Dihotomni odgovori na kroničnu fetalnu hipoksiju dovode do unaprijed određenog fenotipa starenja Ⅰ
Nov 29, 2023
Ukratko
Koristeći proteomiku odozdo prema gore i bubreg kao paradigmu, izvještavamo o integrativnoj perspektivi ćelijskih odgovora na kroničnu fetalnu hipoksiju, otkrivajući temeljne mehanizme fetalnog programiranja teorije bolesti odraslih koji su načelno primjenjivi na sve druge organe u tijelu. Karakterističan biomarker tkiva i seruma profipromovirat će razvoj novih terapijskih pristupa za suzbijanje fenotipa preranog starenja koji je, izgleda, povezan s fetalnim programiranjemhronične bolesti.
NABAVITE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA INFEKCIJU BUBREGA
Highlights
• Hronična fetalna hipoksija izaziva široke promjene u ekspresiji proteina.
• Potisnuta replikacija i translacija ograničavaju formiranje novih nefrona.
• Višestruki puteviunaprijed određuju fenotip starenjaveć tokom razvoja.
• Sinergija infloštećenje amatorije, neefikasna popravka i izmijenjen metabolizam.
• Smanjena količina proteina protiv starenjaklotho i sirtuin 6 kod miševa i ljudi.
Ograničenje intrauterinog rasta uzrokovano hipoksijom povećava rizik zakardiovaskularni, bubrežni, i drugihhronične bolesti kod odraslih, što predstavlja veliki javnozdravstveni problem. Ipak, ne zna se mnogo o fetalnim mehanizmima koji predisponiraju ove osobe na bolest. Koristeći prethodno potvrđen mišji model fetalne hipoksije i proteomike odozdo prema gore, karakteriziramo odgovor fetalnog bubrega na kronični hipoksični stres. Fetalni bubrezi pokazuju dihotomni odgovor na kroničnu hipoksiju, koji s jedne strane uključuje stanične adaptacije koje pospješuju preživljavanje (glikoliza, autofagija i smanjena sinteza DNK i proteina), ali s druge strane procese koji induciraju fenotip nalik starenju (infiltracija upalnih stanica oštećenje DNK i smanjena proliferacija). Važno je da kronična hipoksija također smanjuje ekspresiju proteina protiv starenja klotho i Sirt6, mehanizam koji je evolucijski očuvan između miševa i ljudi. Zajedno, otkrivamo da je unaprijed određeno starenje tokom fetalnog razvoja ključni događajhronična hipoksija, uspostavljajući čvrst temelj za Barkerovu hipotezu o fetalnom programiranju bolesti odraslih. Ovaj fenotip je povezan s karakterističnim profilom biomarkera u uzorcima tkiva i seruma, koji se može iskoristiti za otkrivanje i ciljanje ubrzanog starenja uhronične hipoksične bolesti ljudi.
