Anti-melanogeneza i anti-tirozinazna svojstva Pistacia atlantica subsp. mutica ekstrakti na B16F10 ćelijama mišjeg melanoma

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Samira Eghbali-Feriz1, Akram Taleghani2, Hadi Al-Najjar3, Seyed Ahmad Emami1, Homa Rahimi4, Javad Asili1, Samira Hasanzadeh1 i Zahra Tayarani-Najaran5,*

sažetak:Pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. mutica se koristi u tradicionalnoj medicini i poznata je po svojim ljekovitim svojstvima. Cilj ovog istraživanja bio je procijeniti djelovanje metanola (MeOH), n-heksana, dihlorometana (CH2Cl2), n-butanola (BuOH), etil acetata (EtOAc), vodenih ekstrakata i eteričnog ulja P. atlantica subsp. mutica na sintezu melanina i oksidativni stres u ćelijskoj liniji melanoma B16F10. Vijabilnost ćelija B16F10 nakon tretmana sa rastućim koncentracijama različitih ekstrakata biljke (0.2-200 µg/mL) mjerena je primjenom resazurina. Sastav esencijalnog ulja identifikovan je analizom gasnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (GC-MS) i inhibitornim dejstvom na sintezu melanina, gljivatirozinazaaktivnost, ćelijska tirozinaza i oksidativni stres procenjeni su kolorimetrijskim i fluorometrijskim metodama. Podaci su pokazali da ekstrakti u koncentracijama 0.2-200 µg/mL nisu pokazali značajnu toksičnost na ćelije melanoma, ali koncentracije od 200 µg/mL eteričnog ulja su imale citotoksično djelovanje. Pistacia atlantica subsp. mutica može inhibirati gljivutirozinazaaktivnost. Takođe, količina melanina u B16F10 ćelijama je opala. Osim toga, sposobnost P. atlantica subsp. Mutica ekstrakti u smanjenju količine reaktivnih vrsta kisika u stanicama melanoma otkrili su izvanredneantioksidansaktivnost. Osim toga, sve koncentracije eteričnog ulja nisu imale značajan učinak u ovoj studiji. Themelanogenezainhibitorno iantioksidansefekti P. atlantica subsp. mutica na B16F10 stanicama može sugerirati potencijalnu aktivnost izbjeljivanja biljke za upotrebu u dermatološkim proizvodima za njegu kože i za prevenciju starenja kože u kozmetičkoj industriji.Ključne riječi:anti-tirozinaza; Melanogeneza; P. atlantica subsp. mutica.

Kliknite zacistanche prednosti za antioksidans

UVOD

Melanin je pigment kože koji se sintetizira u melanosomima i prenosi do keratinocita kroz fiziološki proces tzv.melanogeneza. Melanin igra važnu ulogu u zaštiti od UV oštećenja i određuje boju kože, kose i očiju. Prekomjerna proizvodnja melanina se pripisuje melanomu i abnormalnoj pigmentaciji kože (1-3). Ključni enzim u biosintezi melanina je tirozinaza koja katalizuje dvije odvojene reakcije, oksidaciju 3,4-dihidroksi-fenilalanina (DOPA) u dopakinon i hidroksilaciju L-tirozina u DOPA (4).tirozinazaili polifenol oksidaza je enzim mješovite funkcije koji sadrži bakar koji se nalazi u mikroorganizmima, životinjama i biljkama (5). Tirozinaza je faktor koji najviše utiče na porumenelost voća i povrća. Prekomjerna proizvodnja i nakupljanje melanina može dovesti do velikog broja kožnih poremećaja uključujući melazmu, pjege, solarnu melanozu i staračke pjege (6). stoga,tirozinazainhibitori su privukli veliko interesovanje u prehrambenoj i kozmetičkoj industriji. U mnogim živim organizmima, oksidacija je neophodna za proizvodnju energije koja pokreće biološke procese.

