Ciklopentanon djeluje protiv melanogeneze i protiv bora kod B16F10 melanoma

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 i Hyung Ryong Moon 1, 2,*

sažetak:Izloženost ultraljubičastom (UV) zračenju primarni je uzrok vanjskog starenja kože, što dovodi do hiperpigmentacije kože i bora. U ovoj studiji smo istraživali efekat izbjeljivanja (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanona (BHCP) na B16F10 melanom i njegov anti- aktivnost bora na ćelijama Hs27 fibroblasta. Utvrđeno je da BHCP snažno inhibira tirozinazu, sa vrijednostima koncentracije inhibicije od 50 posto (IC50) od 1,10 μM i 8,18 μM formikofenolata (L-tirozin) i difenolaze (L-DOPA), a studija kinetike enzima otkrila je da je BHCP-tip kompetitivni inhibitor inhibicije inhibicije. . Nadalje, BHCP je značajno inhibirao sadržaj melanina i aktivnost ćelijske tirozinaze i snizio nivoe transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF), fosforilisanih nivoa proteina koji vežu elemente cAMP odgovora (CREB) i tirozinaze u hormonu koji stimulira melanocite (-MSH) B16F10 ćelije melanoma. Štaviše, BHCP je inhibirao fosforilaciju p65 i ekspresiju matriksnih metaloproteinaza (MMP-1, MMP-9, MMP-12 i MMP-13) u Hs27 fibroblastima stimulirani UV zračenjem. Stoga naši rezultati pokazuju da BHCP može biti dobar kandidat za razvoj terapeutskih sredstava za bolesti povezane s hiperpigmentacijom i borama.

Ključne riječi: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanon (BHCP); inhibitor tirozinaze; anti-melanogeneza; protiv bora

Cistanche jeprotiv bora.

1. Uvod

Starenje kože je složen i progresivan proces koji dovodi do funkcionalnih i estetskih promjena na koži, pri čemu su odgovorni i unutarnji i vanjski faktori [1]. Ekstrinzično starenje kože uzrokovano je agresorima iz okoline, kao što su ultraljubičasto (UV) zračenje, stres ili pušenje. Međutim, to je uglavnom uzrokovano ponovljenim izlaganjem UV zračenju od sunca, što se naziva fotostarenje. Fotostarenje kože karakteriziraju grube i duboke bore, debljina, hrapavost, dispigmentacija i histološke promjene [2–4].

Tirozinaza (EC 1.14.18.1), koja je također poznata kao polifenol oksidaza, jedan je od multifunkcionalnih enzima koji sadrže bakar uključenih u sintezu melanina i široko se nalazi u prirodi [5]. Tirozinaza je tipično prisutna u većini mikroorganizama, biljaka, i životinje. U biljkama tirozinaza djeluje oksidacijom monofenola u difenole (aktivnost mikofenolata) i uključena je u oksidaciju o-difenola u o-kinone (aktivnost difenolaze), nakon čega slijedi oksidacija kinona u tamno-smeđe pigmente [6].

Melanogeneza je transformacija L-tirozina u 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), pri čemu se L-DOPA pretvara u DOPA kinin [7]. Dakle, tirozinaza igra važnu ulogu u proizvodnji melanina u melanocitima, a inhibicija tirozinaze je atraktivna meta za poboljšanje poremećaja povezanih s pigmentacijom i za razvoj sredstava za izbjeljivanje [8,9]. Sintezu melanina inducira nekoliko stimulansa, kao što su UV i kemikalije uključujući izobutilmetilksantin (IBMX) i alfa-melanocit-stimulirajući hormon (-MSH). -MSH se vezuje za svoj receptor melanokortin 1 receptor (MC1R), a zatim povećava nivo citoplazmatskog cikličkog AMP(cAMP). Povećani nivo cAMP aktivira protein kinazu A (PKA), koja inducira ekspresiju transkripcionog faktora povezanog sa mikroftalmijom (MITF) putem fosforilacije cAMP proteina koji veže elemente odgovora (CREB). MITF inducira ekspresiju tirozinaze, proteina povezanog s tirozinazom (TRP)-1 i TRP-2, što konačno rezultira povećanom sintezom melanina [10]. MITF se smatra ključnim faktorom transkripcije melanogeneze; stoga su provedena mnoga istraživanja za kontrolu ekspresije MITF-a za inhibiciju melanogeneze [11].

