Razvoj obogaćenog ulja polifenolima ekstrahovanog iz otpadnih voda mlinova maslina, 1. dio

sažetak:Ekstrakcija maslinovog ulja proizvodi značajnu rezidualnu otpadnu vodu mlinova maslina (OMW). Sastav OMW varira u zavisnosti od vrste masline, stepena zrelosti ploda i metode ekstrakcije (tradicionalni sistem sa jednim presovanjem ili kontinuirani sistemi zasnovani na centrifugiranju pulpe masline). U zemljama koje se bave proizvodnjom maslina, OMW je važan za životnu sredinu i ekonomiju, a takođe je i jeftin izvor polifenolnih jedinjenja sa visokim antioksidativnim svojstvima. Svojstva maslinovog ulja, kao što su njegovo antiaterogeno, protuupalno djelovanje, djelovanje protiv starenja i imunološki modulator, pripisuju se njegovim polifenolima. U ovoj studiji, metoda ekstrakcije tačke zamućenja (CPE) korištena je za dobivanje polifenolnih spojeva iz OMW. Ukupna micelarna faza tri oporavka bila je 24,2 posto, a ukupni polifenoli (nakon ultrazvučne obrade) iznosili su 504 mg GAE/kg. Nadalje, dodatak polifenola dobivenih iz OMW-a poboljšao je maslinovo ulje i produžio njegov vijek trajanja bez promjene njegovih organoleptičkih svojstava. Došlo je do 42,2 posto promjene u polifenolima nakon obogaćivanja micelarne disperzije od 0,5 posto. Stoga se sugerira da bi CPE metoda mogla dovesti do boljeg upravljanja otpadom u industriji maslinovog ulja i poboljšanja nutritivne kvalitete prehrambenih proizvoda.

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju spermatozoida. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i može ukloniti reaktivne vrste kisika, spriječiti degradaciju kolagena izazvanu slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne riječi: antioksidansi; ekstrakcija tačke zamućenja; prehrambena industrija; obogaćivanje; otpadne vode mlinova maslina; maslinovo ulje; polifenoli; oporavak

1. Uvod

Potražnja za maslinovim uljem u cijelom svijetu stalno raste. Na području Mediterana, koje je najveće područje za proizvodnju maslina u svijetu, ogromna količina otpadnih voda iz agroindustrije nastaje iz industrije prerade maslina [1,2]. Ostaci otpadnih voda mlinova maslina (OMW) sastoje se od čvrstog otpada – koji se sastoji od pulpe masline – kao i tečnog otpada – koji se sastoji od povrća i dodatne vode koja nastaje tokom dekantacije. OMW ima tamno-smeđu boju (koja može postati crna) i karakterističnu, snažnu aromu koja podsjeća na masline [3]. Nusproizvodi iz mlina imaju ekološki i ekonomski značaj u zemljama proizvođačima maslina. OMW stvara visoke razine zagađivača zbog svog visokog organskog opterećenja i visokog sadržaja fitotoksičnih i antibakterijskih polifenolnih supstanci, koje su otporne na biološku degradaciju [4]. Tretman i odlaganje OMW-a postaju ozbiljan ekološki problem. Stoga su se zemlje koje proizvode maslinovo ulje suočavale s ozbiljnim izazovom da pronađu ekološki prihvatljivo i ekonomski održivo rješenje za rukovanje i odlaganje OMW-a.

Inovativna i ekološki prihvatljiva tehnologija za ekstrakciju bioaktivnih supstanci, posebno iz hrane, je ekstrakcija tačke zamućenja (CPE). To je tehnika u kojoj se kemijske ili biološke komponente ekstrahiraju korištenjem nejonskih surfaktanata koji kada se zagriju na (ili iznad) kritične temperature, imaju tendenciju da se odvoje od rasute otopine i stvaraju oblake [5]. Surfaktanti se posebno koriste kao ekstrakti tokom CPE procesa. U pravim okolnostima, ekstrakcija se odvija na temperaturi ispod tačke zamućenja – kada surfaktant postane zamućen (tj., manje rastvorljiv od početnog uzorka ili čak nerastvorljiv) – što dovodi do razdvajanja dve faze: vodene faze i surfaktanta -bogata faza. Zbog procesa zamućenja, tehnika dovodi do predkoncentracije analita (kao što su polifenoli) u fazi bogatoj surfaktantima [6]. Nadalje, pokazano je da su spojevi rastvoreni u miceli zaštićeni od oksidacije [7].