Međutim, vodikov peroksid (H2O2) i druge -reaktivne vrste kiseonika (ROS)- uzrokuju smrt ćelija i oštećenje tkiva u mnogim fiziološkim i patološkim fenomenima uključujući povećanje ROS nakon UV zračenja tokom procesa melanogeneze. Takođe, dobro je poznato da je proizvodnja ROS izazvana UV zračenjem uključena u patogenezu nekoliko stanja kože uključujući starenje, bore, fotosenzitivnost i malignitet (7). Dakle, pronalaženje prirodnih izvoraantioksidansisa anti-tirozinazaaktivnost pomaže da se modificiraju oštećenja kože povezana s prekomjernom količinommelanogeneza (4).

Rod Pistacia je član porodice Anacardiaceae koju čini oko 9 vrsta i uglavnom je rasprostranjen u mediteranskom regionu, Evropi i nekim dijelovima Azije (8,9). Pistacia atlantica (P. atlantica)Desf. ima 3 podvrste i to: P. atlanticasubsp. kurdica (Zohary) Reč. f., P. atlanticasubsp. mutica (Fischer & CA Meyer) Rech. f. i P. atlantica subsp. cabulica (Akcije) Rech. f. Tri navedene podvrste P. atlantica, P. khinjuk Stocks i P. vera L. uzgajaju se u Iranu (10). Plodovi P. atlanticasubsp. mutica odnosno Baneh je okrugla do ovalna sa 0.5-0.7 cm u prečniku. Antioksidativno i antikancerogeno djelovanje ljuske P. atlantica povezano je s visokim ukupnim sadržajem fenola u biljci. P. atlantica se tradicionalno koristi za ublažavanje tegoba i bolova u gornjem dijelu abdomena, dispepsije i peptičkog ulkusa (11-13). Međutim, ne postoje studije o inhibitornoj aktivnosti melanogeneze P. atlantica subsp. mutica. Dakle, u ovom projektu biramo ćelije melanoma B16F10 za proučavanje antioksidativnih i antimelanogenih svojstava P. atlantica subsp. mutica ekstrakti. Cilj ovog istraživanja bio je istražiti inhibitorni učinak metanola (MeOH), n-heksana, dihlorometana (CH2Cl2), n-butanola (BuOH), etil acetata (EtOAc), vodenih (H2O) ekstrakata i eteričnog ulja P. atlanticasubsp. mutica voće namelanogenezai procijeniti potencijalantioksidanskapacitet postrojenja na B16F10 ćelijama melanoma.

MATERIJALI I METODE

Hemikalije

Mushroomtirozinazaiz Agaricus bisporus, kojic kiselina, resazurin, L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dikloro dihidro-fluorescein diacetat (DCFH-DA), egtazinska kiselina (EGTA), dimetil sulfoksid (DMSO ), fenilmetilsulfonil fluorid, glicerofosfat, -merkaptoetanol, fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS), natrijum ortovanadat, tris-puferisan fiziološki rastvor tween 20 (TBST) kupljen od Sigme (SAD). Fetalni goveđi serum (FBS), penicilin, streptomicin i tripsin-EDTA dobijeni su od GibcoBRL (Grand Island, SAD). Ćelijska linija melanoma (B16F10, kat. br. C540) kupljena je od Pasteurovog instituta Iran (Teheran, IR Iran). Sve ostale hemikalije i rastvarači su iz Mercka (Nemačka).

Priprema ekstrakta

P. atlantica subsp. mutica je prikupljena u maju 2014. sa planine Bardaskan, provincija Horasan Razavi, sjeveroistočno od Irana, a identificirala ga je gospođa M. Souzani. Uzorak vaučera (br. 13069) deponovan je u herbarijum Farmaceutskog fakulteta Univerziteta medicinskih nauka u Mashadu, Mashhad, IR Iran. Nezreli plodovi P. atlantica subsp. mutica (200 g) mljeveni su blenderom (Toos chekan Co, IR Iran) i zatim perkolirani sa MeOH na sobnoj temperaturi 24 h prema ranije objavljenom protokolu (14). Nakon ekstrakcije, rastvarač je uparen pomoću rotacionog isparivača i zatim osušen zamrzavanjem. Ekstrakt metanola (94 g) je dalje frakcioniran podjelom rastvarač-rastvarač da bi se dobilo pet različitih frakcija uključujući MeOH, n-heksan, CH2Cl2, BuOH, EtOAc i H2O.