Poznato je da je formiranje bora usko povezano s degradacijom ekstracelularnog matriksa kože, a UV zračenje aktivira nuklearni faktor-κB (NF-κB), čime se povećava proizvodnja fragmentacije kolagena i matriksnih metaloproteinaza (MMP) [2]. MMP su endopeptidaze zavisne od cinka koje su važne u remodeliranju strukture ekstracelularnog matriksa u koži. Stoga je pretjerana degradacija kolagena i matriksa od strane UV-indukovanih MMP-ova karakteristična karakteristika fotooštećene kože, a MMP-ovi se koriste kao glavni marker UV-induciranog fotostarenja, kao i upale kože [12].

Derivati ​​skeleta dijarilheptanoida slični kurkuminu uključuju antioksidante, prijavljeni antikancer, aktivnosti.skele, uključujući (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopenton (BHCP) (slika 1),da pokaže širok spektar anti-inflamacije, anti-melanogeneze, posebno Leow et al. [19] objavljene u bioaktivnostima, i anti-tirozinaza [13–18]dibenziliden-ciklopentanon 2014, koje mogu doprinijeti zaštitnim efektima na humani osteosarkom putem regulacije Wnt/-catenin signalnog puta. Međutim, efekti BHCP-a protiv melanogeneze i protiv bora još uvijek nisu otkriveni, a molekularni mehanizmi koji su u osnovi njegove aktivnosti još uvijek nisu jasno utvrđeni.

Slika 1. Struktura (2E,5E)-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanona (BHCP).

U ovoj studiji, istraživali smo antimelanogenezu i potencijal BHCP-a protiv bora, te nastojali identificirati uključeni mehanizam, posebno u pogledu sadržaja melanina i aktivnosti ćelijske tirozinaze, koji su istraženi korištenjem testa inhibicije tirozinaze i analize kinetike enzima. Štaviše, pokazali smo da BHCP ispoljava inhibitorni efekat na melanogenezu i bore koji je povezan sa smanjenjem CREB/MITF/tirozinaze u -MSH-induciranim B16F10 ćelijama mišjeg melanoma i inhibicijom fosforilacije ekspresije p65 i MMP u UV-indukovanim humanim fibroblastima H27.

dragon herbs cistanche

2. Rezultati i diskusija

2.1. Sinteza (2E,5E)-2,5-bis(3-hidroksi-4-metoksibenziliden)ciklopentanona (BHCP)

Rastvor {{0}}hidroksi-4-metoksibenzaldehida (100 mg, 0.66 mmol, izovanilin) ​​i ciklopentanona (0,03 mL, 0,33 mmol) u 1 N rastvoru HCl-sirćetne kiseline (0,02 mL) je mešana na 25 ◦C 2 h. Nakon stajanja 1 dan, reakciona smjesa je tretirana hladnom vodom u prisustvu male količine metanola, filtrirana i isprana hladnom vodom da bi se dobio BHCP (65,9 mg) u prinosu od 56,9 posto. BHCP je identificiran spektroskopskim metodama, uključujući 1H i 13C-NMR, kao i poređenjem sa objavljenim spektralnim podacima i analizom tankoslojne hromatografije (TLC) [19]. Struktura je prikazana na slici 1.

BHCP: žuti amorfni prah (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28 (s,2H,2×vinilH), 7,14 (d, 2H , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M − H)−.

2.2. Inhibicijski učinak BHCP-a na aktivnost tirozinaze gljiva

Kao što je prikazano u tabeli 1, BHCP je inhibirao tirozinazu sa IC50 vrijednostima od 1,10 ± 0,12 µMand 8,18 ± 0,44 µM, dok je kojična kiselina (pozitivna kontrola) imala IC50 vrijednosti od 18,68 ± 1,40 ± 1,40 ± 1,40 µM. μM za monofenolazu i difenolazu, respektivno. U našoj prethodnoj studiji sintetičkih potencijalnih inhibitora tirozinaze, pronašli smo mehanizam kroz studije molekularnog modeliranja prema kojima 3-hidroksi i 4-metoksi grupe benzilidena imaju velike tendencije vezivanja za aktivno mjesto tirozinaze [20]. Iz rezultata ovog istraživanja pokazalo se da su njegove funkcionalne grupe (3-hidroksi i 4-metoksi grupe) povezane sa značajnim povećanjem aktivnosti inhibicije tirozinaze.

Tabela 1. Inhibicijska aktivnost tirozinaze i enzimska kinetička analiza BHCP-a.