Polifenolna jedinjenja, šećeri i organske kiseline čine većinu OMW. OMW takođe ima bogate resurse kao što su kalijum i drugi mineralni nutrijenti, koji se mogu ponovo koristiti kao đubrivo [8]. Međutim, OMW bi mogao biti prirodni izvor antioksidansa zbog visokog sadržaja polifenolnih spojeva. Polifenoli maslinovog ulja imaju potencijalno korisna nutritivna svojstva za svoje antioksidativne i biološke aktivnosti kao što su antialergijska, protuupalna, antikancerogena i antihipertenzivna [9,10]. Nizak redoks potencijal polifenola, koji im omogućava da djeluju kao redukcioni agensi doniranjem vodika ili elektrona i uklanjanjem slobodnih radikala, osnova je njihove antioksidativne aktivnosti [7].

Proizvođači ulja imaju za cilj proizvodnju prehrambenih proizvoda koji zadržavaju svoju nutritivnu vrijednost i rok trajanja tokom dužeg vremenskog perioda. Ovi faktori čine dodatak antioksidansima uobičajenom tehnikom za smanjenje oksidacije lipida u proizvodnji hrane [11]. Kako bi se spriječila oksidacija u hrani koja sadrži masti i ulja, sintetički antioksidansi uključujući butilirani hidroksitoluen (BHT), terc-butil hidrokinon (TBHQ) i butilirani hidroksianizol (BHA) korišteni su kao aditivi za hranu. Međutim, otkriveno je da su ovi hemijski antioksidansi povezani sa raznim zdravstvenim opasnostima, uključujući rak i karcinogenezu [12].

Nedavna istraživanja su pokazala da prirodni antioksidansi mogu spriječiti oksidaciju jestivog ulja [11–13]. Obogaćivanje maslinovog ulja polifenolnim supstancama može produžiti vijek trajanja maslinovog ulja bez utjecaja na njegove organoleptičke karakteristike. Međutim, ravnoteža antioksidans/prooksidans ovisi o mnogim faktorima, posebno o dozi (npr. koncentracija) i vremenu (npr. trajanje skladištenja) i to je vrlo delikatan proces koji se lako može promijeniti [14]. Posljedično, obnavljanje polifenolnih jedinjenja ne samo da pruža ekonomsku priliku, već i smanjuje ekološki teret otpadnih voda.

Ciljevi ovog istraživanja bili su prvo da se dobiju polifenolne tvari iz OMW primjenom CPE metode, a drugo da se dobijenim polifenolnim tvarima obogati maslinovo ulje. Stabilnost polifenola je važan parametar u ovom obogaćivanju. U tu svrhu su proučavani emulgatori, poput lecitina.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali

U ovom istraživanju korišćen je uzorak otpadnih voda mlinova maslina (Olea europaea var. Koroneiki) iz regije Preveza (Epir, Grčka). Uzorak OMW-a posebno je sakupila industrija maslinovog ulja, zamrznut i dostavljen u našu laboratoriju istog dana. Kao matrica za kontrolni uzorak korišteno je maslinovo ulje sa lokalnog tržišta u Karditsi (Tesalija, Grčka), sastavljeno od djevičanskih i rafiniranih maslinovih ulja.

2.2. Reagensi

The 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH• ) and α-tocopherol were purchased from Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany). Sodium chloride, citric acid, lecithin of soya (>97 posto), dietil etar i izooktan dobijeni su od Carla Erbe (Milano, Italija). Bezvodni natrijum karbonat i natrijum hidroksid su iz Pente (Prag, Češka). Apsolutni etanol, metanol, Folin-Ciocalteu reagens i monohidrat galne kiseline su iz Panreaca (Barselona, ​​Španija). Cikloheksan i n-heksan su iz Sigma-Aldrich (Steinheim, Njemačka). Deionizirana voda korištena u eksperimentima proizvedena je pomoću deionizirajuće kolone.

