Određivanje uloge ishrane u starenju kože

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Utjecaj prehrane na starenje kože postao je zanimljiva tema istraživanja. Prethodne studije su se uglavnom fokusirale na blagotvorne efekte kolagenskih peptida dobijenih iz morskih organizama na kožu koja stari kada se daju oralno, dok su blagotvorni efekti kolagenskih peptida dobijenih iz peradi na kožu koja stari rijetko prijavljivana. U ovoj studiji su peptidi kolagena pripremljeni iz pileće kosti enzimskom hidrolizom, a istražen je efekat i mehanizam delovanja oralno datih kolagenskih peptida na ublažavanje starenja kože izazvanog UV zračenjem u kombinaciji sa D-galaktozom. Rezultati su pokazali da kolagen pileće kosti ima tipične karakteristike kolagena, a kolagenski peptidi pileće kosti (CP) su uglavnom mali molekularni peptidi molekulske težine od<3000 da.="" in="" vivo="" experiments="" showed="" that="" cps="" had="" a="" significant="" relieving="" effect="" on="" aging="" skin,="" indicated="" by="" the="" changes="" in="" the="" compostion="" and="" structure="" of="" the="" aging="" skin,="" improvement="" of="" skin="" antioxidant="" level,="" and="" inhibition="" of="" inflammation;="" the="" relieving="" effect="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps.="" further="" investigation="" showed="" that="" cps="" first="" reduce="" the="" level="" of="" skin="" oxidation,inhibit="" the="" expression="" of="" the="" key="" transcription="" factor="" ap-1(c-jun="" and="" c-fos),="" then="" activate="" the="" tgf-β/smad="" signaling="" pathway="" to="" promote="" collagen="" synthesis,="" inhibit="" the="" expression="" of="" mmp-1/3="" to="" inhibit="" collagen="" degradation,and="" inhibit="" skin="" inflammation="" to="" alleviate="" skin="" aging="" in="" mice.="" moreover,="" the="" skin="" transcriptome="" found="" that="" lysosomes="" activated="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" may="" be="" an="" important="" pathway="" for="" cps="" in="" anti-skin="" aging,="" and="" is="" worthy="" of="" further="" research.="" these="" results="" suggested="" that="" cps="" might="" be="" used="" as="" a="" functional="" anti-aging="" nutritional="">

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi:kolagen peptidi; protiv starenja; transkriptom kože;sinteza kolagena;lizozomi

1. Uvod

Zdravstvena era, precizno praćenje zdrave prehrane, određivanje uloge ishrane u starenju kože i odlučivanje šta jesti da bi se održala mlada i zdrava koža su teški problemi. Koža je najveći organ u tijelu, koji se sastoji od epiderme, dermisa i potkožnog sloja. Djeluje kao barijera za zaštitu tijela od vanjskih faktora, a također igra ulogu u zdravlju i ljepoti[1. Starenje kože je složen proces, koji se dijeli na hronološko starenje i fotostarenje i na koji utječu unutrašnji i vanjski faktori.cistanche stemGlavne karakteristike uključuju akumulaciju makromolekularnog oštećenja u ćeliji, opadanje funkcije matičnih ćelija (poticanje obnavljanja tkiva) i postupni gubitak fizičkog integriteta kože [2]. Glavni molekularni mehanizmi koji uzrokuju starenje kože uglavnom uključuju oksidativni stres, skraćivanje telomera, oštećenje DNK, genetsku mutaciju, regulaciju mikro-RNA, naprednu akumulaciju krajnjeg proizvoda glikacije i starenje upala 3]. Fotostarenje je epidermalna hiperplazija kože, isušivanje i degradacija ekstracelularnog matriksa izazvana ultraljubičastim zračenjem. Glavni uzrok foto-starenja su reaktivne vrste kiseonika (ROS) koje nastaju ultraljubičastim zračenjem koje posreduju u ekspresiji matriksnih metaloproteinaza (MMP) i prokolagena tipa I putem signalnih puteva kao što je signalizacija protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK). put, što dovodi do degradacije ekstracelularnog matriksa (ECM) u koži i apoptoze fibroblasta [4]. Posljednjih godina, održavanje zdravlja kože i odgađanje starenja postalo je popularno, a pronalaženje prirodnih sastojaka kao što su bioaktivni peptidi i polifenoli s antioksidativnim i anti-aging funkcijama postalo je žarište istraživanja [5].