Barkerova teorija fetalnog programiranja bolesti odraslih (1, 2) navodi da neželjeni događaji tokom razvoja povećavaju rizik od višestrukih kroničnih bolesti u odrasloj dobi, uključujućihipertenzija,dijabetes melitus,opstruktivne plućne bolesti, ilihronična bolest bubrega(CKD). U našem društvu koje stalno stari, ovi poremećaji nameću ogroman ekonomski teret koji progresivno raste zbog sve većeg broja pacijenata koji pate od jednog ili više ovih poremećaja. među ovima,CKDizavršni stadijum bubrežne bolesti(ESRD) ne samo da predstavljaju nezavisne faktore rizika za kardiovaskularni morbiditet i mortalitet, već stvaraju i sve veće troškove za terapiju zamjene bubrega, što ih čini velikim javnozdravstvenim problemom. Među strategijama za suočavanje s ovim trendom, rasvjetljavanje mehanizama koji povezuju Barkerovu teoriju i razvoj CKD igra ključnu ulogu. Uvjerljivo objašnjenje za postupni gubitak bubrežne funkcije kod potomaka niske porođajne težine pretpostavlja uspostavljanje začaranog kruga koji se vrti između smanjene bubrežne filtracijske površine, povećanog opterećenja preostalih nefrona i daljeg oštećenja tog opet.smanjuje kapacitet filtracije(Brenner's hypothesis) (3). A common finding in intrauterine growth restriction (IUGR) babies is the reduced number of nephrons formed at the end of kidney development (4). Thus, a low nephron number at birth increases the risk for accelerated functional decline and irreversible renal tissue damage (5, 6). Among all possible intrauterine stress factors, chronic hypoxia due to placental insufficiency or pregnancy at high altitude (>2500 m nadmorske visine – pogađa više od 2% svjetske populacije (7, 8)) spada u najkritičnije i klinički relevantne faktore koji narušavaju razvojni program embrija (9). Međutim, molekularni mehanizmi pomoću kojih hipoksija dovodi do IUGR-a i poremećenog razvoja bubrega ostaju nepotpuno shvaćeni i zahtijevaju daljnje istraživanje. U ovoj studiji procijenili smo na nivou proteoma molekularne promjene u fetalnom bubregu nakon izlaganja embrija miša u razvoju kroničnom hipoksičnom stresu i potvrdili neke ključne nalaze u uzorcima humanog hipoksičnog seruma. Pružamo značajne dokaze za niz mehanizama interakcije koji s jedne strane omogućavaju preživljavanje ćelija u nepovoljnim uslovima, ali s druge strane, promovišu smanjen broj nefrona i fenotip preranog starenja. To dalje pokazujemogen-specifična DNKhipermetilacija ali i hipometilacija DNK doprinose ovom dihotomnom odgovoru na kroničnu hipoksiju. Dakle, naši nalazi uspostavljaju čvrst temelj za Barkerovu hipotezu, otkrivajući niz puteva koji unaprijed određujufenotip starenjaveć tokom razvoja.
EKSPERIMENTALNI POSTUPCI
Dizajn eksperimenta i statističko obrazloženje Cilj ove eksplorativne studije bio je da se otkriju promjene u proteomu cijelih fetalnih bubrega koje potiču od IUGR fetusa kako bi se produbilo znanje o fetalnim mehanizmima koji predisponiraju male osobe u gestacijskoj dobi za kronične bolesti u odrasloj dobi. Studija se temeljila na proteomskom profiliranju odozdo prema gore korištenjem nano-LC sistema spojenog na orbitrap maseni spektrometar visoke rezolucije. U tu svrhu, šest E18.5 hipoksičnih bubrega i šest E18.5 normoksičnih bubrega muškaraca korišteno je i analizirano u duplikatu u kontroliranom eksperimentu na slijepi način. Sve replikacije su bile uspješne, nijedan eksperimentalni nalaz nije mogao biti repliciran. Podaci o proteomici analizirani su korištenjem softvera MaxQuant 1.5.2.8 (uključujući pretraživač Andromeda i paket za statističku analizu Perseus) i funkcionalnog klasteriranja anotacija. Za dugoročne posljedice kronične fetalne hipoksije na bubrežnu funkciju, nasumično je odabrano pet hipoksičnih i pet normoksičnih muških potomaka i analizirano nakon 8 mjeseci (pet životinja je potrebno da se otkrije 30% smanjenja GFR kod fetalnih hipoksičnih životinja, na osnovu varijanse od 15%, Alpha=0.05, Power=0.9). Eksperiment in vivo je zaključen procjenom bubrežne fibroze i serumskih markera nakon 15 mjeseci. Da bi se potvrdili neki od ključnih nalaza eksperimenata na životinjama, analizirani su uzorci ljudskog seruma, koji su prikupljeni u prethodnim kontroliranim studijama na zdravim dobrovoljcima (10). Svi in vitro eksperimenti su analizirani i zaslijepljeni odgovarajućim kontrolama. Statistički test i eksperimentalni detalji su dati u legendi svake slike. Svi podaci su predstavljeni i uključuju sve vanjske vrijednosti.