2.3. Ekstrakcija polifenola iz OMW

Korištena je metoda nazvana ekstrakcija tačke zamućenja (CPE). CPE metoda se temelji na ideji da kada koncentracija surfaktanta u otopini premašuje onu kritične micelarne disperzije, može stvoriti micelarne disperzije [6]. Slika 1 prikazuje eksperimentalne korake CPE metode. Prvo, uzorak je morao biti odmrznut prije nego što su čvrste tvari mogle biti odvojene pomoću centrifuge (Digicen 20-R, Orto Alresa, Madrid, Španija) u trajanju od 10 minuta pri 4500 o/min. Nakon sakupljanja supernatanta, dodana je limunska kiselina (50 posto) da se nivo pH dovede na 3,5. Čitav uzorak je podijeljen u tri dijela, sa lecitinom kao surfaktantom dodat svakom od njih u koncentracijama od 1 posto, 3 posto, odnosno 5 posto, zajedno sa 30 posto soli. Za miješanje je korištena intenzivna magnetna miješalica. Nakon 20 min, rastvor je centrifugiran 5 min na 4500 o/min. Razdvojeno su ispitivane gornja micelarna (surfaktant) faza (SP) i donja vodena (vodena) faza (WP). Prvi oporavak polifenolnih disperzija dogodio se u ovom trenutku. Sa vodenom fazom koja sadrži neekstrahovane analite, CPE metoda je izvedena još dva puta pod istim uslovima (2. i 3. oporavak). Foods 2023, 12, x ZA PEER OCENJU 3 od 13 Apsolutni etanol, metanol, Folin-Ciocalteu reagens i monohidrat galne kiseline su iz Panreaca (Barselona, ​​Španija). Cikloheksan i n-heksan su iz Sigma-Aldrich (Steinheim, Njemačka). Deionizirana voda korištena u eksperimentima proizvedena je pomoću deionizirajuće kolone

2.4. Određivanje učinka CPE metode

2.4.1. Ukupan sadržaj polifenola

Prema Chatzilazarou et al. [15], Folin-Ciocalteu metoda je korištena za fotometrijski određivanje ukupnog sadržaja polifenola (TPC). Ukratko, 0.5 g micelarne disperzije i 0.5 mL Folin–Ciocalteu reagensa dodano je u volumetrijsku tikvicu od 25-mL. Nakon 3 min, dodat je 1 mL Na2CO3 (35 posto, w/w). Dejonizirana voda je korištena za punjenje tikvica do potrebnog volumena, a zatim su držane u mraku 60 min. Za mjerenje apsorpcije na 750 nm korišten je Shimadzu UV-1700 UV/Vis spektrofotometar (Kyoto, Japan). Standardne otopine (1-10 mg/L) korištene su za kreiranje standardne krive galne kiseline. TPC je izražen kao mg ekvivalenta galne kiseline (GAE) po kg micelarne disperzije.

DPPH metoda Katsoyannosa et al. [16], uz neke modifikacije, korišten je za procjenu aktivnosti uklanjanja radikala polifenola ekstrahiranih u fazi surfaktanta, kao i onih koji su još uvijek prisutni u uzorku nakon CPE tretmana (vodena faza). Ukratko, 1 mL, 0.1 mM rastvora metanolnog DPPH dodat je u 4 mL rastvora uzorka (500, 1000 i 2000 mg/L). Smjesa je dobro promućkana prije nego što je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi u mraku 30 minuta dok je apsorbancija mjerena na 517 nm. Formula korištena za određivanje procenta inhibicije bila je: postotak inhibicije=100 × (Acontrol − Asample)/Acontrol, gdje su Acontrol i Asample apsorbancije. Iz aktivnosti čišćenja (procenti) u odnosu na koncentracije odgovarajuće krive uzorka, određen je IC50.

2.5. Obogaćivanje maslinovog ulja micelarnim disperzijama

Korištenje ultrazvučne sonde (Misonix Sonicator S3000, Qsonica, LLC, Newtown, CT, SAD) i protokola sonikacije (75 posto energije energije za 60, 75 i 90 minuta sa 0,5 impulsa ciklusa), istraženo je smanjenje veličine micelarne. CPE metoda je korištena za obnavljanje micelarne disperzije, koje su zatim dodavane maslinovom ulju kako bi se poboljšalo. Za obogaćivanje korištene su koncentracije od 0,5, 1 i 5 posto.

2.6. Analiza kvaliteta obogaćenog maslinovog ulja

Prema Uredbi Komisije (EEC) br. 2568/91 [17] razvijena je metoda za određivanje slobodnih masnih kiselina (FFA) u maslinovom ulju.

2.6.2. Indeks prelamanja 

Refraktometar (Quartz/Digital Abbe refractometer, Medline Scientific Limited, Oxon, UK) je korišten za mjerenje indeksa prelamanja uzorka. Instrument je kalibriran destilovanom vodom, koja je imala indeks prelamanja od 1,3333 na 20 ◦C.