Cistanche može protiv starenja

Međutim, kolagen ima veliku molekularnu težinu i teško se direktno apsorbira i koristi, dok peptidi kolagena male molekule nakon hidrolize kolagena imaju jaču biološku aktivnost i visoku stopu apsorpcije [6]. U međuvremenu, široka primjena kolagena u hrani, medicini, tkivnom inženjerstvu, kozmetici i drugim poljima učinila je peptide kolagena niže molekularne težine, veće efikasnosti apsorpcije i jače biološke aktivnosti novim favoritom u funkcionalnoj hrani i medicinskim istraživanjima [{{1 }}]. Peptidi kolagena su mali, sadrže 2-20 aminokiselinskih ostataka dobijenih hidrolizom kolagena. Koriste se kao dodatak prehrani za liječenje starenja kože zbog svojih potencijalnih protuupalnih i antioksidativnih funkcija i imunološke regulacije te učinaka antioksidacije i proliferacije na fibroblaste kože [10].

Nakon oralne primjene, peptidi kolagena se apsorbiraju u obliku malih peptida i brzo se transportuju u krv, a na kraju i u kidneve, kožu, zglobove i druga tkiva koja se skladište i koriste. Nakon 14 dana, nivoi radioaktivnosti su ostali visoki u koži miševa kojima su davani C14-obilježeni kolagenski peptidi.prednosti i nuspojave cistanche tubulosaPeptidi kolagena se mogu skoro u potpunosti apsorbirati i iskoristiti u tijelu, dok je stopa apsorpcije i iskorištenja kolagena samo 50-60 posto [6,11-13]. Posljednjih godina, za hidrolizate kolagena iz riblje kože, riblje ljuske, kravlje kosti, kravlje kože i svinjske kože se naširoko navodi da imaju blagotvorne učinke na ublažavanje starenja kože i da su dobili značajnu pažnju istraživača. Na primjer, kolagenski peptidi izolovani iz kože tolstolovog šarana pospješuju sintezu pro-kolagena i inhibiraju ekspresiju proteina AP-1, MMP-1 i MMP-3 aktivacijom TGF-/Smad putanje za sprečavanje razgradnje kolagena i popravku fotostarih ćelija kože [14]. Oralna primjena peptida goveđeg kolagena može poboljšati opuštanje kože, povećati sadržaj kolagena i aktivnost antioksidativnih enzima, popraviti kolagena vlakna i normalizirati omjer kolagena kože kod starijih miševa [15]. Međutim, peptidi kolagena iz različitih izvora imaju različite efekte. Količina i struktura visoko aktivnih peptida u krvi nakon oralne primjene kolagenskih peptida zavise od izvora kolagena [10]. Zaštitni efekat peptida kolagena ekstrahovanog iz kože kokoši od UVA-indukovane povrede fibroblasta bio je superiorniji od efekta kolagenskog peptida ekstrahovanog iz kože svinje, krava ili tilapije, a njegov efekat je bio ekvivalentan tripeptidu dobijenom kolagenom (Gly-Pro -Hyp)[16].