Izolacija eteričnog ulja

Nezreli plod P. atlantica subsp.mutica (150 g) je podvrgnut hidrodestilaciji pomoću aparata tipa Clevenger u trajanju od 3 h. Bezbojno ulje je dobijeno s prinosom od 0,8 posto (v/w). Dobijeno eterično ulje je osušeno preko bezvodnog natrijum sulfata i čuvano na 4 stepena u mraku do daljeg ispitivanja.

Gasna hromatografija i gasna hromatografija-masena spektrometrija

Analiza plinskom hromatografijom (GC) izvedena je korištenjem Varian CP{{0}} opremljenog FID detektorom, koji je povezan sa kolonom fuzioniranog silicijevog dioksida (CP-Sil 8CB, 50 m × 0,25 mm, debljina filma 0,12 µm) pod sljedećim uslovima: temperatura pećnice 50-250 stepen sa brzinom od 3 stepena/min; temperatura injektora 260 stepeni, odnos podele 1:5, sa gasom nosačem, brzina protoka N2 2 mL/min; temperatura detektora 280 stepeni.

Analiza gasne hromatografije mase (GC-MS) obavljena je korišćenjem Agilent 5975 aparata opremljenog HP-5 MS kolonom (30 m × 0.25 mm id, {{ 14}}.25 µm debljine filma) povezan sa četvorostrukim detektorom mase i kompjuterom opremljenim Wiley 7n.L bibliotekom. Temperatura pećnice 50-250 stepen sa brzinom od 3 stepena/min, temperatura injektora 250 stepeni, zapremina ubrizgavanja: 0,1 µL, podeljeno ubrizgavanje sa omjerom podele 1:50, sa protokom gasa nosača (helijum) 1 mL/ min, jonski izvor: 70 eV, jonizaciona struja: 150 µA, i opseg skeniranja: 35-465. Identifikacija komponenti eteričnog ulja zasnovana je na retencijskoj plinskoj hromatografiji dobijenoj u odnosu na seriju n-alkana (C6-C20) na HP-5MS koloni, poređenje njihovih masenih spektra i obrazaca fragmentacije. u literaturi i kompjutersko usklađivanje sa bibliotekom Wiley 7n.L (15). Kvantifikacija relativne količine pojedinačnih komponenti nezrelog voća izvršena je metodom procenta površine bez uzimanja u obzir faktora kalibracije.

Ćelijska kultura

Ćelijska linija melanoma, B16F10, održavana na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi (90 procenata) koja sadrži 5 procenata CO2. Ćelije su uzgajane u RPMI-1640 (Bioidea, Iran) sa 10 posto (v/v) FBS, 100 IU/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina. Osnovni rastvor P. atlantica subsp. mutica je pripremljena na 50 µg/mL u DMSO i držana na -40 stepenu. Kojična kiselina (2 i 4 mM) korišćena je kao pozitivna kontrola u svim eksperimentima. Ćelije su uzgajane u 96-pločama u gustini od 105 ćelija/mL. Aktivnost ekstrakta u svakom eksperimentu izračunata je pomoću sljedeće jednačine:

΁postotak aktivnosti=Apsorbancija uzorka/Apsorbancija kontrole*100

Test vitalnosti ćelija

Resazurin je indikator zdravlja ćelija koji koristi redukcijsku moć živih ćelija i pretvara se u resorufin. Resazurin je plavo, netoksično, nefluorescentno i ćelijsko propusno jedinjenje koje se pretvara u crvenu boju i visoko fluorescentno resorufin u živim ćelijama (16). Oko 104 B16F10 ćelije melanoma zasijane su u svaku jažicu 96-mikrojažice ploče i tretirane različitim koncentracijama ekstrakata i eteričnog ulja P. atlantica subsp. mutica (0.2-200 µg/mL). Nakon 4 h inkubacije, mjerena je apsorbancija resazurina i resorufina na 570 nm i 600 nm pomoću H4 Hybrid Multi-Mode čitača mikroploča (BioTek, Winooski, SAD). Svaki eksperiment je urađen u tri primjerka. Polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) je izračunata pomoću GraphPad softvera iz krivulje koncentracija-efekat: log koncentracija naspram odgovora.