Životinje
C57BL/6N miševi su kupljeni od Janvier laboratorija, Francuska, i smješteni na 23 ◦C i 50 do 60% vlažnosti u IVC kavezima sa slobodnim pristupom hrani i vodi i ciklusom od 12 sati dan/noć. Svi eksperimenti na životinjama provedeni su u skladu sa švicarskim zakonom za dobrobit životinja i odobreni su od strane lokalnih vlasti (Kanton Bern BE96/11, BE105/14 i BE105/17). Za vremensko parenje, ženke u rasplodu su provjeravane na vaginalne čepove svako jutro, a ako su prisutni, vremenska tačka je postavljena na gestacijski dan (E) 0,5. Gravidne majke su nasumično dodijeljene ili normoksičnoj kontrolnoj grupi (N=11) ili izložene konstantnoj hipoksiji (N=11) tokom 7 dana. Za indukciju hipoksije, majke na dan gestacije E11.5 prebačene su u hipoksičnu kutiju za rukavice (Coy Laboratory Products), a sadržaj kiseonika je postepeno snižen na 10% u roku od 3 do 4 h. Električni ventilator unutar komore održavao je adekvatnu cirkulaciju zraka. Nivo CO2 je održavan niskim heliranjem viška CO2 u patronama punjenim soda vapnom (Sigma, 72073) spojenim na sistem za cirkulaciju vazduha. Višak vlage je apsorbovan silika gel narandžastim granulatom (Sigma, 1.01969), menjan svaki dan. Devet majki iz svake grupe je eutanazirano na E18.5, a fetusi i placente su sakupljeni, izvagani i pripremljeni za dalju analizu. Fetalna krv je uzeta iz trupa obezglavljenih fetusa E18.5. Fetalni bubrezi su secirani u PBS pomoću Leica M80 stereoskopa. Za dugoročne analize, dvije majke su uklonjene iz hipoksije nekoliko sati prije rođenja, a muški potomci su korišteni za procjenu funkcije bubrega (brzina glomerularne filtracije — GFR) u dobi od 8 mjeseci kako je opisano (11) i za procjenu renalne fibroze i serumskih nivoa klotoa i sirtuina 6 u 15 mjeseci.
Glomerular Count
Za imunofluorescentno bojenje bubrega E18.5 u cijelosti, primijenjen je iDisco protokol bojenja (12) (https://idisco.info/idisco-protocol/) uz prethodnu obradu metanolom korištenjem antinefrinskog antitijela (R&D AF3159). Za relevantne korake korišteno je vrijeme inkubacije n=1 dana i zapremina rastvora od 1,6 ml. Bubrezi su postavljeni u 8-slajdove sa staklenom komorom (Thermo Fisher, 154534) i odmah snimljeni pomoću IMIC digitalnog mikroskopa (FEI, tip 4001) sa polihromnim V svjetlom izvor, kontroler kamere Orca-R2 iz Hamamatsua (C10600) i softver za preuzimanje uživo (FEI, verzija 2.6.0.14). Stomikrometarske Z-stack slike zamrljanih bubrega E18.5 su analizirane softverom za obradu slika otvorenog koda Fiji (ImageJ, verzija 2.0.0-rc69/1.52i, https:// imagej.net/ Fidži). U dodatku TrackMate v3.8.0, Downsample LoG detektor je postavljen na 80,0 piksela za procijenjeni prečnik mrlje sa 16- pragom piksela i faktorom smanjenja uzorkovanja 2. Broj tačaka po kadru je dodat za izračunavanje broja glomerula po bubregu. Odabrana je udaljenost od 100 μm između okvira kako bi se izbjeglo dvostruko brojanje identičnih glomerula na uzastopnim slikama, s obzirom na prosječni glomerularni promjer od 80 μm.