Religijska uvjerenja i zabrinutost za bolesti (kao što je kravlje ludilo) doveli su do toga da ljudi postepeno mijenjaju smjer razvoja kolagena i njegovih proizvoda sa kopnenih sisara na živinu i morske organizme|17I. Kao glavni nusproizvod prerade peradi, piletina kost je obećavajući izvor kolagenskih proizvoda. Ne samo da smanjuje rasipanje resursa i zagađenje životne sredine, već omogućava i efikasno korišćenje nusproizvoda. Stoga smo u ovoj studiji koristili peptide kolagena pilećih kostiju kao sirovine, sa golim miševima tretiranim D-galaktozom i UV za induciranje starenja kože, kao model za procjenu učinka oralne primjene peptida kolagena na ublažavanje starenja kože u miševa i odredi relevantan mehanizam.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali, hemikalije i životinje

Farme pilića Poljoprivrednog univerziteta Yunnan (Kunming, Kina) obezbijedile su istrošene kokoši, koje su odvojene, osušene i usitnjene kako bi se dobilo brašno od pilećih kostiju. Kompleti su-peroksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GSH-PX) kupljeni su od Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Peking, Kina). Hidroksiprolin (HYP), interleukin-1 (IL-1x), matriksna metaloproteinaza-1/3 (MMP-1/3), pro-kolagen tipa I i hijaluronska kiselina (HA)enzimski-vezani imunoesej(ELISA) kompleti su kupljeni od Nanjing Jiancheng Bioinženjering Instituta (Nanjing, Kina). Zdrave ženke BALB/C bezdlakih miševa (18±2g, šest sedmica) su kupljene od Nanijiing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, Kina) sa brojem dozvole: SCXK(SU)2016-0010.ekstrakt cistanche tubulosaPepsin i papain su kupljeni od Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Šangaj, Kina), a ostale hemikalije su bile analitičke kvalitete. Svi miševi su obrađeni u skladu sa propisima laboratorijske nege životinja provincije Yunnan i odobreni od strane Komiteta za negu i upotrebu životinja Poljoprivrednog univerziteta Yunnan (ID odobrenja: YAUACUC01).

2.2. Priprema kolagena i sastav aminokiselina

Ekstrakcija i sastav aminokiselina kolagena pilećih kostiju slijedili su metodu koju je opisao Liuet al. [18]sa malim modifikacijama. Prašak od pileće kosti je promiješan i natopljen u 0.05 M NaOH, 10 posto n-heksana i 0.25 M otopine EDTA (pH7,5 ) u omjeru 1/10 (m/o). U svakom koraku, uzorak je tretiran 36 h, a rastvor za namakanje se mijenjao svakih 6 h kako bi se koštani prah nabubrio, uklonili nekolagenski proteini, masti i minerali iz koštanog praha. Uzorak je nakon svakog koraka ispran čistom vodom do neutralnosti. Prethodno obrađeno brašno od pilećih kostiju pomešano je sa 0,5 M glacijalne sirćetne kiseline koja sadrži 0,1 procenat (w/v) pepsina u odnosu čvrsta i tečnost od 1:10 (w/v) i neprekidno mešano i ekstrahovano na 4 stepena za 48 č. Zatim je filtriran, a filtrat je centrifugiran na 15,000×g 15 minuta na 4 stepena. pH supernatanta je podešen na 7.5-7.8 sa rastvorom NaOH, a NaCl je dodan do konačne koncentracije od 1,5 M. Nakon što je smeša držana neometano 12 h na 4 stepena da bi se rasola, kolagen precipitat je centrifugiran na 15,000×g 15 min na 4 stepena, zatim rastvoren sa 0,5 M sirćetne kiseline, dijalizovan u čistoj vodi, osušen zamrzavanjem, a gotov proizvod je bio kolagen od pilećih kostiju.

Sastav aminokiselina kolagena kokošjih kostiju određen je automatskim analizatorom aminokiselina Sykam S433D (Minhen, Njemačka). Određena količina uzorka kolagena za testiranje uzeta je u zatvorenu epruvetu, dodana je 10 mL6 M HCl i hidrolizovana na 110C tokom 24 h. Hidrolizat je koncentriran duvanjem dušikom i ponovo otopljen u 20 mL pufera limunske kiseline. Nakon mikrofiltracije sa mikroporoznom membranom od 0,22 um, uzeto je 20 μL hidrolizata za analizu spektra aminokiselina. Sadržaj aminokiselina u uzorku izražen je u procentima.