Test aktivnosti tirozinaze gljiva

Aktivnost gljivatirozinazau oksidaciji L-DOPA izmjeren je spektrofotometrijski kao što je prethodno opisano (17), uz neke modifikacije. Ukratko, 160 µL 5 mM L-DOPA (u 100 mM natrijum-fosfatnog pufera pH 6,8) i 20 µL istog pufera sa i bez P. atlanticasubsp. ekstrakti mutica i eterično ulje (10-1000 µg/mL) pomiješani su sa 20 µL tirozinaze pečuraka (200 jedinica/mL) i zatim inkubirani na 37 stepeni 30 minuta. Apsorbancija je izmjerena na 475 nm sa Synergy H4 Hybrid Multi-Mode čitačem mikroploča (BioTek, Winooski, SAD).

Određivanje sadržaja melanina u stanicama melanoma

Ćelije melanoma, B16F10, zasijane su u gustini od 105 ćelija po jažici u ploče za kulturu 96-jažica i inkubirane 24 h. Zatim su inkubirani sa različitim koncentracijama (0.2-200 µg/mL) P. atlantica subsp. mutica ekstrakti i eterično ulje 24 h. Sadržaj melanina je mjeren kao što je prethodno opisano (18). Nakon tretmana, ćelije su sakupljene pomoću tripsina. Oprane su sa PBS. Ćelijske pelete su rastvorene u 50 µL rastvora natrijum hidroksida (2 M) tokom 60 minuta na 60 stepeni. Sadržaj melanina mjeren je mjerenjem apsorbancije na 405 nm sa Synergy H4 Hybrid Multi-Mode čitačem mikroploča (BioTek, Winooski, SAD).

Test aktivnosti stanične tirozinaze

Oksidacija DOPA u DOPA hrom analizirana je spektrofotometrijom kao indikatoromtirozinazaaktivnost (18). 106 ćelija B16F10 melanoma je postavljeno u svaku jažicu 96-ploče sa bunarima preko noći. Nakon tretiranja ćelije različitim koncentracijama (0.2-200 µg/mL) P. atlantica subsp. mutica ekstrakti i eterično ulje tokom 24 h. Ćelije su odvojene upotrebom tripsina; isprano sa PBS i lizirano sa 50 µL natrijum fosfatnog pufera (pH 6,8, 100 mM) koji sadrži 1 posto tritona X-100 i 0,1 mM fenilmetilsulfonil fluorida. Lizati su centrifugirani na 10,{17}} rpm tokom 20 minuta na 4 stepena. 100 µL svakog lizata (svaki sadrži 100 mg proteina) pomiješano je sa 30 µL 5 mM DOPA u ploči s 96 jažica i inkubirano na 37 stepeni 2 h, apsorbancija je izmjerena na 475 nm sa Synergy H4 Hybrid Multi-Mode mikropločom za čitanje (BioTek, Winooski, SAD).

Određivanje nivoa ćelijskih reaktivnih vrsta kiseonika

Nivo reaktivnih vrsta kiseonika je meren kao što je prethodno opisano uz manje modifikacije (19). Ćelije melanoma, B16F10, (2 × 104) su zasijane u 96-jažice preko noći, a zatim su tretirane različitim koncentracijama (0.2-200 µg/mL) P. atlantica subsp . mutica ekstrakti i eterično ulje 24 h. Zatim su ćelije inkubirane sa 50 µL H2O2 (24 mM) na 37 stepeni tokom 30 minuta. Zatim je ćelijama dodato 50 µL DCFH-DA i mjeren je intenzitet fluorescencije DCF-a pri emisiji od 504 nm i ekscitaciji od 524 nm pomoću čitača mikroploča Synergy H4 (BioTek, SAD).