Nadalje, mehanizam odgovoran za inhibiciju tirozinaze BHCP-om je istražen enzimskom kinetičkom analizom u ovoj studiji (Tabela 1 i Slika 2). Lineweaver-Burk grafikoni su nacrtani na osnovu podataka dobijenih iz kinetičkih studija, a konstanta inhibicije (Ki) je dobijena iz Dixonovih dijagrama. Lineweaver-Burk dvostruki recipročni dijagrami ukazuju na inhibiciju kompetitivnog tipa. Kao što je prikazano na slici 2a–c, BHCP je djelovao kao kompetitivni inhibitor i L-tirozina i L-DOPA. Štaviše, presjeci na x-osi Dixonovih dijagrama su obično koristi se za određivanje tipova konstanti inhibicije enzima (Ki) za kompleks enzim-inhibitor [21,22], gdje vrijednost osi x pokazuje vrijednost −Ki. Kao što je prikazano na slici 2b–d, Ki vrijednosti BHCP-a bile su 1,7 μMand 10,5 μM kao supstrati za L-tirozin i L-DOPA, respektivno. Kako vrijednost Ki predstavlja koncentraciju potrebnu za formiranje kompleksa enzim-inhibitor, niža vrijednost Ki ukazuje na efikasniju inhibiciju protiv tirozinaze.

Slika 2. Lineweaver-Burk (a,c) i Dixon (b,d) grafikoni za inhibiciju enzima tirozinaze pomoću BHCP-a.

2.3. Učinci BHCP-a na vitalnost stanica B16F10 melanoma i Hs27 ćelija fibroblasta

Prije utvrđivanja da li BHCP ima bilo kakvu antimelanogenezu i djelovanje protiv bora, ispitali smo citotoksičnost BHCP na B16F10 ćelije i Hs27 ćelije tretiranjem različitim koncentracijama BHCP-a u različitim vremenskim intervalima, a vitalnost ćelija je izmjerena EZ-Cytox testom. Kao što je prikazano na slici 3a,b, do 10 μM BHCP tokom 48 sati nije smanjilo preživljavanje ni B16F10 ćelija ni Hs27 ćelija. Nakon toga, provedene su daljnje in vitro studije o antimelanogenezi i aktivnostima BHCP-a protiv bora sa 1, 5 i 10 μM.

2.4. Inhibicija BHCP-a protiv sadržaja melanina i aktivnosti ćelijske tirozinaze u B16F10 ćelijama melanoma

Da bi se utvrdilo da li BHCP ispoljava inhibitorni potencijal na sadržaj melanina u ćelijama B16F10 izazvanim -MSH, ćelije su prethodno tretirane naznačenim različitim koncentracijama (1, 5 i 10 μM) BHCP ili kojične kiseline (5 mM) tokom 24 sata, a zatim su stimulirane. sa -MSH tokom 48 h. Kao što je prikazano na slici 4a, sadržaj melanina u ćelijama tretiranim sa BHCP u prisustvu -MSH smanjio se na način koji zavisi od koncentracije, pokazujući 113 procenata na 1 μM, 106 procenata na 5 μM i 102 procenata na 10 μM, u poređenju sa kontrolna grupa lečena samo -MSH (186 procenata). Zanimljivo je da je BHCP (1 μM) jače inhibirao sadržaj melanina od kojične kiseline (5 mM). Nadalje, proveden je test aktivnosti ćelijske tirozinaze kako bi se izmjerio inhibitorni efekat BHCP na B16F10 ćelije. Kao što je prikazano na slici 4b, BHCP se smanjio na način ovisan o koncentraciji sa aktivnošću tirozinaze za 120 procenata na 1 μM, 116 procenata na 5 μM i 105 procenata na 10 μM, u poređenju sa kontrolnom grupom lečenom samo -MSH (181 procenat). Inhibicijski efekat BHCP-a bio je mnogo snažniji od koične kiseline; inhibicija BHCP-a na 1 μM bila je superiornija od one kod kojične kiseline na 5 mM (131 posto). Ovi rezultati sugeriraju da BHCP ima efekat izbjeljivanja tako što inhibira biosintezu melanina i intracelularnu sintezu tirozinaze u B16F10 melanocitima.

Slika 4. Inhibicija sadržaja melanina (a) i aktivnosti ćelijske tirozinaze (b) BHCP-a na B16F10 melanomskim ćelijama.