2.3. Priprema i distribucija molekularne težine kolagenskih peptida (CP)

Prema rezultatima našeg prethodnog procesa optimizacije, CP su pripremljeni korištenjem papaina u omjeru enzima i supstrata od 1:40 (omjer mase). Nakon podešavanja pH na 7 i enzimske hidrolize na 63 stepena tokom 5 h, enzim je inaktiviran u kipućoj vodenoj kupelji 15 minuta. Enzimski hidrolizat je odsoljen i liofiliziran, ponovo otopljen u 0,1 postotnom rastvoru mravlje kiseline i centrifugiran da se dobije supernatant. Maseni spektrometar visoke rezolucije AQ Exactive HF Orbitrap-QE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), opremljen elektrosprej jonizacijom (ESI, korišten je za analizu hidrolizata kolagena u načinu punog skeniranja od 350-1800 m /z, a rezultati su preuzeti i analizirani pomoću softvera Proteome Discoverer 2.1.

2.4. Test na životinjama

Ženke BALB/C miševa bez dlake (n{{0}}) držane su u prostoriji pod kontrolisanim uslovima temperature (24±1 stepen), vlažnosti (60 ±5 procenata) i 12 h dan-noć ciklus za jednu sedmicu. Omogućen im je ad libitum pristup hrani i vodi. Nakon jedne sedmice adaptacije, miševi su nasumično podijeljeni u sljedećih pet grupa (n=11 po grupi):(i). Normalna grupa (N): UV neeksponirani; oralna primjena 0.4 mL fiziološke otopine dnevno. (ii). Grupa modela (M): izložena UV zračenju plus D-galaktoza (0,2 mL); oralna primjena 0,4 mL fiziološke otopine dnevno.

(i). Grupa kolagenskih peptida niske doze (LCPs): izložena UV zračenju plus D-galaktoza (0.2 mL); oralni

davanje 0.4 mL CPs (doza: 200 mg:kg-1 tjelesne težine) dnevno.

(iv). Grupa kolagenskih peptida srednje doze (MCP): izložena UV zračenju plus D-galaktoza; oralno

davanje 0.4 mL CP (doza: 500 mg·kg-1 tjelesne težine) dnevno.

(v). Grupa kolagenskih peptida visoke doze (HCPs): izložena UV zračenju plus D-galaktoza; oralna administracija-

doza od 0.4 mL CP (doza: 1000 mg kg-1 tjelesne težine) dnevno.

Tretman D-galaktozom je izveden potkožnom injekcijom 0.2 mL 10 procentne otopine D-galaktoze u stražnji dio vrata miša (doza:1.0g/ kg-1tjelesne težine) dnevno. UV zračenje je izvedeno sa 40 W UVA{9}} LAMIP (O-panel, Cleveland, SAD, vršna talasna dužina: 340 nm), rastojanje između lampe i zadnje strane miševa je 30 cm (230 m J/cm). -), a zračenje je trajalo 30 min svaki dan sedam sedmica (49 dana). Intenzitet zračenja mjeren je UVA365-radiometrom (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Kina). Jedan sat nakon tretmana D-galaktozom i UV zračenjem, miševima je davano 0,4 mL CP oralno svaki dan. Nakon posljednjeg zračenja, miševi su anestezirani, izvagani, a tkiva su uzorkovana za naknadnu analizu.

2.5. Vlažnost kože, visceralni indeks i povećanje tjelesne težine

Vlažnost kože je određena prema ISO 1442, a visceralni indeks je izračunat korištenjem sljedeće jednačine: visceralni indeks (g/kg)= visceralna težina/tjelesna težina.

2.6. Oksidacijski stres, HA i HYP sadržaj kože

Uzorci kože su homogenizovani sa devet puta većom količinom normalnog fiziološkog rastvora (w/w) u ledenoj kupki sa homogenizatorom tkiva (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, Kina), a zatim centrifugirani na 2000 ×g i 4 stepena 10 min. Aktivnosti superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GSH-PX), te sadržaj hijaluronske kiseline (HA) i hidroksiprolina (HYP) u prikupljenom supernatantu određivani su metodom opisanom u uputstva koja odgovaraju odgovarajućim kompletima.