Western blotting analiza

Ćelije melanoma, B16F10, uzgajane su u tikvicama od 75 cm3 sa i bez metanolnog ekstrakta (0.5-100 µg/mL) tokom 24 h. Ćelije su zatim lizirane u puferu (50 mM tris-HCl, pH 7,4, 2 mM EGTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 10 mM glicerofosfata, 10 mM -merkaptoetanola, 1 mM-merkaptoetanola, 1 mM dezoksinadna kiselina, 1 mM 0 procentualne kiseline. natrijumova so). Jednaka količina proteina (50 µg) stavljena je na elektroforezu 12 posto natrijum dodecil sulfata (SDS)-poliakrilamidnog gela i prebačena na poliviniliden difluoridne membrane. Membrane su blokirane 2 h u 10 posto obranog mlijeka u TBST (20 mM tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl i 0,1 posto tween 20) puferu na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja TBST puferom, membrana je zatim inkubirana preko noći sa primarnim antitelom: 1:300 (zečji anti-tirozinazaantitijela (Santa Cruz Biotechnology, CA)). Nakon 3 puta ispiranja sa TBST puferom, membrane su zatim inkubirane 2 h sa anti-zečjim IgG (1:2000) kao sekundarnim antitelom (ćelijska signalizacija). Ispiranje 3 puta sa TBST puferom je ponovljeno i proteinske trake su detektovane korišćenjem poboljšanog hemiluminiscentnog (ECL) prime western blotting sistema (BioRaD, SAD) (20). Anti- -antitijelo je korišteno kao kontrola opterećenja.

Statistička analiza

Relativni rezultati eksperimenata predstavljeni su kao srednja vrijednost ± SD tri nezavisna mjerenja. Analiza varijanse i proračun IC50 izvršeni su sa GraphPad Prism 6.0 korištenjem jednosmjernog ANOVA testa, a srednje vrijednosti su upoređene Dunnett testovima. P < 0,05="" predstavlja="" statistički="" značajnu="" razliku="" između="" ćelija="" tretiranih="" ekstraktom="" i="" kontrole.="" dvosmjerni="" anova="" test="" i="" bonferroni="" poređenje="" nakon="" testa="" korišteni="" su="" za="" poređenje="" učinka="" različitih="" ekstrakata="" u="" svakom="">

REZULTATI

Sastav esencijalnog ulja

Plinska hromatografija je korištena za kvantifikaciju, a Gc-masa za identifikaciju jedinjenja. Rezultati GC i GC-MS analize prikazani su u kvantitativnoj i kvalitativnoj identifikacionoj tabeli jedinjenja. U slučaju P. atlanticasubsp. mutica, u eteričnom ulju identifikovano je 68 sastojaka koji su činili 99,8 posto ukupnog sastava ulja (tablica 1). Grupirana jedinjenja eteričnog ulja određena su kao monoterpenski ugljovodonici 86.5 posto, oksigenirani monoterpeni 3.7 posto, seskviterpenski ugljovodonici 8.7 posto, oksigenirani seskviterpeni 0.1 posto, i razni 0 .8 posto. Glavne komponente eteričnog ulja bile su -E-ocimen 29,7 posto, mircen 17,1 posto, -Z-ocimene 17.0 posto, -pinen 10,2 posto i E-caryophyllene 7,1 posto.

Utjecaj ekstrakata na preživljavanje stanica

Vijabilnost ćelija je praćena resazurinom. Ćelije melanoma, B16F10, zasijane su u 96-ploču sa jažicom. Nakon 24 h ćelije su tretirane različitim koncentracijama (0.2-200 µg/mL) P. atlantica subsp. mutica, rezultati su pokazali da ekstrakti nemaju značajan citotoksični učinak na B16F10 ćelije u koncentracijama korištenim u ovoj studiji (slika 1). Doksorubicin je kao pozitivna kontrola značajno inducirao ćelijsku smrt (P <>

Utjecaj ekstrakata na aktivnost tirozinaze gljiva

Procijenjen je učinak P. atlantica na inhibiciju tirozinaze gljive u oksidaciji L-DOPA. Rezultati su ukazali na tu gljivutirozinazaaktivnost je inhibirana od strane svih različitih ekstrakata, ali koncentracija od 1000 µg/mL ekstrakta n-heksana nije imala značajan uticaj u ovom testu. Koična kiselina (2 i 4 mM) korišćena je kao pozitivna kontrola (P < 0,05)="" (sl.="">

Utjecaj ekstrakata i eteričnog ulja na sintezu melanina

Za proučavanje djelovanja različitih ekstrakata i eteričnog ulja P. atlantica subsp. mutica na sintezu melanina, procijenjen je sadržaj melanina u ćelijama melanoma B16F10 tretiranih ekstraktom. Koična kiselina (2 i 4 mM) korišćena je kao pozitivna kontrola.