2.5. Efekti BHCP-a na ekspresiju MITF/tirozinaze i fosforiliranog CREB-a u B16F10 ćelijama

MITF, specifični faktor transkripcije, igra ključnu ulogu u efikasnom aktiviranju melanogenih gena, uključujući tirozinazu, katalizujući korak koji ograničava brzinu u biosintezi melanina: TRP-1 i TRP-2. Ekspresija MITF bi mogla biti povećan fosforilacijom CREB-a [23]. CREB je važan MITF promotor [24,25], a fosforilacija CREB-a u melanocitima povećava ekspresiju MITF-a vezivanjem za CREB (c-AMP odgovor element-vezujući protein) u melanocitima [26]. Da bismo razjasnili molekularne puteve odgovorne za antimelanogeni efekat BHCP-a na B16F10 ćelije, ispitali smo nivoe proteina ključnih molekula, uključujući CREB i MITF, koji igraju važnu ulogu u melanogenezi pomoću Western blot analize. Ćelije su tretirane BHCP ili kojičnom kiselinom, a zatim stimulisane -MSH tokom 48 h. Vremenski interval za mjerenja slijedio je metodologiju opisanu u prethodnim studijama [27]. Kao što je prikazano na slici 5, nivoi tirozinaze i MITF su porasli sa -MSH, ali BHCP je smanjio ove nivoe proteina. Nadalje, BHCP je značajno potisnuo fosforilaciju CREB-a. Poznato je da je regulacija -MSH-indukovane CREB fosforilacije potencijalno važna u regulaciji pigmentacije [28]. Ovi rezultati ukazuju na to da antimelanogeni efekti BHCP-a proizlaze iz smanjenja MITF-a i tirozinaze putem smanjenja fosforiliranog CREB-a. Ova studija sugerira da je rasvjetljavanje mehanizma inhibicije BHCP na tirozinazu i melanogenezu ključno i da se mora dalje istraživati ​​u budućnosti. Iako je ćelijska linija melanoma B16F10 općenito prikladnija za ispitivanje signalnih mehanizama in vitro, ćelijska linija B16F10 je melanoma glodara. Stoga će biti potrebne daljnje studije na ljudskim melanocitima kako bi se potvrdili nalazi.

2.6. Učinak BHCP-a na aktivaciju NF-κB p-p65 u Hs27 ćelijama izazvanu UV zračenjem

Zatim smo istraživali učinak BHCP-a na ekspresiju inflamatornih medijatora izazvanu UV zračenjem koristeći Hs27 fibroblaste. Ranije je objavljeno da je fosforilacija p65 (Ser536) ključna za njegovu sposobnost da transaktivira gene [29]. Stoga su nivoi proteina p-p65 (Ser536) i p65 ispitani u frakciji jezgra pomoću Western blotinga. Kao što je prikazano na slici 6a,b, u Hs27 ćelijama, UV je povećao nivoe proteina p-p65 (Ser536) u jezgru, dok je tretman BHCP smanjio nivoe proteina p-p65 (Ser536) u jezgru. U skladu s tim, ukupna količina p65 je smanjena u citoplazmi UV i obnovljena pomoću BHCP (Slika 6c,d). Iako su nivoi ekspresije proteina p65 smanjeni u citoplazmi i povećani u jezgru nakon UV indukcije, prethodni tretman sa BHCP preokrenuo je ove trendove na način ovisan o dozi. Dakle, ovi rezultati sugeriraju da bi inhibicija p-p65 od strane BHCP-a mogla doprinijeti zaštitnim efektima na pigmentaciju kože i uništavanje kolagena od UV zračenja.

Slika 6. Efekti BHCP-a na nivoe ekspresije p-p65 (Ser536) u UV-indukovanim Hs27 ćelijama humanih fibroblasta.

2.7. Učinak BHCP-a na ekspresiju MMP u Hs27 ćelijama

MMP igraju vitalnu ulogu u starenju kože. UV zračenje mijenja vezivno tkivo kože povećavajući ekspresiju MMP [30,31]. MMP-1 je enzim koji razgrađuje kolagen koji ubrzava razgradnju kolagena sintetiziranog iz prokolagena tipa I. MMP-9 je enzim koji razgrađuje želatinu i razgrađuje kolagena vlakna presečena MMP-1, povećavajući stvaranje bora i gubitak elastičnosti. Da bismo ispitali efekat BHCP-a protiv bora protiv UV indukcije, odredili smo nivoe MMP-1 i MMP-9 proteina Western blottingom. Nadalje, ćelije izazvane UV zračenjem pokazale su značajno povišen nivo MMP-13, što pokreće degradaciju kolagena tipa I i III umjesto MMP-1 [32]. Istraživali smo povećanje MMP-a (MMP1, MMP9, MMP12 i MMP13) nakon tretmana UV-induciranih Hs27 ćelija BHCP-om pri 1 i 10 μM. Kao što je prikazano na Slici 7, nivoi ekspresije MMP-1, MMP-9, MMP-12 i MMP-13 povećani su nakon UV indukcije; međutim, BHCP tretman je smanjio ekspresiju u dozi -zavisan način. Naši rezultati sugeriraju da BHCP može doprinijeti prevenciji stvaranja bora smanjenjem abnormalne proizvodnje MMP izazvane izlaganjem UV zračenju. Ovi rezultati impliciraju da BHCP inhibira ekspresiju MMP u Hs27fibroblastima kako bi spriječio razgradnju kolagena, a time i stvaranje bora. Stoga, BHCP pokazuje potencijal za upotrebu kao lijek za prevenciju i liječenje kožnih bolesti.

prednosti cistanche stabljike

3. Materijal i metode

3.1. Hemikalije i instrumentacija

Tirozinaza gljiva (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tirozin, 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dimetil sulfoksid (DMSO) i koična kiselina kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Dulbeccov modifikovani Eagleov medijum (DMEM), fetalni goveđi serum, streptomicin i amfotericin kupljeni su od Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, Kalifornija, SAD). Antitijela protiv MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tirozinaze, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , i -actin su kupljeni od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Poliviniliden difluorid(PVDF) membrane su nabavljene od Millipore Corporation (Bedford, MA, SAD). Sterilnoplastično posuđe za kulture tkiva kupljeno je od SPL Labware (Seul, Koreja). Izvor UV svjetlosti je obezbjeđena od serije Crosslinker 800 (UVP, Kalifornija, SAD) 6 lampa (8 vati/lampa). Tankoslojna hromatografija i silika gel 60 (mesh 230–400) izvedeni su na silika geluF{{27} }premazane ploče iz Merck Millipore (Darmstadt, Njemačka). NMR spektri su snimljeni pomoću instrumenata Varian Unity INOVA 400 (400 MHz za 1H, 100 MHz za 13C) i Varian Unity AS 500 (500 MHz za 1H). Vrijednosti hemijskog pomaka (δ) su prijavljene u odnosu na odgovarajuće rezidualne otapala ili deuterirane pikove (δH 2,50 i δC 39,51 za DMSO). Podaci masene spektrometrije niske rezolucije su dobijeni pomoću Expression CMS masenog spektrometra (Advion, Ithaca, NY, USA).

3.2. Test inhibicije tirozinaze gljiva

Inhibicijska aktivnost tirozinaze pečuraka određena je korištenjem i L-tirozina i L-DOPA asubstrata, na osnovu postupka koji su opisali Jung et al. [23]. Ukratko, dodano je 190 μL enzima tirozinaze (1000 U razrijeđeno puferom tirozinaze gljiva, uključujući 1 mM L-tirozina i L-DOPA otopine) u prisustvu ili odsustvu jedinjenja (konačna koncentracija u rasponu od 1 do 20 μM, otopljenih u 100 posto DMSO), u svaku jažicu ploče 96-jažice, kako bi se osigurala konačna zapremina od 200 μL. Ploča je inkubirana na 37 ◦C 30 min. Aktivnost tirozinaze je kvantificirana mjerenjem apsorbancije na 492 nm pomoću čitača mikroploča (TECAN, Salzburg, Austrija), a postotak inhibicije (procenti) je dobijen iz sljedeće jednačine:

postotak inhibicije=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

gdje je Ac apsorbanca kontrole, a As je apsorbanca uzorka. Vrijednosti IC50 su izračunate iz log-linearnih krivulja i njihovih jednadžbi. Prikazani su prosječni rezultati za tri određivanja. Kao pozitivna kontrola korištena je Kojična kiselina.