2.6.3. Kolorimetrija

Kolorimetar je korišten za određivanje boje uzoraka maslinovog ulja (Lovibond CAM-System 500, The Tintometer Ltd., Amesbury, UK). Da bi se odredila CIELAB boja, uzorak (25 mL) je stavljen u čašu od 50 mL i stavljen u kolorimetar. Definisani su psihometrijski indeks lakoće, L*, i koordinate hrominacije, a* i b*. Dodatno, formula za izračunavanje boje, ili C*, bila je sljedeća: C*=[(a*)2 plus (b*)2 ] 1/2 .

2.6.4. Spektrofotometrijsko ispitivanje u ultraljubičastom zračenju

Korištenjem spektrofotometra, metoda ultraljubičastog spektrofotometrijskog ispitivanja provedena je u skladu sa Uredbom Komisije za implementaciju br. 299/2013 [18].

2.6.5. Rancimat Method

Prema Lalasu i dr. [19], Rancimat metoda je korištena za ispitivanje oksidacijske stabilnosti uzoraka maslinovog ulja. Konkretnije, reakcione posude Rancimat 743 (Metrhom LTD, Herisau, Švajcarska) bile su napunjene sa oko 3 g svakog maslinovog ulja. Odabrani parametri su bili temperatura od 90 ◦C i protok vazduha od 15 L/h. Tačka u kojoj se brzina oksidacije brzo mijenja i stvara snažnu točku savijanja na krivulji oksidacije poznata je kao vrijeme indukcije, a predstavljena je vrijednošću indeksa stabilnosti maslinovog ulja. Ovo je bio period indukcije (IP), koji je bio dat u satima. Dodatno, ova formula je korištena za izračunavanje zaštitnog faktora (PF): PF=(IP sa antioksidansom)/(IP bez antioksidansa). Inhibiciju oksidacije lipida ukazuje zaštitni faktor veći od jedan, a antioksidativna aktivnost je poboljšana većom PF vrijednošću.

2.6.6. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) mjeri temperature i toplinske tokove povezane s prijelazima u materijalima kao funkciju vremena i temperature. Ove mjere uključuju i kvantitativne i kvalitativne podatke o fizičkim i kemijskim promjenama koje uključuju endotermne ili egzotermne procese, kao i promjene u toplinskom kapacitetu. DSC je korišten u ovom istraživanju za procjenu oksidativne stabilnosti ulja [20]. Za vaganje 5 mg ± 0,5 mg ulja korištena je posebna aluminijska posuda. Dodan je i prazan tiganj (referenca). Protok kiseonika je bio 20 mL/min, a oksidativni uslovi su programirani u Diamond DSC (PerkinElmer Inc., Shelton, CT, SAD). Uzorak i referenca su stavljeni na DSC, a termogram je pokrenut na 40 ◦C u trajanju od 1 min, a zatim na 300 ◦C brzinom od 10 ◦C/min. Temperatura početka oksidacionog vrha (Tmax) određuje početnu temperaturu oksidacije.

2.6.7. Ekstrakcija polifenolnih jedinjenja iz obogaćenih maslinovih ulja

Ekstrakcija polifenola iz maslinovog ulja izvedena je kako su opisali Kalantzakis et al. [21]. Uzorci maslinovog ulja (1 g) rastvoreni su u 2 mL n-heksana i 2 mL 60:40 (v/v) rastvora metanol/voda. Konačni rastvor je centrifugiran na 4500 rpm tokom 5 minuta nakon snažnog mešanja. Dobivena je otopina u metanolu/voda (polarna) frakcija uzoraka maslinovog ulja i korištena takva kakva je bila.

2.6.8. Ukupan sadržaj polifenola

Kao što je već spomenuto, ukupni sadržaj polifenola (TPC) određen je Folin-Ciocalteu metodom. TPC je izražen kao mg ekvivalenta galne kiseline (GAE) po kg maslinovog ulja.

2.6.9. Aktivnost čišćenja radikala

DPPH metoda, kao što je ranije spomenuto, korištena je za procjenu aktivnosti uklanjanja radikala polifenola ekstrahiranih iz uzoraka maslinovog ulja. Kapacitet čišćenja DPPH radikala izražen je kao postotak inhibicije, a IC50 je izračunat iz aktivnosti čišćenja (procenti) u odnosu na koncentracije odgovarajuće krive uzorka.