Rezultati su pokazali da ekstrakti MeOH, CH2Cl2 i EtOAc (0.2-200 µg/mL), n-heksan (2-200 µg/mL) i H2O ekstrakt (2{{9 }} i 200 µg/mL) imale su inhibitorni efekat na sintezu melanina (P < 0,05)="" (slika="" 3).="" međutim,="" sve="" koncentracije="" eteričnog="" ulja="" i="" ekstrakta="" buoh="" nisu="" imale="" značajan="" inhibitorni="" učinak="" na="" sintezu="" melanina.="" rezultati="" eteričnog="" ulja="" nisu="" prikazani="" na="">

Utjecaj ekstrakata na aktivnost ćelijske tirozinaze

Za procjenu mehanizma inhibitornog djelovanja P. atlantica subsp. mutica ekstrakt onmelanogenezaposebno smo procijenili intracelularnotirozinazaaktivnost u ćelijama melanoma B16F10. Rezultati su pokazali da ekstrakti MeOH, EtOAc i BuOH (0.2-200 µg/mL), n-heksan (0.2 µg/mL) i CH2Cl2 (20 i 200 µg/mL) ekstrakti P. atlantica subsp. mutica može značajno inhibirati aktivnost ćelijske tirozinaze (P < 0,05)="" (slika="" 4),="" ali="" vodeni="" ekstrakt="" nije="" imao="" inhibitorni="" efekat="" na="" aktivnost="" ćelijske="">

Utjecaj ekstrakata na nivo ćelijskih reaktivnih vrsta kiseonika

Intracelularni nivo ROS kao pokazateljantioksidansKapacitet P. atlantica subsp.mutica mjeren je u ćelijama tretiranim samo sa 24 mM H2O2 ili različitim ekstraktima u ćelijama melanoma B16F10. Rezultati su pokazali da su koncentracije svih ekstrakata P. atlanticasubsp. mutica osim 0.2 µg/mL ekstrakta CH2Cl2 može značajno potisnuti oksidativni stres izazvan H2O2 (P < 0,05)="" (slika="">

Utjecaj ekstrakata na nivo proteina ćelijske tirozinaze

Intracelularni efekat P. atlanticasubsp. mutica na melanogenim srodnim proteinima kao što je tirozinaza kao indikatormelanogenezaprocijenjen je Western blot-om. Kao što je prikazano na slici 6,tirozinazanivoi proteina su značajno smanjeni kod P. atlantica subsp. tretman ekstraktom mutica u koncentraciji {{0}}.5 i 10 µg/mL (P < 0.05).="" -aktin="" je="" korišten="" kao="" interna="">

Utjecaj eteričnog ulja na različite parametre

Eterično ulje na 0.2-200 µg/mL nije pokazalo značajan uticaj na sve gore navedene parametre, osim u koncentraciji od 200 µg/mL, koja je pokazala citotoksično djelovanje na ćelije melanoma. Stoga, rezultati eteričnog ulja nisu uključeni u odjeljak s rezultatima jer nisu uočeni inhibitorni efekti.

DISKUSIJA

Kozmetičke proizvode na prirodnoj bazi komercijalne agencije naširoko reklamiraju zbog njihove sigurnosti i višenamjenske aktivnosti. Pronalaženje novih antimelanogenih agenasa saantioksidansaktivnost iz prirodnih izvora jedno je od interesa u formulaciji proizvoda koji se koriste za poremećaje hiperpigmentacije. U medicinskim i kozmetičkim proizvodima koji se koriste kao sredstva za izbjeljivanje kože, inhibicija stvaranja melanina, uklanjanje slobodnih radikala i inhibicijatirozinazaaktivnost koja je važna za liječenje povezanih kožnih poremećaja (21).

