrijski bazen je predstavljen kako bi se bolje procijenio odgovor na tretman.

Prethodne studije sprovedene u kulturi ćelija ili in vivo na miševima pokazale su da suplementacija sa EPI, koji se smatra glavnim bioaktivnim molekulom u CF, povećava maksimalno ADP-stimulisano disanje (npr. stanje 3 disanje) kada se mitohondrije energiziraju kombinacijom energije supstrati koji hrane različita mjesta duž respiratornog lanca [45-49]. U skladu s ovim rezultatima, uočili smo glavni učinak suplementacije CF na mitohondrijalno disanje u oksidativnim i glikolitičkim mišićima. Da bismo utvrdili da li je ovo povećanje povezano s povećanjem mitohondrijalne mase ili remodeliranjem mitohondrijalnih respiratornih kompleksa, procijenili smo mitohondrijske superkomplekse iz mišića kvadricepsa. Smatra se da ove supramolekularne strukture smanjuju proizvodnju ROS, stabilizuju ili pomažu u sklapanju pojedinačnih kompleksa, regulišu aktivnost respiratornog lanca i sprečavaju agregaciju proteina u unutrašnjoj mitohondrijalnoj membrani bogatoj proteinima [50-52]. Uprkos ograničenom broju mjera, vizualna analiza rezultata (dodatni materijali) sugerira da suplementacija CF-om izaziva povećanje mitohondrijalne mase, što se odražava povećanjem svih superkompleksnih vrsta, a ne specifičnim reorganizacijama kompleksa respiratornog lanca. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da CF potiče povećanje mitohondrijalne mase bez kvalitativne adaptacije kompleksa respiratornog lanca.

Tokom mitohondrijalnog disanja stvaraju se promjenjive količine superoksida koji se mogu metabolizirati u druge tipove ROS [53]. Iako je prekomjerna proizvodnja ROS iz mitohondrija uključena u širok spektar patologija, niske fiziološke koncentracije ROS mogu imati korisne efekte, kao što je zaštita od infektivnih agenasa i sudjelovanje u ćelijskoj signalizaciji [2,54]. Prethodne studije provedene in vivo na glodarima i ljudima i modelima ćelijske kulture su izvijestile o korisnim efektima suplementacije CF na proizvodnju ROS i različite antioksidativne sisteme [11]. Na primjer, oralna gavaža sa EPI tokom 15 dana povećava aktivnost SOD2 i katalaze u mišićima kvadricepsa [17]. Iako proizvodnja ROS-a mitohondrija nije široko procijenjena, primijetili smo da su razine proizvodnje ROS-a bile slične kada su vrijednosti izražene po mišićnoj težini, dok je proizvodnja smanjena kada je izražena po mitohondrijskoj masi, što sugerira da dolazi do kvalitativnih adaptacija kako bi se održale fiziološke koncentracije ROS-a. Štaviše, nismo uočili nikakav efekat CF na oštećenja izazvana SOD2 ili ROS procenjena karbonilacijom proteina. Dok CF povećava skupove antioksidativnih proteina, uključujući široko prijavljene nivoe SOD2 i katalaze [16,17,55], ova adaptacija nije uvijek bila povezana sa smanjenjem oštećenja izazvanih ROS [56-59]. Ovi podaci podržavaju teoriju da je za normalnu ćelijsku homeostazu potreban nizak nivo proizvodnje ROS [2]. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da, uporedo s povećanjem mitohondrijalne mase, CF promovira kvalitativne mitohondrijalne adaptacije kako bi poboljšao svoj antioksidativni kapacitet i održao niske razine proizvodnje ROS.

4.3.Mitohondrijska biogeneza

Mitohondrijska masa je rezultat interakcije između mitohondrijalne biogeneze i mitofagije. Naša studija se fokusirala na mitohondrijalnu biogenezu aktiviranu konzumacijom polifenola [60]. Mitohondrijalna biogeneza je ćelijski proces koji poboljšava mitohondrijalnu masu. Ovaj složen i visoko reguliran proces uključuje nekoliko faktora transkripcije, receptore nuklearnih hormona i koaktivatore transkripcije koji djeluju zajedno kako bi koordinirali promjene u ekspresiji nuklearnih i mitohondrijalnih DNK kodiranih gena [61]. Prethodne studije su pokušale da identifikuju koji put(i) mogu biti u osnovi mitohondrijalne biogeneze izazvane suplementacijom CF. Stimulacija NO-zavisne signalizacije se pojavila kao centralni put uključen u mitohondrijalnu biogenezu. Dodatak CF povećava stvaranje NO inhibiranjem enzima arginaze koji razgrađuje arginin, što povećava dostupnost L-arginina za biosintezu NO [62,63]. Štaviše, korišćenjem eNOS inhibitora, stimulativni efekat epikatehina na biogenezu mitohondrija je delimično prigušen [17]. Ovi rezultati ukazuju na uključivanje drugih signalnih puteva za stimulaciju mitohondrijalne biogeneze.