2.7. Histološki pregled kože

Uzorci mišje kože su fiksirani u 4% rastvoru paraformaldehida tokom 24 h, dehidrirani, stavljeni u parafin i isečeni. Presjeci kože su obojeni hematoksilinom i eozinom (HE) i promatrani ECLIPSE CI-E fluorescentnim mikroskopom (Nikon, Japan). Debljina epidermisa i dermisa kože procijenjena je pomoću softvera Halcon 13.0.1.1 (MVTec, Minhen, Njemačka).

2.8. Sekvenciranje transkriptoma kože

2.8.1. Ekstrakcija RNK, izgradnja biblioteke i sekvenciranje transkriptoma

Ukupna RNK je ekstrahirana iz kože miševa pomoću RNeasy Mini Kit (Tiangen Bio-chemical Technology Co., Ltd., Peking, Kina) prema uputama proizvođača. Čistoća i koncentracija RNK provjerene su pomoću kaiaoK5500Spectrophoto-metra (Kaiao, Peking, Kina); Integritet RNK je procenjen korišćenjem RNA Nano 6000 Assay Kit i Bioanalyzer 2100 sistema (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Analizu transkripcionog sekvenciranja svakog uzorka izvršila je Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Kina). Ukratko, grupisanje indeksno kodiranih uzoraka izvedeno je na cBot sistemu za generisanje klastera koristeći HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(llu-mina) prema uputstvima proizvođača. Nakon generisanja klastera, biblioteke su sekvencionirane na Ilumina platformi i generisana su čitanja uparenih krajeva od 150 bp.

2.8.2. Bioinformatičke analize podataka RNA-sekvenciranja

Genska ontologija(GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analiza obogaćivanja diferencijalno eksprimiranih gena (DEG) obavljena je korištenjem paketa klaster analizatora jezika R. Kada je p-vrijednost bila manja od 0.05, stavke i putevi obogaćeni GO i KEGG-om smatrani su značajnim.

2.8.3. Lančana reakcija reverzne transkriptaze-polimeraze (qRT-PCR)

QRT-PCR je izveden kao što je prethodno opisano [19].

2.9. Wester Blot

Prema metodi koju su opisali Park et al. [20], izvedena je Western blot (WB) analiza kako bi se kvantifikovala ekspresija proteina povezanih sa starenjem kože kod miševa. Koncentracija proteina lizata kože u svakoj tretiranoj grupi je kvantificirana korištenjem BCA kompleta, odvojena SDS-PAGE (10 posto akrilamidnog gela), prebačena na PVDF membranu, blokirana sa 5 posto obranog mlijeka i inkubirana s odgovarajućom količinom primarnog antitela (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 i -aktin) na 4 stepena preko noći. Nakon ispiranja sa TBST, uzorci su pomešani sa sekundarnim antitelima i inkubirani na sobnoj temperaturi 1 h.cistanche tubulosa recenzijeChemiDoc XRS plus hemiluminiscencijski gel imager (BioRAD, Hercules, Kalifornija, SAD) korišten je za detekciju specifičnih proteina. Image] softver je korišten za kvantifikaciju ekspresije ciljnog proteina u svakoj tretiranoj grupi, a rezultati su predstavljeni vrijednostima gustine normalizirane na protein -aktin.

2.10.ELISA

Nivoi ekspresije MMP-1, MMP-3, tip I pro-kolagena i IL-1i u tečnosti za lizu kože određeni su enzimskim imunotestom. Analiza je provedena prema uputama priloženim uz komplet.