U ovom istraživanju antioksidativno djelovanje različitih ekstrakata P. atlantica subsp. mutica i analizirani su njihovi efekti na aktivnost tirozinaze i sintezu melanina. MeOH i EtOAc ekstrakti P. atlantica subsp. mutica pokazala značajnuantioksidansaktivnost na 2,20 µg/mL i 20,200 µg/mL što se može pripisati polifenolima i flavonoidima koji se široko nalaze u biljci. Rezultati su pokazali da svi ekstrakti posebno MeOH, EtOAc i H2O mogu značajno inhibirati gljive.tirozinazaaktivnost. Takođe, ekstrakti MeOH, EtOAc i BuOH su bili u stanju da smanje staničnu aktivnost tirozanaze koja je bila u skladu sa smanjenjem proizvodnje melanina u ćelijama. U ovoj studiji, sve koncentracije eteričnog ulja nisu imale značajan inhibitorni učinak na ćelijsku tiroziju, sintezu melanina iantioksidansaktivnost. Zbog veće aktivnosti MeOH ekstrakta u različitim eksperimentima u odnosu na druge ekstrakte odabrali smo navedeni ekstrakt za Western blot analizu. Ukratko, antimelanogeni efekat ovog ekstrakta je potvrđen u svim testovima na B16F10 ćelijama, uporediv sa pozitivnom kontrolom kojične kiseline (Tabela 2).

Ekstrakti MeOH, CH2Cl2 i EtOAc su smanjili ćelijutirozinazaaktivnost, sadržaj melanina i ROS. Polupolarne prirodne frakcije mogu ekstrahovati fitokemikalije koje su odgovorne za antimelanogenu aktivnost kao što su polifenoli i flavonoidi. Frakcija n-heksana i eterično ulje bili su manje aktivni što ukazuje da biljne fitokemikalije nepolarne i hlapljive prirode nemaju značajan utjecaj namelanogenezaproces (22,23).

Polifenoli i flavonoidi djeluju kao inhibitori proizvodnje ROS-a i mogu biti odgovorni za antimelanogena svojstva biljnih ekstrakata (24-27). Glavna jedinjenja u ekstraktu P. atlantica subsp. mutica su kvercetin, luteolin, izokvercetin, rutin, luteolin 7-laktat i fenolna jedinjenja kao što su p-kumarinska kiselina, kafeinska kiselina i galna kiselina koja su odgovorna zaantioksidansaktivnost (28). Prijavljeno je da rutin inhibira aktivnost tirozinaze i da je moćno sredstvo protiv pigmenta zbog prisustva hidroksilnih grupa (29). Zanimljivo je da kvercetin, luteolin i izokvercetin takođe imaju mnogo hidroksilnih grupa u svojoj strukturi što ih čini pogodnim za interakciju sa tirozinazom što rezultira anti-tirozinaznom aktivnošću (21,30). Nedavno je pokazano da su efekti flavonoida poput luteolina i kvercetina uglavnom posredovani modulacijom transkripcijskog faktoramelanogeneza-povezani transkripcijski faktor (MITF) i/ili enzimi melanogenezetirozinaza, DCT ili protein 1 povezan sa tirozinazom (TYRP-1) (31). P-kumarinska kiselina i kafeinska kiselina inhibiraju aktivnost tirozinaze pečuraka i bile su 10- i 3- puta snažnije od kojične kiseline (32).

Galna kiselina pokazuje inhibitornu aktivnost tirozinaze i redukuje dopakinon nazad u L-DOPA kroz redoks ciklus, slično kao askorbinska kiselina (33). Slično, u ovoj studiji P. atlantica subsp. mutica je smanjio nivo proteina tirozinaze u ćelijama što je u snažnoj korelaciji sa prisustvom kvercetina, luteolina, izokvercetina, rutina i drugih polifenola u biljci.