2.7. Statistička analiza

Rezultati su dati za srednju vrijednost i standardnu ​​devijaciju (SD) za tri istovremena ispitivanja. Koristeći IBM SPSS Statistics (verzija 26) statistički softverski paket (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), izvršena je jednosmjerna ANOVA da bi se utvrdilo da li postoje statistički značajne razlike između srednjih vrijednosti. Iskorišten je značajan nivo p < 0.05.

3. Rezultati i diskusija

3.1. Obnavljanje polifenola

Provedena je vodena faza koncentracije lecitina, gdje je isti postupak korišten za rekuperaciju polifenola. Zbog niske koncentracije lecitina od 1 posto, nije nastala micela surfaktanta. S druge strane, kada je postojala visoka koncentracija od 5 posto lecitina, to je smanjilo njihovu topljivost u vodi i rezultiralo stvaranjem dvije faze. I temperatura ekvilibracije (45 ◦C) i sadržaj soli (30 posto) bili su konstantni (treći oporavak). Ukupna micelarna faza tri oporavka izražena je pomoću kolone Total SP (Slika 2).

Dodatno, procedure ultrazvučne obrade (75 posto energije energije za 60, 75 i 90 min sa pulsnim ciklusom od 0,5) sa ultrazvučnom sondom su korištene za ispitivanje smanjenja veličine micela. Konačno, 0,5 posto polifenolnih disperzija dobijenih CPE metodom dodano je ulju kako bi se poboljšalo. Ovaj rezultat mogu objasniti Víctor-Ortega et al. [22], koji su otkrili da solubilizacija fenolnih spojeva na micelama surfaktanta postaje zasićena pri višim koncentracijama surfaktanta, a zadržavanje polifenola se smanjuje. Osim toga, prema Sliwa i Sliwa [23], kada je koncentracija surfaktanta ispod kritične micelarne koncentracije (CMC), topljivost aktivne tvari je niska.

U Katsoyannos et al. [24] studija, kada je primijenjeno 6 posto Triton X-114 surfaktanta, CPE tehnika u OMW (nakon uklanjanja masnih jedinjenja) proizvela je oporavak veće od 60 posto. U drugoj studiji, Gortzi et al. [25], su pokazali da je korištenjem jednostavnog i naknadnog CPE-a, ukupni oporavak fenola iz OMW sa različitim koncentracijama Genapol X‐080 (2, 5 i 20 posto, v/v) dostigao do 89,5 posto. Pored toga, Katsoyannos et al. [16], koristili su CPE u dva koraka sa 5 posto plus 5 posto Tween 80 da povrate do 94,4 posto ukupnih fenola iz OMW. Konačno, u predmetu Alibade et al. [6] studija, lecitin je korišten kao surfaktant, dok je CPE korišten za obnavljanje fenolnih spojeva iz otpada od vinskog mulja (WSL). Faze bogate surfaktantima pokazale su snažnu antioksidativnu aktivnost. Njihovi nalazi pokazuju da se CPE i lecitin mogu koristiti za uspješno odvajanje polifenola od WSL-a.

3.2. Obogaćivanje maslinovog ulja polifenolima iz otpadnih voda maslinovog ulja

Promjena u organoleptičkim svojstvima micelarne disperzije uočena je nakon 0,5 posto w/v obogaćivanja (mutnoća). Ova modifikacija dovela je do konačnog odabira obogaćivanja lecitinom od 3 posto. Da bi se postigli bolji rezultati, prvi oporavak je kombinovan sa drugim i trećim. Osim toga, sonikacija se pokazala uspješnom u smanjenju micelarne disperzije. Naftni sistem je negativno reagirao na iznose od 1 posto i 5 posto. Nakon nekoliko sati obogaćivanja, u uzorcima ulja uočen je talog.

Početni uzorak je podvrgnut CPE metodi, što je dovelo do pada koncentracije polifenola sa 3448 mg na 346 mg GAE/Kg (slika 3). Na molekularnom nivou, smanjenje broja vodoničnih veza između polifenola i vode omogućilo je ugradnju polifenola u micelu na račun njene solubilizacije [26]. Micele su zatim tretirane ultrazvučnom obradom i metanolom da bi se ekstrahovali polifenoli, povećavajući sadržaj polifenola na 1562 mg GAE/kg. Konačna koncentracija polifenola bila je 504 mg GAE/Kg (nakon ultrazvuka), što pokazuje da smanjenje micelarne disperzije dovodi do pada koncentracije ukupnih polifenola [27]. Dodatno, produženo ultrazvučno vrijeme uzrokuje otapanje čestica u rastvaraču, smanjujući TPC vrijednost [28].

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】