2.11.Statističke analize

Svi rezultati su analizirani pomoću softvera SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, SAD) kroz jednosmjernu analizu varijanse (ANOVA) i Duncanov test višestrukog raspona, sa nivoom značajnosti postavljenim na p<0.05. originpro="" 2017(originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" deviation="">

3. Rezultati i diskusija

3.1.Aminokiselinski sastav kolagena

Sastav aminokiselina kolagena pilećih kostiju prikazan je u Tabeli 1. Gly je bila glavna aminokiselina u uzorcima, koja je činila skoro jednu trećinu (27.86 posto) ukupnih aminokiselina, a Hyp je bio specijalna aminokiselina u kolagenu, koja čini 9,83 posto. Glavne karakteristike molekula kolagena bile su ponovljene Gly-XY sekvence i jedinstvena trostruko spiralna struktura sastavljena od tri lanca. Gly je činio otprilike jednu trećinu ukupnih aminokiselina, X i Y su često bili prolin i hidroksiprolin, ili su mogli biti bilo koji ostatak [21]. Aminokiselinski sastav uzorka bio je sličan onom kod kolagena kokošjih kostiju opisan u prethodnim studijama i imao je tipične karakteristike kolagena [22].

3.2. Raspodjela molekularne težine CP

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da (Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da, 65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 posto). Međutim, njemačka kompanija Gelita je kroz nekoliko kliničkih studija pokazala da je učinak kolagenskih peptida uglavnom određen stepenom njihovog podudaranja sa svojstvima kolagenskih peptida nakon razgradnje ljudskog kolagena, a ne molekulskom težinom kolagenskih peptida. Utvrdili su da proizvod VERISOL③ sa prosječnom molekulskom težinom od 2000 Da ima najstimulativnije djelovanje na fibroblaste kože, dok proizvod FortigelTM sa prosječnom molekulskom težinom od 3000 Da ima poseban učinak na popravku hrskavice [25-27].

3.3. Učinak oralnih CP na ublažavanje starenja kože

3.3.1.Tjelesna težina i indeks organa

Indeks tjelesne težine i indeks organa su važni i odražavaju zdravstveno stanje miševa. Težina miševa u svakoj grupi se normalno povećavala tokom perioda testiranja (Tabela 2). Prosječno povećanje na težini u grupi M je bilo niže nego u grupi N, a kod grupa koje su tretirane CP bilo je veće od onih u M grupi, što sugerira da CP nisu imali nuspojave na miševe. U prethodnim izvještajima, doza miševa tretiranih kolagenom peptidom bila je uglavnom između 100-1000 mg/kg.bw·d, a sigurna doza kolagenskih peptida tilapije dostigla je 4,07 g/kg.bw·d [{{6} }]. Slično, rast miševa ostarjelih na koži nakon sonde s kolagenskim peptidima tilapije (doze: 500 i 1000 mg/kg·tw·d) je također bio sličan našim rezultatima [29]. Slezena igra važnu ulogu u humoralnom i ćelijskom imunitetu, pa se indeks slezine često koristi za procenu funkcije imunog sistema.cistanche UKThe liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups (p >0.05). Rezultati su bili slični onima iz prethodnih studija [30], što ukazuje na to da su CP sigurni i da bi mogli malo poboljšati imunitet miševa.

3.3.2. Sastav kože

Tretman UV i D-galaktozom (M grupa) značajno je smanjio sadržaj vlage, HA i Hyp u koži, u poređenju sa onima iz N grupe, za 13,36 posto, 24,08 posto, odnosno 15,83 posto (p<0.05)(table 2).="" the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Promjene u sadržaju vlage u koži uzrokuju bore i opuštenost kože i na njih utiču komponente matriksa kao što su kolagen kože i HA[31]. Hidroksiprolin je stabilna, bogata i posebna aminokiselina u kolagenu, a njen sadržaj može indirektno odražavati sadržaj kolagena u koži, kao i starenje kože. Dodatno, važnu ulogu ima HA, koji je visoko izražen u ECM-u kože. u kontroli ravnoteže vode u koži, osmotskog pritiska, zadržavanja vlage i elastičnosti kao sistema skladištenja vode i strukturne komponente kože [32]. U ovoj studiji, sadržaj vlage, HYP i HA u koži se značajno povećao nakon uzimanja CP, što bi moglo biti povezano sa promocijom sinteze kolagena i HA od strane CP. Štaviše, povećanje HYP i HA povećalo je sadržaj vlage.