Postoje brojni izvještaji o biljkama koje imaju antimelanogenu i antioksidativnu aktivnost koja smanjuje oksidativni stres, što može imati veliki potencijal za liječenje kožnih poremećaja. Na primjer, različiti ekstrakti nadzemnih dijelova P. atlantica smanjili su oksidativni stres, što se može pripisati polifenolima, flavonoidima i antocijaninu koji se široko nalaze u biljci (34). U drugoj studiji, MeOH ekstrakt P. vera je smanjio lučenje melanina što se nekima pripisujeantioksidansjedinjenja u ovoj biljci. Ova studija je pokazala da je kojična kiselina, kao pozitivna kontrola, pokazala IC50 vrijednost od 0,05 mg/mL i da se veće koncentracije P. vera mogu koristiti kao efikasno sredstvo za liječenje kožnih poremećaja kao što je rak melanoma (35 ). Gourine, et al. pokazala je da nadzemni dijelovi P. atlantica imaju snažna antioksidativna svojstva (36). Također, frakcije MeOH i CH2Cl2 Nepeta satureioide ukazuju na potencijalne efekte protiv proizvodnje melanina u stanicama melanoma B16F10 i mogu doprinijeti kozmetičkim formulacijama proizvoda za njegu kože (37). Derivati ​​kojične kiseline su imali inhibitornu aktivnosttirozinaza. Čini se da prisustvo slobodne hidroksilne grupe i metil supstituta u ovom spoju potvrđuje inhibitornu aktivnost. U ovoj studiji kojična kiselina (pozitivna kontrola) je pokazala IC50vrijednost od 0.28 mM (38). Fenilpropanoidni glikozidi i flavonoidi izolovani iz Teucrium polium L. var. gnaphalodes su pokazali antioksidativno i inhibitorno djelovanje na tirozinazu. Autori su pokazali da je jaranol pokazao najveću inhibitornu aktivnost tirozinaze (IC50 0.041 mM), a poliumozid je bio najbolji antioksidans među ispitivanim jedinjenjima. Kojična kiselina je pokazala IC50 vrijednost od 0,02 mM (39).

Smanjenje nivoa proteinatirozinazaod P. atlantica subsp. mutica andantioksidanssvojstva i smanjeni ROS potvrdili su upotrebu ovog sredstva kao agensa protiv melanogeneze. Ovo istraživanje je po prvi put utvrdilo inhibitorni efekat P. atlanticasubsp. mutica onmelanogenezau ćelijama melanoma B16F10. Kako bi se spriječilo nakupljanje i prekomjerna proizvodnja melanina u koži, inhibicijatirozinazaima važnu ulogu. Stoga, s obzirom na prijavljeni antioksidativni učinak P. atlantica subsp.mutica, flavonoidna i fenolna jedinjenja su važne komponente biljke odgovorne za antimelanogenezu i antitirozinazno djelovanje P. atlantica subsp. mutica. I antioksidativna i antimelanogena aktivnost P. atlantica subsp. mutica može ponuditi odgovarajuće sredstvo za formulacije za izbjeljivanje kože i može se uključiti u kozmetičke proizvode za formulacije za njegu kože.

ZAKLJUČAK

Zaključno, ova studija je po prvi put pokazala da MeOH i EtOAc ekstrakti P. atlantica subsp. mutica ima jakutirozinazainhibitorna aktivnost koja je u skladu sa smanjenjem melanina. Štaviše, P. atlanticasubsp. mutica je također pokazala visoku aktivnost čišćenja iantioksidanssvojstva, koja se uglavnom mogu pripisati visokim nivoima flavonoida i ukupnih polifenola. Rezultati su pokazali da sposobnost P. atlanticasubsp. mutica za smanjenje proizvodnje melanina može biti u korelaciji s iscrpljivanjem ćelijskog ROS-a i njegovim inhibitornim djelovanjem na regulaciju signalnog putatirozinazaaktivnost. Budući da je semipolarni ekstrakt imao značajnu antitirozinazu i anti-melanogenefekte, stoga zaključujemo da su jedinjenja odgovorna za ove efekte akumulirana u ekstraktu, a ne u eteričnim uljima.