3.3. Kinetička analiza inhibicije tirozinaze

Za određivanje kinetičkih mehanizama komplementarno su korištene dvije kinetičke metode (Lineweaver–Burk i Dixon plotovi) [21,22,33]. Za Lineweaver-Burk dvostruke recipročne grafike (grafikon 1/brzine enzima (1/V) naspram 1/koncentracije supstrata (1/[S])), tip inhibicije je određen korištenjem različitih koncentracija L-tirozina (1, 2, i 4 mM) i L-DOPA (0.5, 1 i 2 mM) kao supstrati u prisustvu različitih koncentracija BHCP. Koncentracije BHCP-a su bile sljedeće: 0, 0.5, 1.{{20}} i 2.0 μM za L-tirozin; i 0, 2.5, 5 i 10 μM za L-DOPA. Dixonova grafika je grafička metoda (grafikon brzine 1/enzima (1/V) u odnosu na koncentraciju inhibitora (I)) za određivanje vrste inhibicije enzima i korištena je za određivanje konstante disocijacije ili Ki za kompleks enzim-inhibitor. Dixonovi dijagrami (pojedinačni recipročni dijagrami) inhibicije su dobijeni u prisustvu L-tirozinskog supstrata pri 1, 2 i 4 mM i {{40}}, 0.5, 1.{101} {47}} i 2.0 μM za BHCP; i L-DOPAsubstrat na {{50}}.5, 1.0 i 2.0 mM i 0, 2.5, 5.0 i 10.0 μM za BHCP.

cistanche plantje inhibitor tirozinaze.

3.4. Ćelijske linije i ćelijska kultura

Mišje ćelije melanoma B16F10 su dobijene iz Korean Cell Line Bank. Ćelijska linija fibroblasta ljudske kože Hs27 kupljena je od Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD). Ove ćelije su održavane u DMEM-u sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg mesa, 100 U/mL penicilina i 100 mg/mL streptomicina u vlažnom 5% CO2 inkubatoratu na 37 ◦C. Dermalni fibroblasti na posudi od 100 mm tretirani su BHCP-om i izloženi 50 mJ/cm2UV u DMEM-u bez seruma (UV light source, UVP). Hs27 ćelije su kultivisane do 70-80 posto konfluencije u ploči prečnika 100 mm i korišćene su između pasaža broj 5 i 15.

3.5. Test vitalnosti ćelija

Vijabilnost ćelija je procenjena korišćenjem EZ-Cytox kita testa. Ukratko, B16F10 ćelije i Hs27fibroblasti su posađeni u 96-ploču sa gustinom od 1 × 104 ćelija/jažici i inkubirani na 37 ◦C tokom 24 h. Ćelije su hranjene svježim DMEM-om bez seruma koji je sadržavao različite koncentracije (0, 1, 2, 5 i 10 μM) BHCP-a i inkubirane 24 i 48 h. Nakon toga, 10 μL EZ-Cytox rastvora je stavljeno u svaku jažicu i ćelije su inkubirane 2-4 h. Mjerenje apsorpcije ćelija u odsustvu bilo kakvog tretmana smatralo se 100 postotnim preživljavanjem ćelija. Svaki tretman je izveden tri puta i svaki eksperiment je ponovljen tri puta.

3.6. Određivanje sadržaja melanina

Učinak BHCP-a na -MSH-indukovanu melanogenezu u B16F10 ćelijama baziran je na prethodno korištenoj metodi sa malim modifikacijama [34]. Ukratko, ćelije B16F10 (5 × 104 ćelije/bunariću) u 6-pločama su ostavljene da narastu do 70-80 posto konfluencije. Ćelije su zatim tretirane različitim koncentracijama BHCP (1, 5 i 10 μM) ili kojične kiseline (5 mM) tokom 24 h, a zatim stimulisane sa -MSH (5 μM) tokom 48 h. Nakon tretmana, ćelije su dva puta isprane ledeno hladnim PBS, rastvorene u 90 μL 1 M rastvora NaOH uključujući DMSO (5 procenata) na 60 ◦C tokom 1 h, a apsorbancija je izmerena na 405 nm spektrofotometrom za mikroploče (TECAN, Salzburg). , Austrija). Za mjerenje količine melanina u eksperimentu, stopa inhibicije u tretiranim grupama izračunata je iz apsorbancije poznatih koncentracija sintetičkog melanina, koje su korigirane na ukupnu količinu proteina koja je bila prisutna u supernatantu ćelijskih lizata. Apsorbancija netretiranih ćelija mjerena je u tri primjerka.

3.7. Test aktivnosti stanične tirozinaze

Ispitivanje aktivnosti stanične tirozinaze izvedeno je mjerenjem brzine oksidacije L-DOPA [35]. B16F10 ćelije sa gustinom od 5 × 104/ćelija stavljene su u 6-jačice i inkubirane preko noći. Ćelije su zatim tretirane različitim koncentracijama BHCP (1, 5 i 10 μM) ili kojične kiseline (5 mM) tokom 24 h, a zatim stimulirane sa -MSH (5 μM) 48 h. Ćelije su isprane sa PBS i lizirane u rastvoru koji sadrži 100 μL 50 mM fosfatnog pufera (pH 6,5), 0,1 mMfenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) i 1 procenat Tritona X-100. Zatim su ćelije stavljene u mašinu za duboko zamrzavanje (-80 ◦C) na 30 min. Nakon odmrzavanja ćelija, ćelijski ekstrakti su prečišćeni centrifugiranjem na 12,000 rpm tokom 30 minuta na 4 ◦C. Ukupno 80 μL supernatanta i 20 μL L-DOPA (2 mg/mL) je dodato na ploču sa 96-jažicom, a apsorbancija na talasnoj dužini od 492 nm je mjerena svakih 10 minuta tokom 1 h na 37 ◦ C sa ELISA čitačem ploča (TECAN, Salzburg, Austrija).

3.8. Priprema citosolnih i nuklearnih ekstrakata Hs27 ćelija

Hs27 ćelije su isprane ledeno hladnim PBS-om i sakupljene. Za ekstrakciju citosolnih frakcija korišten je pufer koji sadrži 10 mM Tris (pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 posto NP-40 i inhibitore proteaze. centrifugiranje na 12,000 rpm na 4 ◦C tokom 15 minuta, a nuklearne frakcije su ekstrahovane iz peleta pomoću pufera koji sadrži 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl i inhibitore proteaze, za inkubiranje na 30 min. a zatim centrifugiran na 13,000× g tokom 30 minuta na 4 ◦C da bi se dobile nuklearne frakcije.

3.9. Western blotting

Uzorci lizata su kuhani 10 min u puferu za punjenje gela (125 mM Tris-HCl, 4 posto natrijumdodecil sulfata (SDS), 10 posto 2-merkaptoetanola i 0,2 posto bromofenola plava; pH 6,8) u zapreminskom odnosu 1:1. Ukupni proteinski ekvivalenti za svaki uzorak razdvojeni su SDS-poliakrilamidnom gelelektroforezom (PAGE) korištenjem akrilamidnih gelova prema proceduri koju je opisao Laemmli [36] i prebačeni na PVDF membrane na 80 V tokom 2 h korištenjem mokrog transfer sistema. Membrane su odmah stavljene u pufer za blokiranje (5 posto nemasnog mlijeka) u 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl i 0,1 posto Tween-20. Mrlje su blokirane kako bi se spriječilo nespecifično vezivanje na 25 ◦C tokom 2 h. Nakon toga, membrane su inkubirane sa specifičnim primarnim antitelom na 4 ◦C preko noći, nakon čega je usledila inkubacija sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa peroksidazom hrena na 25 1◦C . Obilježavanje antitijela je detektovano pojačanom hemiluminiscencijom u skladu s uputama proizvođača. Kvantifikacija proteina je izvršena pomoću Davinch-Chemi TM. Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea). Za određivanje molekulske težine korišteni su prethodno obojeni proteinski markeri.

3.10. Statistička analiza

Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) za razlike između tretmana praćeno Bonferronijevim post-hoc testom. Vrijednost p < 0.05="" smatrana="" je="" statistički="">

4. Zaključak

Ukratko, nalazi ove studije su pokazali da BHCP ima efekat izbjeljivanja kože putem inhibicije tirozinaze, koja je ključni enzim za biosintezu melanina u -MSH-induciranim B16F10melanocitima. Nadalje, BHCP je smanjio ekspresiju nivoa MMP proteina u UV-indukovanim fibroblastima, za koje se očekuje da će imati efekat protiv bora. Potrebna su dalja istraživanja kako bi se potvrdili efekti BHCP-a izbjeljivanja i protiv bora putem životinjskih i kliničkih studija. Konačno, utvrđeno je da BHCP ima efekte izbjeljivanja i protiv bora, što ukazuje na njegov potencijal za razvoj terapeutskih sredstava za bolesti povezane s hiperpigmentacijom i borama.

šta je cistanche

Za više informacija kliknite ovdje.