3.3.3. Histološke promjene kože

Histološke promjene kože leđa miševa nakon sedam sedmica kontinuiranog tretmana prikazane su na slici 2. Stareća koža M grupe pokazala je karakteristike grube površine, zadebljale epiderme, istanjenog dermisa i rijetkih ćelija u odnosu na kožu grupa N. Međutim, stanje starenja kože kod miševa se poboljšalo nakon oralne primjene CP, održavajući glatku, urednu i kompletnu strukturu sličnu onoj kod miševa N grupe. Tako je dermis kože bio značajno tanji, a epidermis značajno deblji u M grupi nego u N grupi (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously="" [4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" in="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Nivoi antioksidansa i upale kože

Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima je najčešće korištena metoda za procjenu nivoa antioksidansa u tijelu [28]. Kao što je prikazano na slici 3, aktivnosti CAT, SOD, GSH-Px i MDA sadržaja u M grupi bile su značajno niže od onih u N grupi (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-pxactivities,and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,="" and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activate="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrixcollagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Osim toga, ćelijski upalni odgovor uzrokovan ROS također doprinosi starenju kože. Nakon tretmana UV i D-galaktozom (Mgroup), sadržaj IL-lo u koži miševa značajno se povećao u odnosu na onaj u N grupi (Slika 3D ), što ukazuje da je koža pokazala značajan upalni odgovor (str<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05),indicating that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the'o,="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Mehanizam djelovanja dijetetskih CP u ublažavanju starenja kože

3.4.1.Analiza i validacija RNA-Seq podataka

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GOenrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A) and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B). The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group (Figure 4A,B). Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs,4303 genes were significantly expressed in the mice skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" sixgenes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes="" (including="" fos,="" jun,="" cxcll,and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated="" (figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

Analiza GO obogaćivanja i analiza obogaćivanja baze podataka KEGG pružile su podršku za dalje istraživanje bioloških funkcija DEG-a. GO analiza je pokazala da su DEG značajno obogaćeni biološkim procesima kao što su replikacija DNK, regulacija hemopoeze, regulacija aktivnosti hidrolaze i proizvodnja citokina; u ćelijskim komponentama, koje su uključivale litičku vakuolu i lizozom, značajno su obogaćeni geni koji sadrže kolagen i drugi srodni geni; u smislu molekularne funkcije, aktivnosti receptora-liganda, aktivnosti citokina i drugih srodnih gena su značajno obogaćeni (Slika 5). KEGG analiza obogaćivanja prvih 20 signalnih puteva značajno izmijenjenih DEG-ovima prikazana je na slici 5. Interakcija citokina i receptora, lizozoma, neuroaktivne interakcije ligand-receptora, ćelijskog ciklusa, sistemskog eritematoznog lupusa i TGF-puta (p<05) were="" closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" or-ganelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" diferentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors[40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging[14].="" gene="" functional="" enrichment="" anal-ysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41].="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Provjera mehanizma djelovanja CP u ublažavanju starenja kože

Da bi se potvrdila uloga TGF-signalnog puta i interakcije citokina-receptora u ublažavanju starenja kože oralnim CP, izvršena je WB analiza kako bi se potvrdio TGF- i transkripcijski faktor Smad2/3 u TGF-signalnom putu, kao i ključ transkripcijski faktor AP-1 (c-Fos i c-Jun) koji reguliše citokine. Sadržaj MMP-1, MMP-3, tip I pro-kolagena i IL-1 je određen ELISA-om. Rezultati WB analize su pokazali da je ekspresija TGF-, Smad2 i Smad3 u grupi M bila značajno niža nego u grupi N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner(figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" mgroup="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp="" group=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

AP-1 protein je dimerni kompleks proteina porodice Jun i Fos i važan je regulator upale kože i ekspresije citokina. Generalno, kompleks sastavljen od c-Jun i c-Fos pokazuje najveću transkripcionu aktivnost u koži [41,A42]. ROS proizveden u stanicama stare kože prvo aktivira AP-1 protein, a zatim reguliše nizvodne citokine (kao što je IL-1), MMP i TGF-signalni put kroz transkripciju i translaciju, čime se olakšava starenje kože[43 ,44]. TGF-/Smad signalna reakcija je klasičan put sinteze kolagena, a Smad transkripcijski faktor je u srži ovog puta transdukcije signala. TGF- pokreće fosforilaciju i aktivaciju nizvodnih Smad2 i Smad3 vezivanjem za receptor, čime se povećava sinteza COLI [14].