Transkutana procjena glomerularne filtracije GFR je određen kod svjesnih životinja kao što je prethodno opisano (11). Ukratko, plazma klirens FITC-sinistrina (Fresenius-Kabi, LI9830076) se mjeri preko kože pomoću dioda koje emituju svjetlost sa maksimumom emisije za FITC na 470 nm i fotodiodom koja detektuje fluorescentno svjetlo s maksimalnom osjetljivošću na 525 nm. Smanjenje intenziteta fluorescencije tokom vremena se zatim pretvara u GFR.
RT-qPCR Ukupna RNK je izolovana upotrebom TRIzol reagensa (Invitrogen 15596026) prema protokolu proizvođača. Koncentracija i kvalitet RNK određivani su spektrofotometrom Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific), a 1000 ng je transkribirano u cDNK korištenjem PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, RR037A). cDNA je razrijeđena na 2 ng/ul, a qPCR je izveden sa FAM-obilježenom UPL sondom (Roche) plus odgovarajućim gen-specifičnim prajmerima i TaqMan Fast Universal PCR Master mješavinom (Applied Biosystems, 4352042) na 7500 Fast Real-Time PCR sistemu (Primijenjeni biosistemi). Analiza podataka je obavljena pomoću programa Microsoft Excel. 2(−ΔCt) metoda je korištena za izračunavanje relativnih nivoa ekspresije za RT-qPCR. Sekvence sonde i prajmera navedene su u Dodatnoj tabeli S1.
Priprema uzorka za LC-MS/MS analizu Izolovani muški fetalni bubrezi (n=3 za svaku grupu) su homogenizovani u puferu za uzorke (7,5 M urea, 1,5 M tiourea, 4% CHAPS, 0.{{ 18}}5% SDS, 100 mM ditiotreitola (DTT)) pomoću ultrazvučnog štapa. Koncentracije proteina određene su Bradfordovim testom (Bio Rad-Laboratories). Protokol digestije u gelu je primijenjen kao što je prethodno opisano (13, 14). Ukratko, 80 ug svakog uzorka je stavljeno na SDS-PAGE, što nam je omogućilo da prefrakcionišemo uzorak kako bismo smanjili njegovu složenost. Nakon fiksacije sa 50% metanola/10% sirćetne kiseline, gelovi su isprani i senzibilizovani sa 0,02% Na2S2O3. Gelovi su zatim obojeni sa 0,1% AgNO3 tokom 10 minuta, isprani i razvijeni sa 3% Na2CO3/0,05% formaldehida. Svaka traka proteina je zatim izrezana na četiri kriške i obojena. Nakon redukcije sa DTT i alkilacije jodoacetamidom (IAA), proteini su enzimski digestirani upotrebom Trypsin/Lys-C (MS grade; Promega Corporation). Nakon digestije, peptidi su eluirani, osušeni i pohranjeni na -20 ◦C do LC-MS/MS analize.
LC-MS/MS analiza
Kao što je prethodno opisano (13), uzorci peptida su rekonstituirani u 5 ul 30% mravlje kiseline (FA) koja sadrži 10 fmol svaki od četiri sintetička standardna peptida i razrijeđeni sa 40 ul mobilna faza A (97,9% H2O, 2% ACN, 0,1% FA). Sintetički peptidi [Glu1-Fribrinopeptid B – EGVNDNEEGFFSAR; M28 – TTPAVLDSDGSYFLYSK; HK0 – VLETKSLYVR; HK1 – VLETK(ε-AC)SLYVR] su dodani u svaki uzorak kao interna kontrola kvaliteta za praćenje stabilnosti LC-MS sistema. Deset mikrolitara ovog rastvora je zatim ubrizgano u Dionex Ultimate 3000 nano LC-sistem povezan sa QExactive orbitrap masenim spektrometrom opremljenim izvorom jona nanospreja (Thermo Fisher Scientific). Kao korak prethodnog koncentriranja, peptidi su stavljeni na predkolonu C18 Pepmap100 od 2 cm × 75 μm (Thermo Fisher Scientific) pri brzini protoka od 10 ul/min koristeći mobilnu fazu A. Eluiranje peptida iz predkolone u 50 cm Pepmap100 μm0 analitička kolona (Thermo Fisher Scientific) i naknadno odvajanje postignuti su pri brzini protoka od 300 nl/min koristeći gradijent od 8% do 40% mobilne faze B (80% ACN, 19,9% H2O, 0,1% FA) tokom 235 min. Masena spektrometrijska detekcija je ostvarena, vršeći MS skeniranje u opsegu od m/z 400 do 1400 pri rezoluciji od 70.000 (na m/z =200). MS/MS skeniranje 12 najzastupljenijih jona postignuto je HCD fragmentacijom pri 30% normalizirane energije sudara i analizirano u orbitrapu pri rezoluciji od 17,500 (na m/z =200). Svi uzorci su analizirani u duplikatu. Proteomički podaci masene spektrometrije deponovani su Konzorcijumu ProteomeXchange (http:// proteomecentral.proteomexchange.org) preko PRIDE partnerskog repozitorija (15) sa identifikatorom skupa podataka PXD018999 i 10.6019/PXD018999.
Identifikacija proteina i bez oznaka
Kvantifikacija (LFQ) Identifikacija proteina, kvantifikacija bez oznaka (LFQ) kao i statističke analize su obavljene pomoću softvera MaxQuant 1.5.2.8 uključujući pretraživač Andromeda i paket za statističku analizu Perseus (16, 17), često korišteni tok rada za obradu i statističku procjenu podataka o proteomici sačmarica. Proteini su identificirani korištenjem UniProt baze podataka za musculus proteine (verzija 170428 sa 16,854 unosa, ograničeno samo na pregledane unose), tolerancija mase peptida od 25 ppm, tolerancija MS/MS podudaranja od 2{{21 }} ppm, i maksimalno dva propuštena cijepanja sa tripsinom kao proteazom. Kriterijumi za pretragu su dalje uključivali karbamidometilaciju cisteina kao fiksnu modifikaciju, oksidaciju metionina kao i acetilaciju N-terminalnog proteina kao varijabilne modifikacije, i najmanje dve identifikacije peptida po proteinu, od kojih je najmanje jedna jedinstvena. Nadalje, utakmica između rundi je izvedena korištenjem vremenskog okvira meča od 5 minuta i 15-minutnog vremenskog okvira za poravnanje. I za peptide i za proteine primijenjena je stopa lažnog otkrivanja (FDR) manja od 0,01. Za statističku analizu izvršena su međusobna poređenja između normoksičnih i hipoksičnih uzoraka bubrega kako bi se odredile grupe proteina, koje su bile značajno povećane ili dole regulirane nakon hipoksije. U tu svrhu, koristeći Perseus paket statističke analize, izračunate su razlike LFQ vrijednosti. Promjene vrijednosti sadržaja proteina između normoksičnih i hipoksičnih uzoraka bubrega određene su dvostranim t-testom sa p < 0,05 i minimalnom dvostrukom razlikom u obilju. Svi proteini koji ispunjavaju ove kriterijume su uzeti u obzir u ovoj studiji. Osim toga, da bi se naglasili najsnažniji regulatorni efekti na hipoksiju, značajno regulirani proteini s globalnim FDR-om<0.05 as determined by a permutation-based method were analyzed.
Funkcionalna anotacija i grupisanje
Funkcionalno grupisanje anotacija izvedeno je korištenjem baze podataka genskih ontoloških resursa (18–20) i DAVID platforme (21) (https://david.ncifcrf.gov). Proteinske mreže su generirane korištenjem STRING baze podataka (22). Vrijednosti diferencijalne ekspresije između bubrega kontrolne grupe E18.5 normoksične i hipoksije su mapirane pomoću Heatmapper-a (23) (http://www.heatmapper.ca).
Imunohistohemija
PFA fiksirani, parafinski umetnuti dijelovi tkiva su rehidrirani, a endogena peroksidaza je blokirana inkubacijom stakalca u 1,5% otopini H2O2 (0.02 M limunske kiseline, 0.{101} {40}}6 M Na2HPO4) na sobnoj temperaturi 15 minuta u mraku. Uzimanje antigena je izvedeno ključanjem u Tris-EDTA (pH 9) ili puferu limunske kiseline u trajanju od 20 minuta, nakon čega je slijedilo polagano hlađenje do sobne temperature. Nakon blokiranja u 2% BSA u PBS na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 h, sekcije su inkubirane sa primarnim antitelima u rastvoru za blokiranje o/n na 4 ◦C (MPO, ab208670; CAV1, ab32577; oba Abam). Nakon tri koraka ispiranja u PBS-u, sekcije su inkubirane sa HRP konjugiranim sekundarnim anti-zečjim antitelom (K4003, Dako EnVision+ System od Agilenta) 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri koraka ispiranja u PBS-u, signal je razvijen pomoću DAB-a (Agilent, K3468). Sekcije su obojene, dehidrirane i montirane pomoću Eukitt medija (Sigma, 03989). Za detekciju 8-OHdG (MOG-100P, JaICA), korišten je Vector MOM imunodetekcioni komplet (BMK-2202) prema proizvođaču. Slike svetlog polja su dobijene na Nikon E600 mikroskopu (objektiv Plan Fluor ELWD 20×/0,45) sa kontrolerom kamere Digital Sight DS-UE i DS-Ri1 kamerom (oba Nikon) korišćenjem Nikon softvera NIS Elements 4.0.
Enzimski
Kvantifikacija nivoa laktata laktata u bubrezima E18.5 određena je nakon deproteinacije uzorka sa spin kolonama pomoću enzimskog kompleta MAK064- 1KT (Sigma), prema proizvođaču.
Human Studies
Studiju na ljudima odobrio je Etički komitet Švicarskog federalnog instituta za tehnologiju (EK 2011-N-51) i provedeno je u skladu sa Helsinškom deklaracijom. Ukratko, dobijen je informirani pristanak od devet zdravih nepušača iz nizije (osam muškaraca i jedna žena). Ovi volonteri su sekvencijalno procjenjivani za više fizioloških parametara prije, tokom i nakon 4-nedjelje neprekidnog boravka na velikoj nadmorskoj visini, kao što je ranije objavljeno (10).
Cell Culture
Primarne proksimalne tubularne ćelije (pPTC) su izolovane iz {{0}} do 4- sedmičnih C57BL/6N muških bubrega, kao što je prethodno opisano (24). Ukratko, proksimalni tubularni fragmenti dobijeni su digestijom kortikalnog tkiva bubrega kolagenazom i naknadnom filtracijom kroz membranu veličine pora od 250 μm i 80 μm. PTC su uzgajani u DMEM/F12 (Gibco, 21041-025) sa dodatkom 15 mM HEPES-a, 0,55 mM NaPyruvate, 1% NEAA i dodataka podloge za rast bubrežnih epitelnih stanica (REGM) (Lonza, CC-4127) . Nakon konfluencije, pPTC-ovi su jednom podijeljeni korištenjem Accutase rastvora (Sigma, A6964) i ponovo postavljeni. Za hipoksiju, ćelijska kultura je izvedena na 1% kiseonika tokom 48h; normoksične kontrole su uzgajane na 19% kiseonika.
ELISA
Nivoi Klotho-a ili Sirt6 u serumu određeni su korištenjem sljedećih kompleta za uzorke miševa (CSB-E14362m, Cusabio tehnologija i OKCD02892, Aviva Systems Biology) i ljudske uzorke (CSB E17018h i CSB-E13235h; oba Cusabio tehnologija) prema priloženim protokolima. Fetalna krv miša je sakupljena iz debla obezglavljenih fetusa E18.5. Krv miševa odraslih životinja uzorkovana je iz vene saphena. Uzorci ljudskog seruma su dobijeni iz prethodne studije (10).
Bisulfit PCR
DNK iz životinja koje su tretirane hipoksijom ili normoksijom E18.5 ekstrahovane su Qiagen kompletom za krv i tkivo i konvertovane u bisulfit pomoću EpiTect Bisulfite Kit iz Qiagena prema uputstvima proizvođača. Dvadeset nanograma konvertovane DNK korišćeno je kao šablon u PCR reakciji sa AmpliTaq Gold (Invitrogen). Sljedeći prajmeri su dizajnirani koristeći MethPrimer 2.0: Klotho, fragment od 248 bp (−234/+14 TSS), Kl_BS_F (TAG TTT TAG GAA GGT AAA GGG AGT G) i Kl_BS_R (AAC AAT AAT TAT CCA AAA CAA AC) (25); Mki67, 497 bp fragment (~1 kb uzvodno od TSS), Mki67_BS_F (TTG GAA GAA TAT TGA TTT AGG AA) i Mki67_BS{{20} }R (ACC TAT AAA CTC CCT CTC CAA AAA T). PCR proizvodi su ligirani u pCR4-TOPO-vektor korištenjem TOPO TA kompleta za kloniranje za sekvenciranje (Invitrogen) i transformirani u DH10 bakterije. Klonovi su poslati na sekvencioniranje (Microsyth Seqlab GmbH). Inspekcija, poravnanje, vizualizacija i statistika izvedeni su pomoću QUMA kvantifikacionog alata za analizu metilacije (26).
Statistika
Izvršena je statistička analiza i napravljeni su grafikoni sa GraphPad Prism verzija 8 (https://www.graphpad.com). Dvije grupe su testirane na značajnost nesparenim dvostranim t-testovima sa ili bez Welch-ove korekcije (Welch-ova korekcija je bila za nenormalno raspoređene podatke, F test varijansi je bio statistički značajan, p < 0.05). Više grupa je testirano korištenjem RM jednosmjerne ANOVA sa Geisser-Greenhouse korekcijom i Dunnettovim testom višestrukih poređenja. p vrijednosti<0.05 were assumed significant. Means with standard deviation (SD) are shown.
Izvorni podaci
Neobrađeni podaci za sve eksperimente koji nisu rezultat analize masene spektrometrije mogu se naći u tabeli izvornih podataka S1 u skupu dodatnih podataka. Ovo uključuje podatke na kojima se nalaze slike 1A i D–H, slike 3E i F, slike 5B, slike 7D–I, slike 8 i dodatne slike S1 i slike S6.
REZULTATI
Hronični
Fetalna hipoksija rezultira embrionima ograničenim rastom i smanjenom bubrežnom funkcijom kod odraslih potomaka Za izlaganje vremenski sparenih majki konstantnoj hipoksiji (10% kiseonika) tokom 7 dana (slika 1A), korištena je hipoksična komora. Slično našem prethodnom radu (27), majke su se brzo prilagodile hipoksičnom okruženju, a pri rođenju veličina legla i masa placente bile su slične normoksičnim kontrolnim gestacijama (dodatna slika S1, A–C). Ipak, hipoksični E18.5 fetusi su imali smanjenu tjelesnu težinu u poređenju sa normoksičnim kontrolama, ispunjavajući kriterije IUGR (28) (Slika 1, dopunska slika S1D), i 40% smanjen broj nefrona (Sl. 1, C i D). Ovo smanjenje nije nastalo zbog degeneracije nefrona (nekroze ili apoptoze) tokom intrauterinog razvoja u hipoksičnim uslovima kao što je ranije objavljeno (27). Nadalje, usprkos značajnom periodu rasta 3 tjedna nakon rođenja, o čemu smo ranije izvijestili (27), odraslo hipoksično potomstvo pokazalo je ozbiljno smanjenu bubrežnu funkciju u 8 mjeseci (Slika 1E) i povećanu ekspresiju fibroznih markera u 15 mjeseci (Sl. 1, F–H), čime se potvrđuje valjanost našeg pristupa kao robusnog IUGR modela i ilustracije Barkerove teorije fetalnog programiranja bolesti odraslih.
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