Nedavno su Aragones et al. (2016) su izvijestili da prehrambeni proantocijanidini, članovi porodice polifenola, pospješuju metabolizam NAD plus u jetri tako što poboljšavaju de now o NAD plus put biosinteze i aktivnost Sirte na način ovisan o dozi kod pacova[12]. Nadalje, jetra izvozi NADt prekursore u druge organe, kao što su skeletni mišići, koji imaju manji kapacitet za sintetizaciju NAD, povećavajući mogućnost proširenja efekata uočenih u jetri na cijeli organizam [64]. Dok su neke studije izvijestile o efektu suplementacije CF na sadržaj proteina Sirt1, aktivnost ili mRNA [12,15-17,65,66], učešće NAD metabolizma u mitohondrijalnoj biogenezi nakon suplementacije CF koristeći gubitak ili povećanje funkcija nikada nije testirana. Iako bi nokaut specifično za mišiće bio poželjniji u odnosu na Sirt3 KO miševe cijelog tijela korištene u našoj studiji, naši rezultati sugeriraju da CF poboljšava metabolizam NAD, a Sirt3 je uključen u ovo poboljšanje aktivnosti mitohondrijalnog transportnog lanca elektrona izazvano suplementacijom. Pozitivni efekti uočeni na aktivnost mitohondrijalnih kompleksa nakon suplementacije CF nisu primijećeni kod Sirt3-7 miševa, a veća aktivnost aktivnosti kompleksa I i IV uočena je nakon suplementacije CF samo u WT. Ova zapažanja proširuju prethodne radove pokazujući da Sirt3 igra ključnu ulogu u mitohondrijskoj funkciji ]67. Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da su sirtuini, kroz modulaciju NAD metabolizma, uključeni u poboljšanje mitohondrijalne mase uočeno nakon suplementacije CF. 4.4. Ograničenja

Kakao zrna se sastoje od mješavine monomernih, oligomernih i polimernih flavanola. Među flavanolima, čini se da je EPI najzastupljeniji polifenolni monomer koji se nalazi u proizvodima od kakaa, koji predstavlja do 35 posto sadržaja polifenola [68]. EPI je ustanovljen kao glavni bioaktivni molekul koji je u osnovi koristi od kakaa i suplemenata čokolade [47,69]. Međutim, EPI metaboliti (EPIm) mogu biti uključeni u biološke efekte izazvane EPI uočenim in vivo studijama. EPIm može dostići veće koncentracije u plazmi od EPI[70]. Štaviše, uočene su velike razlike u EPIm među vrstama. Zaista, 80 posto EPIm prisutnog kod ljudi nije otkriveno kod pacova, dok se pokazalo da je sličnost između miševa i ljudi nešto povoljnija jer su otkrivena dva glavna ljudska metabolita [70]. Koristili smo obogaćeni ekstrakt CF koji sadrži do pet puta više EPI od nefermentisanih zrna kakaa[71]. Štaviše, sadržaj EPI je smanjen za 10-20 posto fermentacijom i smanjen na temperaturno ovisan način tokom pečenja [71,72]. Zbirno, ovi podaci sugeriraju da pažnju treba obratiti samo na sadržaj EPI kada se procjenjuju prednosti dodatka EPI na ljudsko zdravlje, a sadašnje rezultate treba uzeti u obzir s oprezom prije ekstrapolacije uočenih temeljnih mehanizama kod ljudi.

5. Zaključci

Svakodnevna suplementacija CF tokom 15 dana dovodi do poboljšanja mitohondrijalne funkcije u oksidativnim i glikolitičkim mišićima. Sadašnji rezultati sugeriraju da pojačano disanje mitohondrija rezultira povećanjem mitohondrijalne mase dok je ćelijski nivo proizvodnje ROS-a održan, sugerirajući kvalitativne adaptacije unutar mitohondrija. Paralelno sa ćelijskim efektom na metabolizam NO koji je prethodno opisan [73], CF modulira metabolizam NAD, koji stimulira aktivnost sirtuina. Sirt3 igra centralnu ulogu u mitohondrijskim adaptacijama i metaboličkoj fleksibilnosti nakon suplementacije CF. Kako su sirtuini novije mete u patogenezi različitih bolesti, kao što su dijabetes ili astma [74,75l, dalje studije će istražiti potencijalni interes za korištenje CF kao prirodnog aktivatora sirtuina.

Reference

1. Kuznjecov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analiza mitohondrijalne funkcije in situ u permeabiliziranim mišićnim vlaknima, tkivima i stanicama. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]

2. Sena, LA; Chandel, NS Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Mol. Cell 2012, 48, 158–167. [CrossRef]

3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Interplay između intracelularnih Ca2 plus oscilacija i Ca2 plus -stimuliranog mitohondrijalnog metabolizma. Sci. Rep. 2016, 6, srep19316. [CrossRef]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitohondrijalne bolesti: Doprinos odgovora organela na stres patologiji. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Snabdijevanje i korištenje mišićnog kisika kod dijabetesa tipa 1, od okolnog zraka do mitohondrijalnog respiratornog lanca: postoji li ograničavajući korak? Diabetes Care 2020, 43, 209–218. [CrossRef]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Od mitohondrija do sarkopenije: Uloga inflamacije i implikacija osi RAGE-liganda. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao i čokolada u ljudskom zdravlju i bolesti. Antioksid. Redox Signal. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Kratkotrajna primjena tamne čokolade je praćena značajnim povećanjem osjetljivosti na inzulin i smanjenjem krvnog tlaka kod zdravih osoba. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Snižen je krvni pritisak i povećana osetljivost na insulin kod hipertenzivnih subjekata netolerantnih na glukozu nakon 15 dana konzumiranja tamne čokolade sa visokim sadržajem polifenola. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]

10. Ottaviani, JI; Momma, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Sterehemijska konfiguracija flavanola utiče na nivo i metabolizam flavanola kod ljudi i njihovu biološku aktivnost in vivo. Slobodni Radic. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]