Dodatno, rezultati ELISA-e su pokazali da je sadržaj MP-1,MMP-3 i IL-1a u koži M grupe bio značajno veći nego u N grupi, a sadržaj Typel pro-kolagena bio je značajno manji (str<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,mmp-3,and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1o="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Pored gore navedenih puteva, u ovoj studiji, geni sa povećanom regulacijom nakon tretmana CP su značajno obogaćeni putem lizosoma, što ukazuje da je CP tretman aktivirao lizozom u koži (Slika 5). Prethodne studije pokazuju da aktivirani lizozomi čiste agregate i podižu aktivaciju ostarjelih neuralnih matičnih ćelija tokom starenja [45]. Pored toga, povećana funkcija lizosoma može smanjiti koncentraciju intracelularnog ROS-a kako bi se spriječilo mirovanje stanica. Slično, svako smanjenje funkcije lizosoma može povećati unutarćelijsku koncentraciju ROS-a što u konačnici potiče mirovanje stanica [46]Iako to nismo sistematski potvrdili u ovom radu, ovi rezultati i prethodni izvještaji impliciraju da bi aktivacija lizosomske funkcije mogla biti glavni način za CP za ublažavanje starenja kože, a mi ćemo nastaviti s ciljem da to provjerimo.

Stoga je ova studija pokazala da dijetalni CP mogu ublažiti starenje kože izazvano UV i D-galaktozom na način ovisan o dozi. CP ublažavaju starenje kože smanjujući nivo oksidacije kože, inhibirajući ekspresiju ključnih transkripcijskih faktora AP-1(c-Jun i c-Fos), aktivirajući TGF-/Smad signalni put za promoviranje sinteze kolagena, inhibirajući ekspresiju MMP-1 i MMP-3 (koji inhibiraju degradaciju kolagena) i inhibiraju upalu kože kako bi ublažili starenje kože (Slika 8). Štaviše, naši nalazi u trenutnoj studiji također sugeriraju da aktivirani lizozom može biti važan put za CP za regulaciju starenja kože, što zaslužuje posebnu pažnju.

4. Zaključak

Ukratko, ova studija je potvrdila da dodatak ishrani kolagenskih peptida pilećih kostiju može značajno ublažiti starenje kože izazvano ultraljubičastim zračenjem i D-galaktozom kroz više puteva, koji uključuju promicanje sinteze pro-kolagena, inhibiranje degradacije kolagena, poboljšanje nivoa antioksidansa u koži, i inhibiranje upale; ublažavanje je bilo ovisno o dozi kod CP. Detaljno istraživanje je pokazalo da CP prvo smanjuju nivo oksidacije kože, inhibiraju ekspresiju ključnog faktora transkripcije AP-1(c-Jun i c-Fos), a zatim aktiviraju TGF-/Smad signalni put za promociju sintezu kolagena, inhibiraju ekspresiju MMP-1 i MMP-3 kako bi inhibirali degradaciju kolagena i inhibirali upalu kože kako bi ublažili starenje kože kod miševa. Osim toga, aktivacija lizosoma također može biti glavni put za CP za ublažavanje starenja kože, što je vrijedno naknadnog istraživanja i verifikacije. Ovi rezultati pružaju teorijsku osnovu za implementaciju kolagenskih peptida za ublažavanje starenja kože i širenje opsega za sveobuhvatnu upotrebu nusproizvoda životinjskog podrijetla u funkcionalnoj hrani.

Ovaj članak je preuzet iz Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients